CC BY
51
Оригинальные статьи
Original articles
Инфекция и иммунитет Russian Journal of Infection and Immunity = Infektsiya i immunitet
2021, Т. 11, № 3, с. 506-516 2021, vol. 11, no. 3, pp. 506-516
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КАРБАПЕНЕМ-УСТОЙЧИВОГО ШТАММА KLEBSIELLA PNEUMONIAEKP254 КАК ПРЕДСТАВИТЕЛЯ ЭВОЛЮЦИОННОЙ ВЕТКИ ВЫСОКОВИРУЛЕНТНЫХ ШТАММОВ
А.Е. Алексеева, Н.Ф. Бруснигина, Н.А. Гординская
ФБУН Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора, Нижний Новгород, Россия
Резюме. На основании результатов полногеномного секвенирования дана молекулярно-генетическая характеристика клинического штамма Klebsiella pneumoniae KP254, принадлежащего к клональной группе 23. Известно, что представители данной клональной группы могут обладать высокой вирулентностью и являться возбудителями внебольничных инфекций. Фенотипически штамм K. pneumoniae KP254 характеризуется множественной лекарственной устойчивостью, включая карбапенемы. В структуре хромосомы обнаружены детерминанты антибиотикорезистентности (blaSHV-1, oqxAB, fosA) и патогенности, кодирующие фимбрии 1 и 3 типов и синтез белка-сидерофора иерсинеобактина. Установлено отсутствие конъюгативного элемента ICEKp1, острова патогенности KPHPI208, а также генов аллантоинового регулона, которыми часто обладают высоковирулентные штаммы. Анализ нуклеотидных последовательностей in silico позволил выявить репли-коны плазмид групп несовместимости FII, FIAHI1/FIIK, Col440I, ColpVC, FIBK, FIIpCRY. В результате объединения контигов относительно референсных последовательностей с использованием сервиса BLASTN определено наличие предположительно двух плазмид антибиотикорезистентности IncFII и IncFIIpCRY и одной плазми-ды вирулентности IncFIBK. В структуру плазмиды вирулентности входят детерминанты белка-сидерофора аэробактина, регулятора мукоидного фенотипа RmpA2, а также гены устойчивости к тяжелым металлам. Покрытие нуклеотидной последовательности плазмиды вирулентности составило 93% относительно плазмиды вирулентности pK2044 с уровнем идентичности 99,38%, делетированными оказались области, ответственные за синтез сальмохелина и белка RmpA. Набор детерминант антибиотикорезистентности, выявленных в структуре мобилома, включает гены бета-лактамазы LAP-2 (плазмида IncFIIpCRY) — аналога TEM-1, — а также бета-лактамазы расширенного спектра CTX-X-55 (плазмида IncFII). Обе детерминанты являются редко регистрируемыми на территории Российской Федерации. Дополнительно в составе плазмидной ДНК обнаружены широко распространенные гены blaOXA-1, aac(3')-IIa, AcatB4, aac(6')-Ib-cr, tet(A), qnrS1, sul2, catA2. В структуре резистома отсутствую гены карбапенемаз, в то время как исследуемый штамм обладает устойчивостью
Адрес для переписки:
Алексеева Анна Евгеньевна
603950, Россия, Нижний Новгород, ул. Малая Ямская, 71, ФБУН Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора. Тел.: 8 (831) 432-87-91. Факс: 8 (831) 469-79-20. E-mail: a.e.alexeeva79@mail.ru
Для цитирования:
Алексеева А.Е., Бруснигина Н.Ф., Гординская Н.А. Молекулярно-генетическая характеристика карбапенем-устойчивого штамма Klebsiella pneumoniae KP254 как представителя эволюционной ветки высоковирулентных штаммов // Инфекция и иммунитет. 2021. Т. 11, № 3. C. 506-516. doi: 10.15789/2220-7619-MGC-1480
© Алексеева А.Е., Бруснигина Н.Ф., Гординская Н.А., 2021
Contacts:
Anna E. Alekseeva
603950, Russian Federation, Nizhniy Novgorod, Malaya Yamskaya str., 71, Blokhina I.N. Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology of Nizhny Novgorod. Phone: +7 (831) 432-87-91. Fax: +7 (831) 469-79-20. E-mail: a.e.alexeeva79@mail.ru
Citation:
Alekseeva A.E., Brusnigina N.F., Gordinskaya N.A. Molecular genetic characteristics of the carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae KP254 strain as a representative of the highly virulent strain evolutionary branch // Russian Journal of Infection and Immunity = Infektsiya i immunitet, 2021, vol. 11, no. 3, pp. 506-516. doi: 10.15789/2220-7619-MGC-1480
DOI: http://dx.doi.org/10.15789/2220-7619-MGC-1480
к карбапенемам. В результате анализа транслированных последовательностей генов пориновых белков OmpK35 и OmpK36 обнаружены мутационные изменения, которые привели к формированию стоп-кодона в гене ompK35. Также установлено, что аминокислотная последовательность OmpK36 содержит большое количество замен, вставок и делеций.. Наличие подобных изменений является одним из факторов, определяющих устойчивость к карбапенемам. Синергетический эффект может оказывать активность эффлюксных насосов, присутствующих в структуре генома K. pneumoniae KP254, в частности AcrAB-TolC и KpnEF. Таким образом, у исследуемого штамма наблюдается сохранение наиболее значимых признаков, характерных для представителей эволюционной ветки высоковирулентных штаммов клебсиелл, и в тоже время приобретение генетических детерминант множественной лекарственной устойчивости.
Ключевые слова: Klebsiella pneumoniae, сиквенс-тип 23, CTX-M-55, LAP-2, детерминанты резистентности и патогенности, плазмиды, вирулентность, порины.
MOLECULAR GENETIC CHARACTERISTICS OF THE CARBAPENEM RESISTANT KLEBSIELLA PNEUMONIAEKP254 STRAIN AS A REPRESENTATIVE OF THE HIGHLY VIRULENT STRAIN EVOLUTIONARY BRANCH
Alekseeva A.E., Brusnigina N.F., Gordinskaya N.A.
I.N. Blokhina Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology of Nizhny Novgorod, Nizhny Novgorod, Russian Federation
Abstract. Here we provide molecular and genetic characteristics of the Klebsiella pneumoniae KP254 clinical strain belonging to clonal group 23 based on the genome-wide sequencing data. It is known that representatives of such clonal group exert highly virulent properties and cause community-acquired infections. Phenotypically, K. pneumoniae KP254 strain is characterized by multidrug resistance, including carbapenems. The determinants of antibiotic resistance (blaSHV-1, oqxAB, fosA) and pathogenicity encoding fimbriae 1, 3 types and the siderophore yersineobactin synthesis were found in the chromosome structure. However, there was uncovered the lack of conjugative element ICEKpl, the pathogenicity island KPHPI208, and the allantoin regulon genes which are often found in highly virulent strains. Analyzing nucleotide sequences in silico allowed to reveal the replicons of incompatibility group plasmids for FII, FIAHI1/FIIK, Col440I, ColpVC, FIBK, FIIpCRY. Combining contigs relative to reference sequences by using the BLASTN service allowed to identify two putative antibiotic resistance plasmids IncFII and IncFIIpCRY as well as one virulence plasmid IncFIBK. The determinants of the aerobactin siderophore, the RmpA2 mucoid phenotype regulator as well as heavy metal resistance genes constitute the virulence plasmid structure. The virulence plasmid nucleotide sequence coverage comprised 93% relative to the virulence plasmid pK2044 with 99.38% identity level; the genomic regions responsible for the salmochelin and RmpA protein synthesis were deleted. The set of antibiotic resistance determinants identified in the mobilome structure includes the genes for beta-lactamase LAP-2 (IncFIIpCRY plasmid) — a TEM-1 analogue, as well as extended-spectrum beta-lactamase CTX-M-55 (IncFII plasmid), both of which are rarely recorded in the Russian Federation. Additionally, widespread genes blaOXA-1, aac(3')-IIa, AcatB4, aac (6')-Ib-cr, tet(A), qnrS1, sul2, catA2 were also found in the plasmid DNA. The carbapenemase genes are absent in the resistome structure, whereas the examined strain exerts carbapenem resistance. The analysis of the ompK35 and ompK36 porin gene translated sequences revealed mutational changes which resulted in emerged stop codon within the ompK35 gene, whereas OmpK36 amino acid sequence contains a large number of substitutions, insertions, and deletions. The changes identified serve as one of the factors determining the carbapenem resistance. A synergistic effect may be accounted for by activity of the efflux pumps found in the structure of the K. pneumoniae KP254 genome, particularly AcrAB-TolC and KpnEF. Thus, the strain examined by us preserves the most significant signs specific to the highly virulent evolutionary branch Klebsiella strains, and at the same time, acquires the multidrug resistance genetic determinants.
Key words: Klesiella pneumoniae, sequence type 23, CTX-M-55, LAP-2, determinants of resistance and pathogenicity, plasmids, virulence,
Введение
Известно, что бактерии вида Klebsiella pneumoniae относятся к группе условно-патогенных микроорганизмов и являются представителями нормофлоры организма человека. Однако в настоящее время штаммы Klebsiella pneumoniae, обладающие множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ), занимают
одно из лидирующих мест в этиологической структуре инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи, и включены в группу ESCAPE-патогенов (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, K. pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter sp.) как представляющие наибольшую опасность для здравоохранения [2, 5, 10, 11, 24, 28, 35]. Нужно отметить, что Klebsiella pneumoniae
являются возбудителями не только нозокоми-альных, но и внебольничных инфекционных заболеваний, таких как пневмония, гнойный абсцесс печени, воспаления урогенитально-го тракта, менингиты [5, 6, 10, 12, 28, 34, 35]. На основании филогенетического анализа ко-рового генома (core genome) Bialek-Davenet S. и соавт. [5] выявили наличие у штаммов клеб-сиелл двух эволюционных линий, к одной из которых принадлежат штаммы классических K. pneumoniae (сК. pneumoniae) с МЛУ и низкой вирулентностью, являющиеся нозо-комиальными возбудителями. Вторая линия объединила штаммы клебсиелл, обладающие высоковирулентными или гипервирулентными свойствами (hvK. pneumoniae) с низким уровнем антибиотикорезистентности и обуславливающие развитие внебольничных инфекций, в том числе у здоровых людей [2, 9, 15, 24, 28, 35, 38, 45]. Высокий уровень вирулентности hvK. pneumoniae обеспечивается наличием дополнительных факторов патогенности, к которым относятся белки-сидерофоры (сальмо-хелин, аэробактин, энтеробактин) [33, 34, 35, 38], ABC-система утилизации железа (kfuABC), регуляторы формирования гипермукоидного фенотипа (rmpA/A2), гены капсулообразова-ния (magA, k2A, wcaG) [35, 38, 45] и синтеза ли-пополисахаридов (wabG, uge, ycfM) [20, 33, 35, 45], аллантоин-утилизирующая система (allA, gcl, allD, allR, allS) [12, 33, 34, 38]. Наличие таких генов способствует проявлению штаммами hvK. pneumoniae высоко инвазивных свойств и быстрому размножению в тканях человека, поскольку продукция нескольких типов сиде-рофоров обеспечивает доступ к ионам железа, капсулообразование способствует ускользанию от иммунной защиты организма человека, а система утилизации аллантоина служит источником азота. Дополнительные факторы патогенности имеют хромосомную локализацию, а также находятся в структуре мобильных элементов, таких как плазмиды вирулентности pK2044-подобные и pLVPK-подобные (номера депонирования GenBank CP026012.1 и AY378100.1 соответственно) [10, 45], конъ-югативный интегративный элемент ICEKp, встраивающийся в хромосому в сайтах аспа-рагиновой тРНК [27], остров патогенности KPHPI208 [23]. Все эти мобильные структуры имеют схожие участки, кодирующие йерсинио-бактин и сальмохелин. Остров патогенности KPHPI208 несет дополнительные модули: кластер генов колибактина (clb) и микроцина [23].
Штаммы hvK. pneumoniae начали регистрироваться с середины 80-х гг. прошлого века исключительно на территории Азиатско-Тихоокеанского региона, но в связи с усилением миграционного потока и туристической актив-
ности с начала 2000-х гг. высоковирулентные штаммы стали также обнаруживаться на территории Европы, Африки, Америки и России. Особую тревогу вызывают сообщения о случаях приобретения такими штаммами детерминант множественной лекарственной устойчивости [11, 16, 40, 46], что свидетельствует о формировании суперпатогена двойного риска. Однако следует отметить, что имеется существенный дефицит информации о детальной молеку-лярно-генетической характеристике представителей эволюционной ветки, включающей hvK. pneumoniae, которые обладают множественной лекарственной устойчивостью.
Материалы и методы
Объектом исследования был клинический изолят K. pneumoniae KP254, выделенный из раневого отделяемого пациента ожогового отделения клиники Приволжского исследовательского медицинского университета, характеризующийся множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ), в том числе к карбапенемам. Антибиотикограмма для данного штамма представлена в нашей статье, опубликованной ранее [1]. Для выделения ДНК использовали набор «АмплиПрайм ДНКсорб-В» (ЦНИИЭ, Москва). Концентрацию ДНК определяли с помощью флуориметра Qubit (Invitrogen, Австрия). При подготовке библиотеки ДНК для секвенирования использовали набор Nextera XT (Illumina, США). Секвенирование проводили на приборе MiSeq (Illumina, США) с использованием набора MiSeq Reagent kit v2 (500 циклов). Выравнивание и cборку нуклеотид-ных последовательностей de novo осуществляли с помощью программы SPAdes (версия 3.9.1). Аннотирование проводили с использованием Prokaryotic Genome Annotation Pipeline (PGAP) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/ annotation_prok) и сервера Rapid Annotation using Subsystem Technology (https://rast.nmpdr. org). С помощью сервиса BLASTN осуществляли поиск гомологичных последовательностей, принадлежащих мобильным элементам, в первую очередь — плазмидам, и подбор наиболее близких референс-последовательностей целых плазмид, депонированных в базе данных GenBank. Типирование по группам несовместимости плазмид in silico проводили с использованием web-сервиса PlasmidFinder [8], а также базы данных plasmid MLST database (https:// pubmlst.org/bigsdb?db=pubmlst_plasmid_seqdef). Детекцию детерминант антибиотикорезис-тентности и патогенности осуществляли с помощью базы данных Klebsiella Sequence Typing (http://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html) и сервера Center for Genomic Epidemiology
A (A)
SaauanealPiWP 01S367453.1 Lengtti:359 Number of Matches: 3
See 14 more tltle(s)v
Range 1: 1 to 359 QfiOEfiB Graphics T Next Match A
Soor* Expect Hattwd IdanUdM Poridves Gaps RÜ
657 blts(1694) 0.0 Compositional matrix ad)ust 342/359(95%) 354/359(98%) 0/359(0%) +1
?uery 1 MMKRNILAWIPjllvagaanaaEIYNKNGNKLDFYGKMVGEHVWTTMGdtssddttYAR 180 bjct 1 ............................................................ 60
Query 181 IGLKGETQINOQLIGYGQ'EYNMOASNVEGSQTTKTRLAFAGLKAGEYGSFDYGRNYGAI 360 Sbjet 61 ..................H......................................... 120
Quary 361 YDVEA&TDHLVEHGGOGHNYTDNYHTGRTNGVATYRNSOf FGLVOGLSFALQYQGKNDHO 540 Sbjet 121 ....S..................F.................................... 180
Quary 541 RAIRKQNGDGFSTAATYAFD№IAl.SAGYSSSHRSVDQKADGMGDKAEAMATSAKYDAIflN 720 Sbjet 181 .S...........................AN........II.................... 240
Quary 721 IYAAVHYSQTYWITPEEDNHFAGKTQNFEAWQYQFOFGLRPSIGYVQTKGKDLQSRAGF 900 Sbjet 241 ..................D........................L........N..A.G.. 300
Quary 901 SGGOAOLVKYIEVGTWYYFNKNHHVYAAYKFNQLOONOYTKAAGVATDOQAAVGIVYQF 1077 Sbjet 301 G.........V.L........................A. .R.................. 359
Б (B)
sequence ID: WP 004180702.1 length:365 Number of Matches: 1
see 39 more ЦОД)"
Rang« 1: 1 to 365 GenPee Gfapnics * NextMalch A Previous Mater
Sam Expect Mathod IdertMes PosMvas Gaps
680 ЫВ(1754) 0.0 Compositional matttt adlust. 351/370(95%) 356/370(96%) 6/370(1%)
?uery 1 HKVKVLSLLVPALLVAGAANAAEIYNKDGNKLDLYGXIOGLHYFSDOKSVDGOQTYMRVG 60
bjct 1 ........................................................................................................................60
?uery 61 VKGETQIHOQLTGYGQWEYNVQANNTESSSOQAHTRLAFAGLKFGOAGSFDYGRNYGWY 120
bjct 61 ........................................................................................................................120
Quary 121 DVTSHTDVLPEFGGOGDTYGSONFLQSRANGVATYRHSOFFGIVDGINFAIQYQGKNGSV 180
Sbjet 121 .............••..........................................................................................178
Quary 181 SGEGAISPTNNGRTAIKQNGOGYGTSITYOIYDGISAGFAYSMSICRLGOQNSKIAIGRGO 249
Sbjet 179 .....—.....(MS......F........N..........H...TOE... VP............235
Quary 241 NAETYTGGLKYOAiMIYLATtJYTQTYNATRAGSLGFANKAQNFEWAQYQFOFGLRPSVA 300
Sbjet 236 ...................S................................................................................295
Quary »1 YLQSKGKDLE-GYGOQDILKYVDVGATYYFNKWtSTYVOYKIHLLDONSFTrWAGISTDO 359
Sbjet 296 ..........R........................................R................355
Query 360 WALGIVYQF 369 Sbjet 356 .......... 365
Рисунок 1. Сравнительный анализ транслированных последовательностей генов ompK35 (А) и ompK36 (Б) штамма K. pneumoniae KP254 и референсных аминокислотных последовательностей белков OmpK35 и OmpK36 (OmpC)
Figure 1. Comparative analysis of the ompK35 (А) and ompK36 (B) gene translated sequences from K. pneumoniae KP254 strain and the OmpK35 and OmpK36 (OmpC) reference amino acid sequences
(https://cge.cbs.dtu.dk/services). Web-сервисы IS-finder [36] и INTEGRALL [29] использовали для поиска и характеристики мобильных элементов, связанных с детерминантами антибиоти-корезистентности.
Филогенетический анализ проводили с помощью web-сервиса REALPHY [3], построение дендрограмм осуществляли в программе MEGA (версия 7.0.21), используя алгоритм ближайшего соседа (Neighbor-Joining) с бутстреп-поддержкой (1000 повторов).
Результаты
В результате сборки коротких чтений получено 103 контига (номера депонирования GenBank MRYL02000001-MRYL02000103). Характеристика общей структуры генома K. pneu-moniae KP254 дана в ранее опубликованном материале [1]. Согласно результатам типирования, штамм K. pneumoniae KP254относится к сиквенс-типу 23 и капсульному типу 57. В соответствии с полученными данными, штамм KP254 был отнесен к клональной группе (CG) 23, принадлежащей эволюционной ветке hvK. pneumoniae. Согласно результатам аннотирования, в структуре хромосомы исследуемого штамма из детерминант патогенности выявлены гены, кодирующие фимбрии 1-го и 3-го типов и йерсиниобак-тин. Гены системы утилизации аллантоина, сальмохелина, интегративного и конъюгатив-ного элемента ICEKp, островка патогенности KPHPI208 выявлены не были. В хромосомной нуклеотидной последовательности обнаружены гены b/aSHV_1 и fosA, кодирующие устойчивость к ß-лактамам и фосфомицину соответственно, а также детерминанты эффлюксных помп OqxAB, AcrAB-TolC, AcrZ, CusA/CzcA (семейство Resistance-Nodulation-Division — RND) [25,
66, 35, 44], MdtM, Bcr/CflA (семейство Major Facilitator Superfamily — MFS) [18, 30], QacE, KpnEF (семейство Small Multidrug Resistance — SMR) [22, 37], MacAB-TolC (семейство ATP-Binding Cassette — ABC) [26]. Изучение транслированных последовательностей генов мажорных пориновых белков OmpK35 и OmpK36 позволило выявить наличие стоп-кодона в последовательности белка OmpK35 и замен, вставок и де-леций в структуре OmpK36 относительно рефе-ренсных последовательностей WP_004141771.1 и WP_004180702.1 [41] (рис. 1А и 1Б соответственно).
Филогенетический анализ генома показал наибольшее родство K. pneumoniae KP254 со штаммом Kp-Goe-154414 (номер GenBank CP018337.1), выделенным из инфицированной раны мужчины в Германии в 2014 году и принадлежащим также сиквенс-типу 23 и капсуль-ному типу К57 (рис. 2).
По данным типирования in silico, в структуре мобилома штамма K. pneumoniae KP254 обнаружены репликоны плазмид IncFII, IncFIAHI1/ FIIK, Col440I, ColpVC, IncFIBK и IncFIIpCRY. С использованием сервиса BLASTN отобраны кон-тиги, потенциально принадлежащие мобильным элементам, которые в дальнейшем были объединены в предполагаемые плазмиды относительно референсных последовательностей. В таблице приведены результаты анализа структуры мобилома штамма KP254 in silico, который представлен, предположительно, шестью плаз-мидами, из которых одна является плазмидой вирулентности (IncFIBK) и две — плазмидами резистентности (IncFIIpCRY, IncFII).
Плазмида вирулентности IncFIBK имеет длину около 188 тыс. п.н., покрытие ее нуклео-тидной последовательности относительно последовательностей плазмид pK2044 и pLVPK
Klebsiella pneumoniae KP254
Klebsiella pneumoniae isolate Kp Goe 154414 J
Klebsiella pneumoniae subsp pneumoniae strain RJ A166
Klebsiella pneumoniae subsp pneumoniae NHJH-K2044
Klebsiella pneumoniae strain GN-3 LSGN3 002
Klebsiella pneumoniae strain BIDMC86
Klebsiella pneumoniae strain K5065
Klebsiella pneumoniae strain UCI110
Klebsiella pneumoniae strain PB94
Klebsiella pneumoniae strain PB270
Klebsiella pneumoniae strain MGH94
Klebsiella pneumoniae strain ED2
Klebsiella pneumoniae subsp pneumoniae 1084
Klebsiella pneumoniae strain P1428
Klebsiella pneumoniae strain VRC00173
Klebsiella pneumoniae strain VRC00171
Klebsiella pneumoniae strain PB502
Klebsiella pneumoniae strain VRC00169
Klebsiella pneumoniae strain VRC00177
Klebsiella pneumoniae strain VRC00175
Klebsiella pneumoniae strain VRC00178
Klebsiella pneumoniae strain VRC00170
Рисунок 2. Филогенетический анализ нуклеотидной последовательности хромосомы штамма K. pneumoniae KP254 (выделен жирным)
Figure 2. Phylogenetic analysis of the strain K. pneumoniae KP254 chromosome nucleotide sequence (highlighted in bold)
составляет 93 и 91% соответственно, с уровнем идентичности более 99%. При аннотировании последовательностей контигов обнаружен кластер генов аэробактина (iucABCD iutA) и гены устойчивости к ионам тяжелых металлов (pbrABCR,, pcoBCDERS, silCE, terDX). Также в структуре одного контига (номер GenBank MRYL02000014.1) выявлен ген регулятора му-коидного фенотипа клебсиелл rmpA2, алель-ный вариант 17 (согласно базе данных Klebsiella Sequence Typing). При этом у плазмиды исследуемого штамма дилетированными оказались области, содержащие гены регулятора гипермуко-идного фенотипа rmpA и сальмохелина.
Филогенетический анализ показал, что ну-клеотидная последовательность плазмиды IncFIBK исследуемого штамма является наиболее близкородственной плазмиде pL22-1 (CP031258.1) гипервирулентного штамма K. quasipneumoniae L22, выделенного от больного пневмонией в 2014 г. в Китае (рис. 3).
В структуре мобилома штамма K. pneumoniae KP254 выявлен контиг, содержащий реплико-
Таблица. Характеристика мобилома штамма K. pneumoniae KP254
Table. Characterization of the strain K. pneumoniae KP254 mobilome
Репликоны плазмид (% идентичности относительно референса) Plasmid replicons (% identity relative to reference) Номера референс-геномов плазмид в GenBank GenBank accession number of reference plasmid genome Номера контигов в GenBank GenBank accession number of contigs Гены антибиотико-резистентности Antibiotic resistance determinants Гены патогенности Pathogenicity determinants
IncFII (100) CP018343.1 MRYL02000035.1, MRYL02000046.1, MRYL02000053.1, MRYL02000055.1, MRYL02000058.1, MRYL02000061.1, MRYL02000072.1, MRYL02000075.1, MRYL02000076.1, MRYL02000090.1, MRYL02000096.1 blaOXA-1, blaCTX-M-55, aac(3)-IIa, AcatB4, aac(6')-Ib-cr Не выявлено Not found
IncFIAHI1 (97,16)/ FI IK (98,65) CP018340.1 MRYL02000026.1, MRYL02000045.1, MRYL02000056.1, MRYL02000082.1 Не выявлено Not found Не выявлено Not found
IncFIIpcRY (81,32) CP018341.1 MRYL02000023.1, MRYL02000047.1, MRYL02000066.1 blaLAP-2, tet(A), qnrS1, sul2, catA2 Не выявлено Not found
IncFIBK (91,25) CP018338.1 MRYL02000014.1, MRYL02000036.1, MRYL02000038.1, MRYL02000048.1, MRYL02000052.1, MRYL02000054.1, MRYL02000068.1, MRYL02000071.1, MRYL02000088.1, MRYL02000089.1 Не выявлено Not found rmpA2, iucABCD, iutA, pbrABCR, pcoBCDERS, silCE, terDX
Col440I (92,11) CP003995.1 MRYL02000051.1 Не выявлено Not found Не выявлено Not found
ColpVC (88,95) - MRYL02000063.1 Не выявлено Not found Не выявлено Not found
ны IncFIAHI1/FIIK. Согласно результатам отбора контигов относительно референса (номер GenBank CP018340.1), длина предполагаемой плазмиды составила около 80 тыс. п.н. В структуре контигов определены гены, ответственные за конъюгативный транспорт. Известных детерминант резистентности и патогенности выявлено не было.
Мобилом штамма KP254 представлен, вероятно, двумя плазмидами резистентности: IncFII и IncFIIj^RY-подобной. В предполагаемой плазмиде размером 59 160 п.н., содержащей репликон IncFII, находится ген CTX-M-55-цефалоспориназы (контиг MRYL02000053.1). Согласно схеме типирования, предложенной Villa L. и соавт. [42], FAB-формула данной плазмиды — F2:A-:B-. В генетическое окружение
гена blar
входит укороченная последова-
тельность транспозона Тп3 длиной 2246 п.н., ген металлопротеина семейства WbuC, перед геном Ь/аСТХ_М_55 на расстоянии 48 п.н. расположен остаток инсерционного элемента А\$>Еср1 (длина 267 п.н.), вся структура фланкирована укороченными инсерционными последовательностями А1Б26. Предположительно, в структуру плазмиды 1псР11 входят также сцепленные гены Аса1В4, Ь/аОХА-1, аае(6')-1Ь-ег (контиг МЯУЬ02000061.1), окруженные остатками генов транспозаз семейства 1Б6, и ген аас(3')-11а (контиг МЯУЬ02000058.1), связанный с неполными последовательностями транспозаз семейств 1Б3 и 1Б6. В структуре контигов, объединенных в предполагаемую плазмиду, присутствуют гены, ответственные за конъюгативный перенос. Согласно базе данных GenBank, ген Ь/асТХ_М_55 присутствует у 641 депонированного штамма энтеробактерий, однако полногеномные последовательности плазмид 1псР11 генотипа Б2:А-:В-, содержащих данный ген, представлены очень ограниченным числом, большинство последовательностей находится в виде коротких контигов. В связи с этим, на данный момент проведение филогенетического анализа оказалось невозможным.
Вторая предполагаемая плазмида резистентности длиной около 80 тыс. п.н. несет 1псР11рСКУ-подобный репликон. В ее структуре обнаружена детеминанта в-лактамазы ЬАР-2 (контиг МЯУЬ02000023.1), на одной последовательности с геном Ь1аЬАР_2 расположены гены детерминант, ответственных за устойчивость к хи-нолонам (дпг81) и тетрациклину (1вЛ). Анализ генетического окружения Ь1а^Р_2 показал, что перед генами дпг81 и Ь1а ^Р_2 находится инсерци-онная последовательность \SKpn19, расстояние между генами составляет 1597 п.н., и здесь располагается инсерционная последовательность А1БЕс/2 семейства 1Б3 длиной 1154 п.н. (является псевдогеном за счет наличия стоп-кодонов),
Klebsiella pneumoniae KP254 plasmid IncFIB K
Klebsiella quasipneumoniae strain L22 plasmid pL22-1 Klebsiella variicola strain 15WZ-82 plasmid p15WZ-82 Vir Klebsiella pneumoniae isolate Kp Goe 154414 plasmid pKp Goe 414-2 Klebsiella pneumoniae UCI42 adjcz-supercontl 4
40|—И
I— И 781—К
Klebsiella pneumoniae strain TUM14002 sequence08 Klebsiella pneumoniae strain WCHKP13F2 plasmid pVir 095132 781— Klebsiella pneumoniae strain WCHKP13F2 plasmid pVir WCHKP13F2 -Klebsiella pneumoniae subsp pneumoniae strain RJA166 plasmid pRJA166b
□ Klebsiella pneumoniae strain 4300STDY6470424 Klebsiella pneumoniae strain MGH94 aeusg-supercontl 2 Klebsiella pneumoniae strain SGH10 plasmid pSGH10
С
331— Klebsiella pneumoniae subsp pneumoniae NTUH-K2044 plasmid pK2044
Рисунок 3. Дендрограмма нуклеотидной последовательности плазмиды вирулентности IncFIBK штамма K. pneumoniae KP254 (выделено жирным) относительно последовательностей плазмид вирулентности, депонированных в GenBank
Figure 3. Dendrogram of the IncFIBK virulence plasmid nucleotide sequence of K. pneumoniae KP254 strain (highlighted in bold) relative to the virulence plasmid sequences deposited in GenBank
а после — неполная последовательность транс-позазы семейства TnAsl. В структуру данной плазмиды были объединены также контиги, несущие гены устойчивости к хлорамфениколу (catA2) и сульфаниламидам (sul2), которые также окружены мобильными элементами. В частности, ген sul2 расположен между инсерционными элементами IS Vsa3 (семейство ISil ) и IS5075 (семейство IS110) (контиг MRYL02000047.1), а концы короткого контига, содержащего ген catA2, представляют собой остатки транспозаз семейства IS6 (контиг MRYL02000066.1). В структуре плазмиды также присутствуют контиги, содержащие гены конъюгативного транспорта. Поиск гомологичных последовательностей с помощью сервиса BLASTN позволил установить ши-
Klebsiella pneumoniae strain XPY207 NODE 54
Klebsiella pneumoniae strain K3113 Scaffold18
Klebsiella pneumoniae strain 4300STDY6636941
Klebsiella pneumoniae strain 01212 01212 contig 16
Klebsiella pneumoniae strain EuSCAPE TR196
K pneumoniae KP254 plasmid FllpCRY
Klebsiella pneumoniae isolate Kp Goe 154414 plasmid pKp Goe 4144
Klebsiella pneumoniae strain 4300STDY6470465
Klebsiella pneumoniae strain MM17 004D
Рисунок 4. Филогенетический анализ нуклеотидной последовательности плазмиды IncFIIpCRY штамма K. pneumoniae KP254 (выделено жирным) относительно последовательностей плазмид, депонированных в GenBank Figure 4. Dendrogram of the IncFIIpCRY plasmid nucleotide sequence of K. pneumoniae KP254 strain (highlighted in bold) relative to the sequences of plasmids deposited in GenBank
рокое распространение IncFII^^-подобных плазмид, несущих ген blaLAP, среди штаммов клебсиелл. Филогенетический анализ выявил высокий уровень родства последовательностей предполагаемой IncFII^^-подобной плазмиды исследуемого штамма с последовательностями плазмиды pKp-Goe-414-4 (номер GenBank CP018337.1) (рис. 4).
Репликон Col440I выявлен в структуре контига MRYL02000051.1, в котором, согласно результатам аннотирования, имеется ряд гипотетических белков, детерминанты патогенности или резистентности не обнаружены. В результате поиска относительно базы данных RefSeq высокогомологичные последовательности (идентичность выше 94%) выявлены у более 100 штаммов K. pneumoniae, выделенных в различных регионах мира.
Контиг MRYL02000063.1, содержащий ColpCC -подобный репликон, имеет уровень идентичности более 99% с полногеномными последовательностями коротких плазмид, обнаруженных в штаммах Escherichia coli и K. pneumoniae, а также с последовательностями штаммов клеб-сиелл, депонированных в виде контигов.
Обсуждение
Полученная молекулярно-генетическая характеристика исследуемого штамма показывает, что исследуемый штамм хотя и относится к эволюционной ветке высоковирулентных K. pneumoniae, однако не обладает полным набором соответствующих детерминант. Наличие генов, кодирующих фимбрии и йерсиниобак-тин, является общим для обеих эволюционных линий K. pneumoniae [34, 35, 38], а отсутствие дополнительных факторов патогенности (саль-мохелина, системы утилизации аллантоина, гена rpmA и др.) может, на первый взгляд, свидетельствовать о невысоком патогенетическом потенциале исследуемого штамма. Этот вывод согласуется, например, с данными исследований, проведенных Lev A.I. и соавт. [24] на мышиных моделях, в которых было показано, что 2 штамма клебсиелл ST23K57 являлись авирулент-ными. Однако результаты других исследований свидетельствуют о том, что потеря сальмохе-лина и гена регулятора мукоидного фенотипа rpmA не приводит к значительному снижению вирулентности [16], а исследования Russo T.A. и соавт. [33] выявили наибольшую значимость продукции аэробактина для проявления вирулентных свойств. На основании всех этих данных был сделан вывод, что наличие только генов аэробактина и белка RpmA2 является достаточным для формирования гипервирулентного фенотипа [33, 35]. Можно также сделать предположение, что отсутствие дополнительных фак-
торов связано с местом выделения штамма. Так, по данным литературы, наличие ICEKp было выявлено у всех штаммов, ассоциированных с первичным гнойным абсцессом печени [27]. Штаммы, колонизирующие кишечный тракт и слизистую оболочку, обладали генами утилизации аллантоина (кластер генов all), продукции капсульного полисахарида (kvgAS) и системы поглощения железа (kfuABC) [20, 28, 35]; для штаммов, ассоциированных с пневмонией, важным фактором является наличие гена peg-344 [6, 35]. Интересным представляется результат филогенетического анализа, в котором последовательность генома исследуемого штамма кластеризуется с последовательностью штамма K. pneumoniae, также выделенного с поверхности инфицированной раны и обладающего тем же набором хромосомных детерминант пато-генности и антибиотикорезистентности.
Наличие МЛУ у штаммов клебсиелл, относящихся к эволюционной линии hvK. pneumoniae, теперь уже не вызывает удивления. Первые сообщения об обнаружении таких штаммов в Китае датируются 2014 годом, затем аналогичные штаммы стали регистрироваться в различных странах мира. Изучение структуры резистома показало, что антибиотикоустойчивость исследуемого штамма реализуется, в первую очередь, за счет приобретения генетических детерминант, находящихся предположительно на двух конъюгативных плазмидах IncFII и IncFIIpCRY. В структуре предполагаемой плазмиды IncFII выявлены четыре детерминанты резистентности — по две к аминогликозидам/фторхиноло-нам и бета-лактамам (OXA-1, CTX-M-55) (табл.). Известно, что плазмиды IncFII в наибольшей степени участвуют в распространении генов
blaC
[42, 47]: в частности, плазмиды гено-
типа F2:A-:B- являются одними из основных носителей генов CTX-M-9 и CTX-M-15 цефа-лоспориназ [9, 13]. Что касается детерминанты CTX-M-55-цефалоспориназы, то, согласно литературным данным, она чаще регистрируется в структуре плазмид IncFII генотипа F33:A-:B-[13], IncI, IncN, IncX [31, 43]. Детерминанта бета-лактамазы расширенного спектра CTX-M-55-цефалоспориназы в настоящее время не является эпидемически распространенной на территории РФ [14], однако на территории Китая находится в лидерах по распространенности [19]. Впервые ген был выявлен на территории Таиланда в 2005 г., аминокислотная последовательность CTX-M-55 имеет единственную замену Ala-80-Val относительно эпидемически распространенной CTX-M-15, которая обуславливает повышенную устойчивость к цефтазидиму [21]. Структурная организация генетического окружения гена blaCTX_M_55 штамма K. pneumoniae KP254 является наибо-
лее распространенной и относится к типу I, согласно классификации Hu X. и соавт. [19]. Одновременное присутствие в структуре одной плазмиды генов blaOXA-1, blaCTX-M, aac(3')-IIa, AcatB4, aac(6)-Ib-cr широко распространено среди представителей энтеробактерий.
Интересным представляется наличие в структуре предполагаемой IncFII^^-подоб-ной плазмиды детерминанты бета-лактамазы LAP-2, относящейся к классу А бета-лактамаз и являющейся аналогом TEM-1 [32] — ранее об обнаружении данной детерминанты среди российских изолятов клебсиелл не сообщалось. В соответствии с данными на апрель 2020 г. в GenBank депонировано всего 634 штамма бактерий, несущих ген blaLAP_2. Первые описания генетического окружения были сделаны для ал-лельного варианта blaLAP-1, выявленного в штамме Enterobacter cloacae [32]. При сравнительном анализе структуры генетического окружения гена blaLAP_2 штамма K. pneumoniae KP254выявле-но значительное его сходство с описанным ранее Poirel L и соавт. [32] для штамма E. cloacae, где ген также ассоциирован с детерминантой белка QrnSl, находящейся на расстояния в 1597 п.н. В исследовании Poirel L и соавт. показано, что между генами находится последовательность ISEcl2 длиной 1282 п.н. В случае с K. pneumoniae KP254 эта последовательность короче и имеет большое количество мутаций, которые привели к формированию стоп-кодонов. Отметим, что участок нуклеотидной последовательности всей мобильной единицы, включающей blaLAP_2 и QrnSl, штамма KP254 имеет 100%-ное сходство с соответствующими участками, присутствующими в 12 полногеномных последовательностях плазмид штаммов K. pneumoniae и одной — Salmonella enterica, а также 81 последовательности K. pneumoniae, депонированных в виде контигов. Филогенетический анализ, который включал исследование полногеномных последовательностей плазмид IncFIIpCRY и последовательностей контигов, показал, что предполагаемая IncFII^^-подобная плазмида штамма K. pneumoniae KP254 имеет наибольшее родство с последовательностью плазмиды pKp-Goe-414-4.
Установлено, что исследуемый штамм обладает устойчивостью к бета-лактамным антибиотикам, включая карбапенемы (Дорипенем, Имипенем, Меропенем, Эртапенем) [1], однако в структуре резистома гены карбапенемаз отсутствуют. Известно, что проявление устойчивости к карбапенемам коррелирует с функционированием мажорных пориновых белков Ompk35 и OmpK36 [39, 41], в частности, по данным Tsai Y.-K. и соавт. [41], наличие мутаций в последовательностях обоих белков в несколько раз увеличивает значения минимальных
ингибирующих концентраций меропенема и цефепима. У штамма K. pneumoniae KP254 выявлено наличие стоп-кодона в последовательности гена ompK35, что приводит к отсутствию его экспрессии, аминокислотная структура OmpK36 также имеет значительные отличия от референсной. Таким образом, можно сделать предположение, что измененная структура обоих пориновых белков является одним из факторов, обусловливающих устойчивость к карба-пенемам.
Другим механизмом, участвующим в проявлении МЛУ, является активация эффлюксных транспортных систем в ответ на воздействие лекарственного вещества [26]. В структуре генома K. pneumoniae KP254 обнаружено несколько типов транспортных систем, активность которых может оказывать синергетический эффект, формируя устойчивость в том числе и к карба-пенемам. Наибольшую значимость имеют белки семейства RND — AcrA и AcrB, — которые формируют трехкомпонентный комплекс AcrAB-TolC, обладающий широкой субстратной специфичностью [26, 44]. В структуре генома был выявлен ген, кодирующий короткий белок AcrZ, который образует комплекс с AcrAB-TolC через AcrB, способствуя распознаванию и экспорту дополнительных субстратов, в частности тетрациклина, пуромицина и хлорамфеникола [17]. Геном штамма содержит и другие помпы семейства RND: OqxAB (транспорт хинолонов, фтор-хинолонов и хлорамфеникола) [25], CusA/CzcA (эффлюкс ионов кобальта, цинка, кадмия) [7]. Согласно литературным данным, в удалении карбапенемов может участвовать система KpnEF семейства SMR, осуществляющая транспорт широкого спектра антибактериальных препаратов и участвующая в капсулообразовании [37]. К семейству SMR относится также белок QacE, обеспечивающий выведение четвертичных аммонийных соединений [22]. Представители семейства MFS не являются доминирующими в формировании МЛУ, наибольшее клиническое значение имеет синглетная транспортная система TetA, определяющая устойчивость к тетраци-клинам [26]. К другим представителями этого семейства, присутствующим в структуре генома K. pneumoniae KP254, относится транспортный белок MdtM, участвующий в выведении четвертичных аммонийных соединений [18], система Bcr/CflA, функция которой у клебсиелл не определена, но на примере Proteus mirabilis показано, что она ответственна за устойчивость к фосфо-мицину и необходима для формирования биопленки [30]. Семейство ABC-транспортеров у штамма K. pneumoniae KP254 представлено только генами белков MacAB, которые при образовании комплекса MacAB -TolC обеспечивают эффлюкс макролидов [26].
Таким образом, на основании проведенного исследования можно сделать заключение, что у штаммов, относящихся к эволюционной линии, включающей hvK. pneumoniae, при приобретении фенотипа МЛУ могут отсутствовать гены, определяющие формирование дополнительных вирулентных свойств. Аналогичный вывод был сделан Russo T.A. и соавт. [33]. Однако, с другой стороны, отсутствие некоторых факторов па-тогенности может быть связано с местом локализации исследуемого штамма. Формирование МЛУ штаммом K. pneumoniae KP254 определяется в первую очередь приобретением соответ-
Список литературы/References
ствующих детерминант резистентности, находящихся на конъюгативных плазмидах. В то же время устойчивость к карбапенемам, при отсутствии генов карбапенемаз, связана с наличием альтернативных механизмов, в частности с изменением структуры пориновых белков и функционированием систем эффлюксных насосов, обладающих широкой субстратной специфичностью. Полученные нами сведения в целом способствуют расширению знаний о штаммах K. pneumoniae, относящихся к эволюционной ветке, объединяющей штаммы с высоковирулентными свойствами.
1. Алексеева А.Е., Бруснигина Н.Ф., Солнцев Л.А., Гординская Н.А. Молекулярное типирование клинических изолятов Klebsiella pneumoniae, продуцирующих бета-лактамазы расширенного спектра действия // Клиническая лабораторная диагностика. 2017. Т. 62, № 11. С. 699—704. [Alekseeva A.E., Brusnigina N.F., Solntsev L.A., Gordinskaya N.A. The molecular typing of clinical isolates Klebsiella pneumoniae producing beta-lactamases of extended specter of action. Klinicheskaya laborator-naya diagnostika = Russian Clinical Laboratory Diagnostics, 2017, vol. 62, no. 11, pp. 699—704. (In Russ.)] doi: 10.18821/0869-20842017-62-11-699-704
2. Комисарова Е.В., Воложанцев Н.В. Гипервирулентная Klebsiella pneumoniae — новая инфекционная угроза // Инфекционные болезни. 2019. Т. 17, № 3. С. 81—89. [Komisarova E.V., Volozhantsev N.V. Hypervirulent Klebsiella pneumoniae: a new infectious threat. Infektsionnye bolezni = Infectious Diseases, 2017, vol. 17, no. 3, pp. 81—89. (In Russ.)] doi: 10.20953/17299225-2019-3-81-89
3. Bertels F., Silander O.K., Pachkov M., Rainey P.B., van Nimwegen E. Automated reconstruction of whole-genome phylogenies from short-sequence reads. Mol. Biol. Evol, 2014, vol. 31, no. 5, pp. 1077—1088. doi: 10.1093/molbev/msu088
4. Bhagirath A.Y., Li Y., Patidar R., Yerex K., Ma X., Kumar A., Duan K. Two component regulatory systems and antibiotic resistance in gram-negative pathogens. Int. J. Mol. Sci., 2019, vol. 20, no. 7:1781. doi: 10.3390/ijms20071781
5. Bialek-Davenet S., Criscuolo A., Ailloud F., Passet V., Jones L., Delannoy-Vieillard A., Garin B., Le Hello S., Arlet G., Nicolas-Chanoine M.-H., Decré D., Brisse S. Genomic definition of hypervirulent and multidrug-resistant Klebsiella pneumoniae clonal groups. Emerg. Infect. Dis., 2014, vol. 20, no. 11, pp. 1812-1820. doi: 10.3201/eid2011.140206
6. Bulger J., MacDonald U., Olson R., Beanan J., Russo T.A. Metabolite transporter PEG344 is required for full virulence of hypervirulent Klebsiella pneumoniae strain hvKP1 after pulmonary but not subcutaneous challenge. Infect. Immun., 2017, vol. 85, no. 10: e00093-17. doi: 10.1128/IAI.00093-17
7. Cabral L., Júnior G.V.L., Pereira de Sousa S.T., Dias A.C.F., Lira Cadete L., Andreote F.D., Hess M., de Oliveira V.M. Anthropogenic impact on mangrove sediments triggers differential responses in the heavy metals and antibiotic resistomes of microbial communities. Environ. Pollut., 2016, vol. 216, pp. 460- 469. doi: 10.1016/j.envpol.2016.05.078
8. Carattoli A., Hasman H. PlasmidFinder and in silico pMLST: identification and typing of plasmid replicons in whole-genome sequencing (WGS). Methods Mol. Biol, 2020, vol. 2075, pp. 285-294. doi: 10.1007/978-1-4939-9877-7 20
9. Chen X., He L., Li Y., Zeng Z., Deng Y., Liu Y., Liu J.-H. Complete sequence of a F2:A-:B- plasmid pHN3A11 carrying rmtB and qepA, and its dissemination in China. Vet. Microbiol., 2014, vol. 174, no. 1-2, pp. 267-271. doi: 10.1016/j.vetmic.2014.08.023
10. Chen Y.T., Chang H.Y., Lai Y.C., Pan C.C., Tsai S.F., Peng H.L. Sequencing and analysis of the large virulence plasmid pLVPK of Klebsiella pneumoniae. Gene, 2004, vol. 337,pp. 189-198. doi: 10.1016/j.gene.2004.05.008
11. Cheong H.S., Chung D.R., Park M., Kim S.H., Ko K.S., Ha Y.E., Kang C.I., Peck K.R., Song J.H. Emergence of an extended-spectrum ß-lactamase-producing serotype K1 Klebsiella pneumoniae ST23 strain from Asian countries. Epidemiol. Infect., 2017, vol. 145, no. 5, pp. 990-994. doi: 10.1017/S0950268816003113
12. Chou H.C., Lee C.Z., Ma L.C., Fang C.T., Chang S.C., Wang J.T. Isolation of a chromosomal region of Klebsiella pneumoniae associated with allantoin metabolism and liver infection. Infect. Immun., 2004, vol. 72, no. 7, pp. 3783-3792. doi: 10.1128/ IAI. 72.7.3783-3792.2004
13. Deng Y., He L., Chen S., Zheng H., Zeng Z., Liu Y., Sun Y., Ma J., Chen Z., Liu J.H. F33:A-:B- and F2:A-:B- plasmids mediate dissemination of rmtB-blaCTX-M-9 group genes and rmtB-qepA in Enterobacteriaceae isolates from pets in China. Antimicrob. Agents Chemother., 2011, vol. 55, no. 10, pp. 4926-4929. doi: 10.1128/AAC.00133-11
14. Edelstein M., Pimkin M., Palagin I., Edelstein I., Stratchounski L. Prevalence and molecular epidemiology of CTX-M extended-spectrum ß-lactamase-producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae in Russian hospitals. Antimicrob. Agents Chemother., 2003, vol. 47, no. 12, pp. 3724-3732. doi: 10.1128/aac.47.12.3724-3732.2003
15. Fang C.T., Chuang Y.P., Shun C.T., Chang S.C., Wang J.T. A novel virulence gene in Klebsiella pneumoniae strains causing primary liver abscess and septic metastatic complications. J. Exp. Med., 2004, vol. 199, no. 5,pp. 697-705. doi: 10.1084/jem.20030857
16. Gu D., Dong N., Zheng Z., Lin D., Huang M., Wang L., Chan E.W., Shu L., Yu J., Zhang R., Chen S. A fatal outbreak of ST11 carbapenem-resistant hypervirulent Klebsiella pneumoniae in a Chinese hospital: a molecular epidemiological study. Lancet Infect. Dis, 2017, vol. 18, no. 1, pp. 37-46. doi: 10.1016/S1473-3099(17)30489-9
17. Hobbs E.C., Yin X., Paul B.J., Astarita J.L., Storz G. Conserved small protein associates with the multidrug efflux pump AcrB and differentially affects antibiotic resistance. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2012, vol. 109, no. 41, pp. 16696-16701. doi: 10.1073/pnas.1210093109
18. Holdsworth S.R., Law C. J. The major facilitator superfamily transporter MdtM contributes to the intrinsic resistance of Escherichia coli to quaternary ammonium compounds. J. Antimicrob. Chemother., 2013, vol. 68, no. 4, pp. 831—839. doi: 10.1093/jac/dks491
19. Hu X., Gou J., Guo X., Cao Z., Li Y., Jiao H., He X., Ren Y., Tian F. Genetic contexts related to the diffusion of plasmid-medi-ated CTX-M-55 extended-spectrum beta-lactamase isolated from Enterobacteriaceae in China. Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob., 2018, vol. 17, no. 1. doi: 10.1186/s12941-018-0265-x
20. Izquierdo L., Coderch N., Piqué N., Bedini E., Corsaro M.M., Merino S., Fresno S., Tomás J.M., Regué M. The Klebsiella pneumoniae wabG gene: role in biosynthesis of the core lipopolysaccharide and virulence. J. Bacteriol., 2003, vol. 185, no. 24, pp. 7213-7221. doi: 10.1128/jb.185.24.7213-7221.2003
21. Kiratisin P., Apisarnthanarak A., Saifon P., Laesripa C., Kitphati R., Mundy L.M. The emergence of a novel ceftazidime-resistant CTX-M extended-spectrum beta-lactamase, CTX-M-55, in both community-onset and hospital-acquired infections in Thailand. Diagn. Microbiol. Infect. Dis, 2007, vol. 58, no. 3,pp. 349-355. doi: 10.1016/j.diagmicrobio.2007.02.005
22. Kücken D., Feucht H., Kaulfers P. Association of qacE and qacEDeltal with multiple resistance to antibiotics and antiseptics in clinical isolates of Gram-negative bacteria. FEMS Microbiol. Lett., 2000, vol. 183, iss. 1, pp. 95-98. doi: 10.1111/j.1574-6968.2000.tb08939.x
23. Lai Y.C., Lin A.C., Chiang M.K., Dai Y.H., Hsu C.C., Lu M.C., Liau C.Y., Chen Y.T. Genotoxic Klebsiella pneumoniae in Taiwan. PLoS One, 2014, vol. 9, no. 5: e96292. doi: 10.1371/journal.pone.0096292
24. Lev A.I., Astashkin E.I., Kislichkina A.A., Solovieva E.V., Kombarova T.I., Korobova O.V., Ershova O.N., Alexandrova I.A., Malikov V.E., Bogun A.G., Borzilov A.I., Volozhantsev N.V., Svetoch E.A., Fursova N.K. Comparative analysis of Klebsiella pneumoniae strains isolated in 2012—2016 that differ by antibiotic resistance genes and virulence genes profiles. Pathog. Glob. Health, 2018, vol. 112, no. 3, pp. 142-151. doi: 10.1080/20477724.2018.1460949
25. Li J., Zhang H., Ning J., Sajid A., Cheng G., Yuan Z., Hao H. The nature and epidemiology of OqxAB, a multidrug efflux pump. Antimicrob. Resist. Infect. Control., 2019, vol. 8, no. 44. doi: 10.1186/s13756-019-0489-3
26. Li X.-Z., Plésiat P., Nikaido H. The challenge of efflux mediated antibiotic resistance in gram-negative bacteria. Clin. Microbiol. Rev., 2015, vol. 28, no. 2,pp. 337-418. doi: 10.1128/CMR.00117-14
27. Lin T.L., Lee C.Z., Hsieh P.F., Tsai S.F., Wang J.T. Characterization of integrative and conjugative element ICEKp1-associated genomic heterogeneity in a Klebsiella pneumoniae strain isolated from a primary liver abscess. J. Bacteriol., 2008, vol. 190, no. 2, pp. 515-526. doi: 10.1128/JB.01219-07
28. Ma L.-C., Fang C.-T., Lee C.-Z., Shun C.-T., Wang J.-T., Genomic heterogeneity in Klebsiella pneumoniae strains is associated with primary pyogenic liver abscess and metastatic infection. J. Infect. Dis., 2005, vol. 192, no. 1, pp. 117-128. doi: 10.1086/430619
29. Moura A., Soares M., Pereira C., Leitao N., Henriques I., Correia A. INTEGRALL: a database and search engine for integrons, integrases and gene cassettes. Bioinformatics, 2009, vol. 25, no. 8, pp. 1096-1098. doi: 10.1093/bioinformatics/btp105
30. Nzakizwanayo J., Scavone P., Jamshidi S., Hawthorne J.A., Pelling H., Dedi C., Salvage J.P., Hind C.K., Guppy F.M., Barnes L.M., Patel B.A., Rahman K.M., Sutton M.J., Jones B.V. Fluoxetine and thioridazine inhibit efflux and attenuate crystalline biofilm formation by Proteus mirabilis. Sci. Rep, 2017, vol. 7:12222. doi: 10.1038/s41598-017-12445-w
31. Pan Y.S., Liu J.H., Hu H., Zhao J.F., Yuan L., Wu H., Wang L.F., Hu G.Z. Novel arrangement of the blaCTX-M-55 gene in an Escherichia coli isolate coproducing 16S rRNA methylase. J. Basic. Microbiol., 2013, vol. 53, no. 11, pp. 928-933. doi: 10.1002/ jobm.201200318
32. Poirel L., Cattoir V., Soares A., Soussy C.J., Nordmann P. Novel Ambler class A beta-lactamase LAP-1 and its association with the plasmid-mediated quinolone resistance determinant QnrS1. Antimicrob. Agents Chemother., 2007, vol. 51, no. 2, pp. 631-637. doi: 10.1128/AAC.01082-06
33. Russo T.A., Olson R., Fang C.-T., Stoesser N., Miller M., MacDonald U., Hutson A., Barker J.H., La Hoz R.M., Johnson J.R. for the Hypervirulent Klebsiella pneumoniae Investigator Group (HVKPIG). Identification of biomarkers for differentiation of hypervirulent Klebsiella pneumoniae from classical K. pneumoniae. J. Clin. Microbiol., 2018, vol. 56 (9): e00776-18. doi: 10.1128/JCM.00776-18
34. Russo T.A., Olson R., Macdonald U., Metzger D., Maltese L.M., Drake E.J., Gulick A.M. Aerobactin mediates virulence and accounts for increased siderophore production under iron-limiting conditions by hypervirulent (hypermucoviscous) Klebsiella pneumoniae. Infect. Immun., 2014, vol. 82, no. 6, pp. 2356-2367. doi: 10.1128/IAI.01667-13
35. Russo T.A., Marr C.M. Hypervirulent Klebsiella pneumoniae. Clin. Microbiol. Rev, 2019, vol. 32 (3): e00001-19. doi: 10.1128/ CMR.00001-19
36. Siguier P., Perochon J., Lestrade L., Mahillon J., Chandler M. ISfinder: the reference centre for bacterial insertion sequences. Nucleic Acids Res, 2005, vol. 34, pp. D32-D36. doi: 10.1093/nar/gkj014
37. Srinivasan V.B., Rajamohan G. KpnEF, a new member of the Klebsiella pneumoniae cell envelope stress response regulon, is an SMR-type efflux pump involved in broad-spectrum antimicrobial resistance. Antimicrob. Agents Chemother., 2013, vol. 57, no. 9, pp. 4449-4462. doi: 10.1128/AAC.02284-12
38. Struve C., Roe C.C., Stegger M., Stahlhut S.G., Hansen D.S., Engelthaler D.M., Andersen P.S., Driebe E.M., Keim P., Krogfelt K.A. Mapping the evolution of hypervirulent Klebsiella pneumoniae. mBio, 2015, vol. 6 (4): e00630-15. doi: 10.1128/ mBio.00630-15
39. Sugawara E., Kojima S., Nikaido H. Klebsiella pneumoniae major porins OmpK35 and OmpK36 allow more efficient diffusion of ß-lactams than their Escherichia coli homologs OmpF and OmpC. J. Bacteriol., 2016, vol. 198, no. 23, pp. 3200-3208. doi: 10.1128/JB.00590-16
40. Surgers L., Boyd A., Girard P.M., Arlet G., Decré D. ESBL-producing strain of hypervirulent Klebsiella pneumoniae K2, France. Emerg. Infect. Dis, 2016, vol. 22, no. 9, pp. 1687-1688. doi: 10.3201/eid2209.160681
41. Tsai Y.-K., Fung C.-P., Lin J.-C., Chen J.-H., Chang F.-Y., Chen T.-L., Siu L.K. Klebsiella pneumoniae outer membrane porins OmpK35 and OmpK36 play roles in both antimicrobial resistance and virulence. Antimicrob. Agents Chemother., 2011, vol. 55, no. 4,pp. 1485-1493. doi: 10.1128/AAC.01275-10
42. Villa L., García-Fernández A., Fortini D., Carattoli A. Replicón sequence typing of IncF plasmids carrying virulence and resistance determinants. J. Antimicrob. Chemother., 2010, vol. 65, no. 12, pp. 2518—2529. doi: 10.1093/jac/dkq347
43. Wang L., Fang H., Feng J., Yin Z., Xie X., Zhu X., Wang J., Chen W., Yang R., Du H., Zhou D. Complete sequences of KPC-2-encoding plasmid p628-KPC and CTX-M-55-encoding p628-CTXM coexisted in Klebsiella pneumoniae. Front. Microbiol., 2015, 6:838. doi: 10.3389/fmicb.2015.00838
44. Weston N., Sharma P., Ricci V., Piddock L.J.V. Regulation ofthe AcrAB-TolC efflux pump in Enterobacteriaceae. Res. Microbiol., 2018, vol. 169, no. 7-8, pp. 425-431. doi: 10.1016/j.resmic.2017.10.005
45. Wu K.M., Li L.H., Yan J.J., Tsao N., Liao T.L., Tsai H.C., Fung C.P., Chen H.J., Liu Y.M., Wang J.T., Fang C.T., Chang S.C., Shu H.Y., Liu T.T., Chen Y.T., Shiau Y.R., Lauderdale T.L., Su I.J., Kirby R., Tsai S.F. Genome sequencing and comparative analysis of Klebsiella pneumoniae NTUH-K2044, a strain causing liver abscess and meningitis. J. Bacteriol., 2009, vol. 191, no. 14,pp. 4492-4501. doi: 10.1128/JB.00315-09
46. Yuan Y., Li Y., Wang G., Li C., Chang Y.F., Chen W., Nian S., Mao Y., Zhang J., Zhong F., Zhang L. BlaNDM-5 carried by a hypervirulent Klebsiella pneumoniae with sequence type 29. Antimicrob. Resist. Infect. Control, 2019, vol. 8:140. doi: 10.1186/ s13756-019-0596-1
47. Zhao W.H., Hu Z.Q. Epidemiology and genetics of CTX-M extended-spectrum ß-lactamases in Gram-negative bacteria. Crit. Rev. Microbiol., 2013, vol. 39, no. 1,pp. 79-101. doi: 10.3109/1040841X.2012.691460
Авторы:
Алексеева А.Е., к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории метагеномики и молекулярной индикации патогенов ФБУН Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора, Нижний Новгород, Россия; Бруснигина Н.Ф., к.м.н., доцент, зав. лабораторией метагеномики и молекулярной индикации патогенов ФБУН Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора, Нижний Новгород, Россия;
Гординская Н.А., д.м.н., старший научный сотрудник лаборатории метагеномики и молекулярной индикации патогенов ФБУН Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора, Нижний Новгород, Россия.
Поступила в редакцию 06.05.2020 Принята к печати 04.07.2020
Authors:
Alekseeva A.E., PhD (Biology), Senior Researcher, Laboratory of Metagenomics and Molecular Indication of Pathogens, Blokhina I.N. Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology of Nizhny Novgorod, Nizhny Novgorod, Russian Federation; Brusnigina N.F., PhD (Medicine), Associate Professor, Head of the Laboratory of Metagenomics and Molecular Indication of Pathogens, Blokhina I.N. Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology of Nizhny Novgorod, Nizhny Novgorod, Russian Federation;
Gordinskaya N.A., PhD, MD (Medicine), Senior Researcher, Laboratory of Metagenomics and Molecular Indication of Pathogens, Blokhina I.N. Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology of Nizhny Novgorod, Nizhny Novgorod, Russian Federation.
Received 06.05.2020 Accepted 04.07.2020
