Свойства общего для А-субъединиц рицина и вискумина эпитопа Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

1999. Т. 1,№ 3-4

Псшшгинез и диагностика иммунопата.ю.'ычсских состояний

Таблица. ТОКСИНЫ И ИММУН0Т0КСИНЫ. ДОЛЯ КЛЕТОК С ЯВЛЕНИЕМ АП0ПТ03А В ДИНАМИКЕ ИНКУБАЦИИ С ИММУНОТОКСИНАМИ

Время 225MLA 225RTA ML1 R60

8 ч. 2% 2% 30% 30%

12 ч. 5% 5% 50% 40%

14 ч. 30% 10% 80% 50%

16 ч. 40% 15% 85% 60%

24 ч. 60% 17% 100% 70%

тов. В таблице приведены суммированные данные экспериментов, отображающие процентное отношение клеток, содержащих фрагментированную ДИК (апоптозные тельца) к общему количеству клеток. Из таблицы видно, что цельные токсины вызывают фрагме гацию ДНК на более ранних сроках инкубации, что, по-видимому, связано с некоторыми различиями в способах проникновения ИТ и токсинов в цитоплазму клеток.

В дальнейшем планируется подробнее изучить инициацию апоптоза иммунотоксинами при помощи различных методов, а также проследить способы проникновения этих белков внутрь клеток.

Свойства общего для А-субъединиц рицина и вискумина эпитопа

Челнокова О.В., Монсеновпч М.М., Малюченко Н.В., Тороснн H.A., Чичканова Ю.В., Кондратьева Т.Ю. Егорова С. Г.

Московский Государственный университет им. М.В.Ломоносова

Введение: Вискумин (ML1), из листьев омелы белой (Viscum album), и рицин (R60) из семян клещевины (Ricinus communis) принадлежат к семейству растительных рибо-сомин-активирующих белков второго тина. Они состоят из каталитической (А) и связывающей (В) субъединиц, ко валентно связанных дисульфидной связью. Молекулярный вес субъедншш - около 30 кДа. В-субъединнцы токсинов обусловливают их взаимодействие с клеточной поверхностью. Каталитические субъединицы обладают ферментативной активностью —расщепляютМ-гликозидную связь A 28S РНК эукариот, что, в конечном итоге, приводит к остановке белкового синтеза. Высокий процент гомологии RTA и MLA, сходство их третичных структур, наличие общих олигасахарндов создают предпосылки для выявления общих для этих молекул антиге/ шых детерминант.

Цель работы: Изучение свойств общего для рицина и вискумина эпитопа.

Задачи: Изучить особенности взаимодействия моно-клональных антител ТА71, ТА75, ТА77 с А-субъединица-ми рицина и вискумина. Изучить условия экспонирования эпигона ТА7157. Определить устойчивость гибридом 'ГА71, ТА75, ТА77 к действию рицина и вискумина.

Материалы и методы: Гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела ТА71, ТА75, ТА77, были полу-

чены в результате слияния миеломы со енлешшитами мышей липни BALB/c. многократно нмм> нитрованных MI .А в присугстшш адъюванта Фришда. МонАг из ашш-iioii жидкости выделяли метолом аффинной хроматографии на белок-А-сефарозе. Взаимодействие момЛ'1 с R60, RTA, MU, MLA исследовалось с помощью ТИФА Применяемые схемы ТИФА позволяли изучал, взаимодействие монЛТ с натинными и денатурированными антигенами, а также с антигенами, взаимодействующими с гидрофобной поверхностью полипропиленовых или полисгнроло-вых 96-луночных плат. Для определения шшяния гуанидин-гидрохлорида на экспонирование эпитопа, биотинилиро-вапные каталитические субъединицы (3U0 мкт/мл)токсинов инкубировали 1 час при комнатной температуре в 0,! М трпс (рН7,7) при концентрациях гуанидинпирохло-рида от 1 до 7М. Перед проведением ТИФА объем инкубационной смеси увеличивали в 300 раз с помощью фосфат-но-солепого буфера, содержащего 0.1% БСА. 25 мМ лактозу, 0,01 твин20. Для определения устойчивости гибридом к действию токсинов использовали МТГ-тест.

Результаты: Получены новые моноклональные антитела (ТА71, ТА75, ТА77), реагирующие с каталитическими субъединицами рицина и вискумина. Конкурентный анализ показал, что эти антитела конкурируют друг с другом за место связывания как с R.TA, так и с MLA и, скорее всего, имеют общий эпигон. Эпитоп, узнаваемый монАт ТА71, ТА75.ТА77, обозначен нами как ТА7157. Особенности эпитопа ТА7157 заключаются в том, что он не экспонирован па поверхности нативных молекул токсинов и их А-субъединиц, а появляется после частичного разворачивания белковой глобулы или в результате взаимодействия белка с гидрофобной поверхностью иммунологической платы. Углеводы не входят в состав изучаемого эгштопа, поскольку он представлен надегликозилированных молекулах— рекомбинантноп MLA и на изоформе вискумина ML3. С номощыо моноклональных антител, реагирующих с данным эпитопом, получены данные о разнице в скорости репатурации у каталитических субъединиц рицина и вискумина. Различия в скорости репатурации могут влиять на цитотоксическое действие этих двух токсинов и нммуно-токсинов, синтезированных на их основе. Гибридомы, синтезирующие монАТ, были неустойчивы к действию токсинов. Изучаемые монАт не влияли на слияние азоликтиновых липосом, вызванное MLA и, следовательно, не взаимодействуют с MLA, находящейся в контакте с фосфоли-ппдиым бпелоем. Отсутствие взаимодействия aiтгител с токсинами в этих условиях может быть объяснено тем, что исследуемый участок молекулы экспонируется внутрь ли-пидного слоя, и поэтому оказывается недоступным для антител.

Заключение: Конформация RTA и MLA, при которой экспонируется общий эпитоп, может быть важной для проявления биологической активности каталитических субъединиц токсинов. Полученные моноклональные антитела могут быть использованы для изучения механизмов действия рицина и вискумина, а также их производных (иммунотоксинов).