CC BY
117
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ИНФЕКЦИОННОЙ ПАТОЛОГИИ И ЭКОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ
УДК 615.015.8:576.858:614.445
МОНИТОРИНГ АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТИ УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ ПОВЕРХНОСТНЫХ ВОДОЁМОВ
Л.М. Веркина, Е.А. Березняк, С.В. Титова, А.В. Тришина, И.Р. Симонова, Н.А. Селянская, О.Д. Кирилова,
ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт»
Веркина Людмила Михайловна - е-тат: labbiobez@mail.ru
В настоящее время особый интерес вызывает изучение антибиотикорезистентности штаммов условно-патогенных микроорганизмов (УПМ), присутствующих в природных экосистемах поверхностных водоемов, в связи с тем, что они представляют собой потенциальных возбудителей инфекционных заболеваний. В работе проведено выявление доминирующих УПМ в течение сезона исследований (с мая по октябрь), выделенных из стационарных точек забора воды поверхностных водоемов г. Ростова-на-Дону, и изучена антибиотикорезистентность выделенных штаммов. Все исследованные штаммы имели от одного до семи маркеров резистентности. При этом у 98% изолятов была выявлена резистентность к ампициллину. Наблюдался высокий процент устойчивых штаммов к рифампицину, левомицетину, фуразолидону (50%, 60%, 80% соответственно).
Ключевые слова: мониторинг, условно-патогенные микроорганизмы (УПМ),
антибиотикорезистентность.
Studying of surface water sources opportunistic microorganisms (OM) strains antibiotic resistance comes out to be of special interest nowadays because of the possibility for them to be the agents of infection diseases. Those OM were determined during the season of investigation (May - October) which were revealed from the surface bodies water withdrawal stationary points, and their antibiotic resistance was studied. All the strains investigated possessed one to seven markers of resistance. 98% of isolates were resistant to ampicillin. Resistant to Rifamycin, Laevomycetini and Furazolidone were 50%, 60%, 80% of strains correspondingly.
Key words: мonitoring, opportunistic microorganisms (OM), antibiotic resistance.
В результате усиливающихся техногенных нагрузок на о кружающую природную среду и бесконтрольного применения антибактериальных и дезинфицирующих средств качественно изменяется экзогенная и эндогенная микрофлора, с которой постоянно контактирует человеческий организм, меняется характер взаимоотношений макро- и микроорганизмов, поэтому исследования биологических систем с анализом распространения новых и изменённых видов микроорганизмов и разработкой соответствующих методов контроля за природными процессами с целью снижения негативных последствий этих процессов являются задачей обеспечения биологической безопасности (ББ) общества. В данной формулировке имеется в виду широкое понимание ББ [1]. Особенностью настоящего времени является то, что наряду с появлением и распространением прежде неизвестных инфекционных болезней наблюдаются возрастание эпидемического значения условно-патогенных микроорганизмов (УПМ) и опасность возникновения биокатастрофы естественным путём [2]. В связи с этим структуры, обеспечивающие биологическую безопасность в регионах, обязаны получать базовые сведения не только о циркулирующих опасных и особо опасных штаммах возбудителей, но и об условно-
патогенных представителях микробного пейзажа данного региона, возможности их взаимодействия и вероятности возникновения новых изменённых штаммов. Особую эпидемиологическую опасность представляет собой вода поверхностных водоёмов, благоприятная среда для УПМ, в ближайшем или отдалённом будущем вероятных возбудителей эпидемии или вспышки.
Сложное водное сообщество бактерий и формирование из них в природных условиях биоплёнки за счет горизонтального переноса может оказаться (быть) резервуаром генов патогенности и резистентности и источником появления эпидемически опасных, устойчивых к антибактериальным препаратам микроорганизмов, в том числе и вибрионов [3]. Интересные результаты получены индийскими исследователями. При поиске ассоциированных с вирулентностью генов штаммов холерного вибриона не О1/не О139 серогрупп в ПЦР-анализе, выделенных из поверхностных водоёмов южной Индии, они обнаружили присутствие генов йх A, tcp A, vic, оmp Ш, zot, Ыу A в изученных образцах [4].
Несмотря на актуальность существующих проблем, до настоящего времени не разработаны стандарты микробиологического качества воды по степени биологической
Эпидемиология
опасности естественного уровня антибиотикорезистентно-сти ведущей микрофлоры биотопа определённого региона. Такие исследования будут существенным дополнением к оценке санитарного состояния водоёмов и степени биологической безопасности изучаемой экосистемы. Особый интерес вызывает изучение антибиотикорезистентности штаммов УПМ, присутствующих в природных экосистемах поверхностных водоёмов, подлежащих исследованию на холеру в летне-осенней период, в связи с тем, что в это время значительно увеличивается выделение вибриофло-ры, в том числе неагглютинирующих холерных вибрионов (не О1/не О139) серогрупп.
Таким образом, вышеизложенное свидетельствует о необходимости постоянного динамического наблюдения за циркуляцией условно-патогенных представителей биотопов, включая постоянный контроль за изменениями их чувствительности/устойчивости к антибактериальным препаратам.
Цель исследования: получение базовой информации о составе и разнообразии условно-патогенных микроорганизмов и их антибиотикорезистентности для совершенствования системы биологической безопасности региона.
Материал и методы
Отбор проб проводили осенью 2012 г., весной, летом и осенью 2013 г., а также в мае 2014 г. Пробы воды с поверхностных водоемов отбирали батометром. Для отбора проб воды применяли стерильные стеклянные или пластмассовые прозрачные бутыли емкостью 1,5 л, согласно действующему приказу МЗ СССР № 535 от 22.04.1985 г. Всего протестировано 42 пробы воды.
Выделение культур микроорганизмов, их идентификацию проводили по МУ № 04-723/3 [6]. В целях ускорения исследования, значительного сокращения объема и материальных затрат в работе использовали хромогенные питательные среды для одноэтапного выделения и прямой идентификации УПМ.
Для выборочной идентификации использовали масс-спектрометр А^оЛех фирмы ВгикеЮаНоп^. Образец наносили на две ячейки планшета, для каждой из которых записывали спектр. Для обработки и анализа масс-спектров использовали программное обеспечение фирмы ВшкеЮаНопС (Германия): ^ехСоп^о! 2.4, масс-спектры были обработаны с помощью програмного пакета FlexAnalysis 2.4 (Вгикег Daltonics, Германия).
Определение антибиотикорезистентности микроорганизмов и оценку результатов проводили согласно МУК 4.2.1890-04 [7] методом серийных разведений, с определением минимальных подавляющих концентраций (МПК мг/л) антибактериального препарата (АБП).
Результаты и их обсуждение
При выборе биотопов для мониторинга УПМ мы руководствовались результатами многолетних наблюдений за динамикой выделения штаммов рода V. с1ю1егае из водных объектов окружающей среды в нашем регионе, проведённых Ростовским противочумным институтом. Определение антибиотикоустойчивости у выделенных штаммов холерного вибриона выявило тенденцию к развитию множественной резистентности к антибиотикам [5].
Нами было проведено посезонное определение доминирующей УПМ, выделенной из этих же стационарных
точек забора воды г. Ростова-на-Дону и изучена анти-биотикорезистентность выделенных штаммов энтеро-бактерий.
Состав микрофлоры значительно менялся в зависимости от температуры воды. Так, при температуре от 14 до 18°С среди УПМ изучаемых биотопов доминировали E. coli (31%), Klebsiella spp. (20%), Citrobacter spp. (20%), остальные представители УПМ (Enterobacter spp., Yersinia enterocolitica, Providencia rettgeri, Rahnella aquatilis, Hafnia alvei и др.) встречались в равных соотношениях, примерно по 3%. Число оксидазоположительных микроорганизмов составляло в зависимости от точки отбора 35-40%.
При повышении температуры воды до 22°С происходило изменение состава условно-патогенных микроорганизмов. Доля E. coli снизилась до 18%, а Klebsiella spp. и Citrobacter spp. до 4%. Нами были также идентифицированы следующие УПМ, представленные в незначительных количествах (1-3%): Enterobacter spp., Raoultella spp., Salmonella spp., Cronobacter spp., Pantoea spp. С повышением температуры увеличилась доля оксидазоположитель-ной микрофлоры до 56%.
ам| Yo п 36 ■
Yo ФУ
Yo
Yo лев 8
'Yo ри< ф4 j
Yo риф 16
Yo -еч 1 Р4
Yo док 16
/0 амп 8 НК32ц риф 32 J! лев 32 1 стр16 ■
1 -*ип 1 „П цип —|— НК8 >иф 6« __ I П §ефтрЧ i ü 11 m
РИС.
Показатели резистентности штаммов УПМ в зависимости от МПК антибактериального препарата.
По оси абсцисс - варианты антибиотиков, с обозначениями МПК. По оси ординат - процент устойчивых штаммов.
Из общего числа микроорганизмов, принадлежащих к семейству энтеробактерий, нами было проверено на анти-биотикорезистентность 252 штамма в сезон 2012-2013 г. и 101 штамм в мае 2014 г. В исследование были взяты химио-терапевтические препараты из рекомендуемого перечня [7], используемые при лечении инфекций человека и животных, вызываемых энтеробактериями. Выделенные штаммы были протестированы на чувствительность/устойчивость к ампициллину, налидиксовой кислоте, фуразолидону, тетрациклину, левомицетину, ципрофлоксацину, цефтри-аксону, доксициклину, триметоприму/сульфаметоксазолу и рифампицину. Интерпретация результатов оценки анти-биотикочувствительности заключалась в отнесении исследуемого микроорганизма к одной из трех категорий.
Чувствительный штамм - рост подавлялся при минимальных концентрациях АБП, промежуточный штамм -МПК антибиотика была несколько выше, чем в отношении чувствительных, устойчивый штамм - МПК, необходимая для подавления роста таких штаммов, обычно в разы выше МПК чувствительных штаммов.
Анализ фенотипических профилей антибиотикорезистентности изолятов 2012-2013 г. показал, что 41% из них
Эпидемиология
были чувствительны ко всем антибактериальным препаратам.
Большая часть УПМ (59%) оказалась устойчивой к одному, двум и более препаратам. К одному АБП были устойчивы 17% изолятов, 13% штаммов показали устойчивость к двум антибиотикам. Полирезистентность (к трем и более АБП) выявили у 50% штаммов. Наличие устойчивости к триметоприму/сульфаметоксазолу было зарегистрировано у 56% представителей исследуемых УПМ. Следует отметить ряд общих закономерностей при анализе рези-стограмм УПМ и вибрионов не О1 не/О139, выделенных от людей в этот же период наблюдения [8]. Антибиотикорезистентными оказались более половины изолятов в обоих случаях.
Анализ резистограмм изолятов УПМ в 2014 г. показал, что тенденция к полирезистентности микроорганизмов в полной мере относится и к УПМ, выделенным из поверхностных водоёмов. Все исследованные штаммы имели от одного до семи маркеров резистентности. При этом у 98% изолятов была резистентность к ампициллину (рис.). Большое количество устойчивых штаммов наблюдали при действии рифампицина, левомицетина, фуразолидона (50, 60, 80%% соответственно).
Заключение
Таким образом, вышеизложенное свидетельствует о необходимости постоянного динамического наблюдения за циркуляцией условно-патогенных представителей поверхностных водоёмов Ростовской области, включая контроль за изменениями их чувствительности/устойчивости к антибактериальным препаратам.
Полученные данные будут необходимы при разработке теоретических и практических положений биологической безопасности региона по сдерживанию распространения антибиотикорезистентности.
ЛИТЕРАТУРА
1. Онищенко Г.Г., Смоленский В.Ю., Ежлова Е.Б. и др. Концептуальные основы биологической безопасности. Часть I. ВЕСТНИК РАМН. 2013. № 10. С. 4-12.
Onishenko G.G., Smolenskiy V.J., Ejlova E.B. i dr. Konceptual'nie osnovi biologicheskoy bezopasnosti. Chast' I. VESTNIK RAMN. 2013. № 10. S. 4-12.
2. Брико Н.И., Покровский В.И. Экологические и медицинские проблемы биологической безопасности. Биозащита и биобезопасность. 2G1G. № 1 (2). С. 1G-2G.
Briko N.I., Pokrovskiy V.I. Ekologicheskie i medicinskie problemi biologicheskoy bezopasnosti. Biozashita i biobezopasnost'. 2010. № 1 (2). S. 10-20.
3. Николаев Ю.А., Плакунов В.К. Биопленка - «город микробов» или аналог многоклеточного организма Микробиология. 2GG7. Т. 76. № 2. С. 149-163.
Nikolaev J.A., Plakunov V.K. Bioplionka - «gorod mikrobov» ili analog mnogokletochnogo organizna. Mikrobioligija. 2007. Т. 76. № 2. S. 149-163.
4. Jagadeeshan S., Kumar Р., Abraham W.P., Thomas S. Multiresistant Vibrio cholerae non O1/ non O139 from watersin South India: resistance cpatternsх-and virulence-associated geneprofiles. J. BasicMicrobiol. 2GG9. Vol. 49. № 6. P. 538-544.
5. Иванова С.М., Титов Г.В., Бессмертный В.Е. и др. Информация о биологических свойствах холерных вибрионов O1 и O139 серогрупп, изолированных от людей и из объектов окружающей среды на территории Российской Федерации в 2G1G году. Холера и патогенные для человека вибрионы: Материалы проблемной комиссии (48.G4). 2G11. Вып. 24. С. 62-66.
Ivanova S.M., Titov G.V., Bessmertniy V.E. i dr. Informacija о biologicheskih cvoystvah holernih vibrionov О1 I О139 serogrupp, izolirovannih ot ludei i iz objektov okrugaushey sredi na territorii Rossijskoy Federacii v 2010 godu. Holera i patogennie dlja cheloveka vibrioni: Materiali problemnoi komissii (48.04). 2011. Vip. 24. S. 62-66.
6. Методические указания G4-723/3 Методические указания по микробиологической диагностике заболеваний, вызываемых энтеробактериями. Минздрав СССР. 1984 год. 72 с.
Metodicheskie ukazanija 04-723/3. Metodicheskie ukazanija po mikrobiologicheskoy diagnostike zabolevaniy, vizivaemih enterobakterijami. Minzdrav SSSR. 1984 god. 72 s.
7. Методические указания 4.2.189G-G4 Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам». М.: Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России, 2GG4. 92 с.
Metodicheskie ukazanija 4.2.1890-04. «Opredelenie chuvstvitel'nosti mikroorganizmov k antibakterial'nim preparatam». м.: Federalniy centr gossanepidnadzora Minzdrava Rossii, 2004. 92 s.
8. Селянская Н.А., Рыжко И.В., Веркина Л.М., Тришина А.В., Миронова А.В. Индукция in vitro трансмиссивной устойчивости к тетрациклину, хлорамфени-колу и ампициллину у культур Vibrio cholera не Ol/не O139 серогрупп, выделенных в 199G-2GG5 гг. Антибиотики и химиотерапия. 2G11. Т. 56. № 7-8. С. 16-21.
Selyanskaya N.A., Rijko I.V., Verkina L.M., Trishina A.V., Mironova. Indukcija in vitro transmissivnoy ustoichivosti k tetraciklinu, hloramfenikolu i ampicillinu u kul'tur Vibrio cholera ne 01/ne О139 serogrupp, videlennih v 1990-2005 gg. Antibiotika himioterapija. 2011. Т. 56. № 7-8. S. 16-21.
