CC BY
64
БИОТЕХНОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА
Известия ТСХА, выпуск 3, 2009 год
УДК 631.527.5:633.112.9
МОЛЕКУЛЯРНО-ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПЕРВИЧНЫХ ТРИТИКАЛЕ, МЕЖАМФИПЛОИДНОГО ГИБРИДА И ПЕРСПЕКТИВНЫХ ЛИНИЙ СЕЛЕКЦИИ НИИСХ ЮГО-ВОСТОКА
П.Ю. КРУПИН, М.Г. ДИВАШУК, О.В. ХОМЯКОВА*; Т.И. ДЬЯЧУК*, Г.И. КАРЛОВ (Центр молекуля рной биотехнологии)
С помощью молекулярных маркеров и геномной in situ гибридизации были изучены первичные тритикале, межамфиплоидный гибрид (МАГ) и перспективные линии тритикале селекции НИИСХ Юго-Востока. Было показано, что четыре генотипа (первичные амфидиплоиды АД-1, АД-3, и две перспективные линии 491-07 и 497-07) обладают стандартной геномной конституцией гекса-плоидных тритикале. Предполагаемый октаплоид АД-4 оказался пшеничным гексаплоидом с интрогрессией хроматина ржи в субтеломеру одной пары хромосом. Межамфиплоидный гибрид ОГ представляет собой совокупность линий различной геномной конституции, однако большинство растений несут 1D/1R замещение, что открывает широкие перспективы его использовани в селекции на улучшение качества зерна тритикале.
Ключевые слова: Тритикале, цитогенетика, геномная in situ гибридизация, ДНК-маркеры.
В решении проблем производства зерна особую роль может играть внедрение в производство новых видов зерновых культур. Последние должны быть более конкурентоспособными по сравнению с существующими видами, иметь высокую питательную ценность зерна и сочетать высокий потенциал продуктивности с устойчивостью к биотическим и абиотическим стрессам. Особый интерес в этом плане может играть тритикале — межродовой ам-фидиплоид, сочетающий хозяйственно ценные признаки двух видов: пшеницы и ржи. Эта культура уже завоевала по-пул рность во многих регионах мира.
Основное использование культуры тритикале — зернокормовое. Одновременно эта культура признана и как продовольственна . Однако при-
менение тритикале в чистом виде дл целей хлебопечени ограничено из-за низкого содержания клейковины и ее плохого качества. В св зи с этим провод тс интенсивные разработки технологии получени хлебобулочных изделий на основе тритикалевой муки, котора обладает высокой пищевой и биологической ценностью. Хлеб высокого качества из гексаплоидных тритикале можно приготовить из смеси муки тритикале (70%) и сильной пшеницы (30%) или же это соотношение составля ет 1:1 [2,4].
Генетическое улучшение сортов тритикале по хлебопекарным качествам предполагает две возможности. Перва из них — наиболее доступна дл практической селекции — это получение замещений Ш/Ш, которые
* Лаборатория клеточной селекции ГНУ НИИСХ Юго-Востока.
Работа выполнена при финансовой поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» ГК № 02.740.11.0286 с использованием оборудования Центра коллективного пользования.
можно осуществить при межамфипло-идных скрещивани х или при скрещивании гексаплоидных тритикале с мягкой пшеницей. При этом с хромосомой 1Б привнося тся локусы запасных белков ОИ-1 и С1и-1, а элиминация целой х ромосомы 1И с локусами Бес-1 на ее коротком плече и Бес-3 на длинном обеспечивает улучшение хлебопекарных качеств [15].
Второй — более сложный путь — включает цитогенетическую инженерию хромосомы 1И с получением точковых транслокаций в нужных местах [12]. Наря ду с привнесенными локусами ОИ-1 и С1и-1 сохраня ются участки хромосомы 1И, положительно вли ющие на мощность развити корневой системы и другие адаптивные признаки.
Для создания экологически приспособленных сортов тритикале в рекомбинационной селекции первостепенное значение имеет использование генетически разнообразного исходного материала и в первую очередь местного генофонда пшеницы и ржи новейшей селекции. В русле данной селекционной программы в НИИСХ Юго-Востока были получены первичные тритикале, межамфиплоидный гибрид и перспективные линии тритикале: 491-07и 497-07.
Проведение селекционно-генетической работы с любой культурой требует сопровождения цитогенетическими исследовани ми. В случае тритикале такие исследовани еще более актуальны в виду ее аллополиплоидной природы. Кроме того, для тритикале показано широкое использование хромосомных замещений и транслокаций с уменьшением доли генетического материала ржи, что позволя ет решать многие проблемы, характерные для тритикале [6, 19]. Важным этапом в селекционной работе с формами тритикале вл етс вы вление и четка идентификация возможных замещений или транслокаций с определением вовлеченных хромосом.
Цель данной работы — молекул рно-цитогенетическая характеристика ф орм тритикале, созданных в НИИСХ Юго-Востока и наход щихс на различных этапах селекционного процесса.
Материалы и методы
Растительный материал. Семена первичных тритикале АД-1, АД-3, АД-4, межамфиплоидного гибрида (МАГ) и перспективных линий тритикале 491-07 и 497-07 были предоставлены дл анализа ГНУ НИИСХ Юго-Востока. Первичные тритикале АД-1 и АД-3, полученны путем гибридизации твердой пшеницы и сорта ржи Саратовская 6, отличающегося засухо- и морозостойкостью, высокой урожайностью и устойчивостью к мучнистой росе. Для получения предположительно октоплоидного тритикале АД-4 материнской формой служила линия озимой м гкой пшеницы селекции НИИСХ Юго-Востока (Л.15/Белоцер-ковская 51)/(Л.15/Мироновская 25). В качестве опылителя служила диплоидная рожь Саратовская 6. Межамфипло-идный гибрид создан от скрещивани первичных тритикале разного уровн плоидности. Первичные гексаплоидные тритикале получены от скрещивани сортообразца озимой твердой пшеницы селекции Краснодарского НИИСХ Леукурум 1701 Ь389 с диплоидной рожью Саратовская 6 селекции НИИСХ Юго-Востока. Линии 491-07 и 497-7, наход щиес на заключительном этапе селекционного процесса, отличаются скороспелостью, засухоустойчивостью и высокой массой 1000 зерен.
Выделение ДНК. ДНК выделяли из молодых листьев и корешков по методу Бегпа12ку и Тапкв!еу (1986) с некоторыми модификаци ми. Размер выделенной ДНК и степень загр знен-ности РНК оценивали методом электрофореза в 1,5% агарозном геле [1]. Анализ наличия хромосом генома Б у образцов выполн ли по описанной ранее методике [ 1] с помощью следующих ББИ-маркеров: ХЬагс149, ХЬагс271,
Xwmc111, Xgwm349, X barcб, Xbarc270, Xwmc285, Xbarc1183, Xwmc233, X barc110, X barc19б, Xbarc1030, Xwmc432 [20], STS-маркеров Sec1, Sec2 [11], рожь-специфич-ного маркера [ 9], STS-маркера на аллельное состоя ние локуса GIu-D1 [ 7].
Bсe праймеры синтезированы в З AO «Cинтoл»> (Moсквa).
Продукты ПЦР разделяли в 2%-м агарозном геле с буфером TBE при на-пря женности поля б V/см. B качестве маркера размеров использовали «100 bp leader») (Fermentas). После окраши-вани бромистым этидием продукты ПЦР визуализировали с помощью трансиллюминатора и документировали цифровой камерой «NIKON».
Геномна in situ гибридизаци . Геномную in situ гибридизацию осуществляли по стандартной методике [8] с некоторыми модификация ми. Xpo-мосомы контрокрашивали пропидий-йодидом 1 мг/мл. Для визуализации сигнала использовали флуоресцентньй микроскоп AxioZeiss Imager M1 с помощью специального набора фильтров (FITC). Результат документировали на фотокамеру AxioCam Mrm Zeiss
с последующим контрастированием изображения в программе Axiovision software.
Результаты и их обсуждение
Молекулярное маркирование. Первым этапом исследовани был скрининг линий на наличие в их геноме хромосом D-генома и х ромосом ржи. Результаты использовани молекул рных маркеров представлены в таблице.
B нашей работе были использованы микросателлитные маркеры хромосом генома D, по одному маркеру на короткое и длинное плечо соответственно. По наличию амплификации маркеров делали вывод о присутствии в геноме соответствующей хромосомы. B результате нами было показано наличие всех хромосом генома D у ф ормы АД 4. Большинстиво образцов MAГ имели в своем геноме хромосому 1D. Oднaкo следует отметить, что встречались отдельные растения, у которых отсутствовала амплификаци всех микро-сателлитных маркеров, свойственных геному D. B линия х тритикале АД-1, АД-3, 491 и 497 хромосомы генома D обнаружены не были.
Результаты амплификации молекулярных маркеров
Маркер Плечо Хромосомы АД-1 АД-3 АД-4 ОГ 491-07 497-07
Xbarc 149 1DS — — + + — —
Xwmc432 — — + + — —
Glu-D1 1DL — — +* +* — —
Xbarc 271 — — + + — —
Xwmc 111 2DS — — + — — —
Xgwm349 2DL — — + — — —
Xbarc б 3DS — — + — — —
Xbarc 270 3DL — — + — — —
Xwmc 285 4DS — — + — — —
Xbarc 1183 4DL — — + — — —
Xwmc233 5DS — — + — — —
Xbarc110 5DL — — + — — —
Xbarc 196 6DS — — + — — —
Xbarc 1030 6DL — — + — — —
Xwmc506 7DS — — + — — —
Xbarc53 7DL — — + — — —
RYE + + + + + +
Sec-1 1R + + — — + +
Sec-2 2R + + — + + +
«+» наличие амплификации, «—» отсутствие амплификации, * амплификация субъединиц «5+10».
7б
-.*» - - 4 Ч '' а ХПГ " 1- і ,ЛЪ- 6
- ^ /V ч _ Ґ В • * г
Для выявления хроматина генома ржи мы использовали рожь-специ-фичный ДНК-маркер (RYE) [9]. С помощью этого маркера можно идентифицировать даже небольшие ин-трогрессии хроматина ржи [16]. Как видно из таблицы, во всех изучаемых формах присутствовал генетический материал ржи.
В нашей работе также использовались молекул рные маркеры на запасные белки пшеницы и ржи, оказывающие наиболее существенное вли ние на хлебопекарные качества. Кодоми-нантный маркер на локус Glu-D1 по-звол ющий альтернативно определить наличие субъединиц высокомолеку-ля рных глютенинов «5+10» или «2+12» [7]. Одновременно данный маркер может быть использован для дополнительного подтверждения наличия хромосомы 1D. В результате скрининга форм нами было выя влено, что у АД-4 присутствуют гены, кодирующие субъединицы высокомолекул рных глютенинов «5+10». У образцов МАГ также отмечалось присутствие субъединиц «5+10». Однако, как и по микро-сателлитным маркерам, у этой формы наблюдалось расщепление по наличию / отсутствию амплификации.
На секалины мы использовали молекулярные STS маркеры Secl и Sec2, амплификаци которых свидетельствует о наличии в геноме хромосом 1R и 2R соответственно [11]. В результате было выя влено, что у гибрида ОГ отсутствует локус secalinl, кроме нескольких отдельных растений, а у формы АД-4 — оба локуса secalin 1 и secalin 2. Во всех остальных образцах оба локуса присутствовали (таблица).
Геномная in situ гибридизация. Среди проанализированных методом геномной in situ гибридизации генотипов МАГ были выя влены следующие варианты хромосомной конституции: 28П+14Р, 30П+12Р, 30П+14Р, 36П+6Р (где П — число хромосом пшеничных геномов, Р — число х ромосом ржаного генома) (рис. 1).
Рис. 1. Геномная in situ гибридизация отдельных растений гибрида ОхГ со следующим геномным составом: а — 28П+14Р, б — 30П+12Р, в — 30П+14Р, г — 36П+6Р (П - хромосомы пшеницы, Р - хромосомы ржи. Генетический материал ржи имеет желтый цвет, пшеницы — красный.)
Первичные тритикале АД-1, АД-3 и перспективные линии 491-Q7 и 497-Q7 обладают геномной конституцией 28П+14P (рис. 2). В линии АД-3 встречались единичные растени с набором хромосом 27П+13P, в линии 491 — с набором 27П+13P и 28П+15P.
Предполагаемый октаплоидный ам-фидиплоид АД-4 имел в своем генотипе 42 пшеничные хромосомы, при этом одна пара хромосом в субтеломерном участке показала гибридизацию с меткой на рожь (рис. 3).
Форма ОГ. МАГ представляет собой совокупность нескольких линий, что следует из полиморфизма амплификации маркера на х ромосому 1D, а также многообрази геномных вариантов, полученных в ходе геномной in situ гибридизации. Наличие выя вленных замещений и дополнений объ сн ет-ся несбалансированностью D-генома, возникающей при создании вторичных тритикале путем скрещивани окта- и гексаплоидных форм [3, 5]. Отсутствие амплификации маркера Sec-l на хромосому 1R и наличие амплификации
Рис. 2. Геномная in situ гибридизация линий тритикале: а — АД-1, б — аД-3, в — 497, г — 491 (генетический материал ржи имеет желтый цвет, пшеницы — красный)
Рис. 3. Геномная in situ гибридизация линии тритикале АД-4 (генетический материал ржи имеет желтый цвет, пшеницы — красный)
маркеров, локализованных на 1D, в совокупности с результатами геномной in situ гибридизации, свидетельствует о наличии в анализируемых образцах линий с гомеологичным замещением 1D(1R). В случае образца с формулой (30П+14Р), вероя тно, име-
ло место дополнение, что привело к образованию этой 44-хромосомной дисомно-дополненной линии. В на-сто щей работе в качестве маркеров на хромосому 1D кроме микросател-литных был использован STS-маркер на аллельное состояние гена Glu-1. В результате было установлено, что растения МАГ несут в своём геноме аллель «5+10», который отвечает за синтез высокомолекул рных глюте-нинов, обеспечивающих высокие хлебопекарные качества тритикале [13]. Было продемонстрировано отсутствие амплификации маркера на белок се-калин-1 (Sec-1), негативно влияющий на хлебопекарные качества [10]. Следовательно, из формы ОГ возможно вести отбор линий с наличием 1D и отсутствием Ш-хромосомы с использованием молекул рных маркеров.
Таким образом, изучаемый МАГ представл ет собой агрономически ценный селекционный материал, содержащий х ромосомные перестройки, обуславливающие улучшение хлебопекарных качеств. Вместе с тем данный образец вл етс совокупностью линий, геномная конституция которых различна. Дл получени однородного материала рекомендуетс проведение отбора, основанного на молекуля рных и цитогенетических маркерах с последующей оценкой отобранных линий на хлебопекарные качества.
Перепективные линии 49-071, 497-07 и первичные тритикале АД-1 и АД-3. С помощью молекулярных маркеров и геномной in situ в генотипах линий 491-07, 497-07 и первичных тритикале АД-1 и АД-3 не было выя влено каких-либо хромосомных перестроек. Следовательно, они относятся к гек-саплоидным тритикале со стандартной хромосомной конституцией, и их улучшенные свойства обусловлены удачно подобранной комбинацией пшеничных и ржаных генов. Наличие форм с нестандартным числом хромосом в линии 491-07 и пшенично-ржаном амфидиплоиде АД-3 не явля ется для
тритикале редким влением [18]. Кроме того, стоит отметить, что, несмотря на наличие 40- и 43-хромосомных растений, подавля ющее большинство проанализированных образцов имело 42 хромосомы.
Линия АД-4. Результаты цитогенетического анализа позвол ют отнести АД-4 к мягким пшеницам (2n=42), при этом пара хромосом её в субте-ломерном регионе несёт интрогрессию генетического материала ржи (см. рис. 3). Это и обуславливает амплификацию рожь-специфичного маркера (RYE). При этом данна интрогресси вероятнее всего уже присутствовала у родительской пшеничной формы, однако это требует дополнительных исследований. В геноме некоторых сортов пшеницы могут быть небольшие интрогрессии ржаного хроматина, даже у сортов, в родословных которых не было ржи [16]. Кроме того, на примере линии АД-4 можно видеть, что наличие амплификации рожь-специфичного маркера и маркеров на
D-геном совсем не обя зательно может свидетельствовать о том, что данная форма вл етс октаплоидной тритикале. То есть использование только молекул рных маркеров без цитогенетических оценок может привести к получению ложных результатов.
Выводы
1. С помощью молекуля рных маркеров и геномной in situ гибридизации показано, что первичные амфидиплоиды АД-1, АД-3 и две перспективные линии 491-07 и 497-07 обладают стандартной геномной конституцией гексаплоидных тритикале.
2. Предполагаемый октаплоид АД-4 оказался пшеничным гексаплоидом с интрогрессией хроматина ржи в субте-ломеру одной пары хромосом.
3. Межамфиплоидный гибрид ОГ представл ет собой совокупность линий различной геномной конституции, однако большинство растений несут 1D/1R замещение, что открывает перспективы его использовани в селекции на улучшение качества зерна тритикале.
Библиографический список
1. Дивашук М.Г., Карлов Г.И., Соловьев А.А. Использование микросателлитных маркеров для идентификации пшенично-ржаных транслокации у гексаплоидной тритикале // Известия ТСХА, 2007. Вып. 1. С. 61-65.
2. Еркинбаева Р.К. Технологии хлебобулочных изделий из тритикалевой муки // Хлебопечение России, 2004. №4. С. 14-15.
3. Ригин Б.В., Орлова И.Н. Пшенично-ржаные амфидиплоиды. Л.: Колос, 1977.
4. Сокол Н.В., Донченко Л.В., Храмова Н.С., Ковтуненко В.Я., Грищенко С.А. Хлебопекарные свойства из муки из тритикале и перспектива её использования // Известия высших учебных заведений. Пищевая технология, 2006. №1. С. 38-39.
5. Budak H., Baenziger P.S., Beecher B.S., Graybosch R.A., Campbell B.T., Shipman M., Erayman M., Eskridge K.M. The effect of introgressions of wheat D-genome chromosomes into 'Presto' triticale // Euphytica, 2004. Vol. 137. №2. Р. 261-270.
6. Gustafson J.P., Lukaszewski A.J., Robertsjn K. Chromosome substitutions and modifications in hexaploid triticale: a re-evaluation // Genetics and Breeding of Triticale, EUCARPIA meeting, Clermont-Ferrand, 2-5 July, 1984. P. 15-27.
7. Ishikawa G., Nakamura T. A new co-dominant PCR-based marker to identify the high-molecular-weight glutenin subunit combination «5+10» of common wheat // Wheat Information Service, 2007. 103. Р. 1-4.
8. Karlov G.I., Khrustaleva L.I., Lim K.B., Van Tuyl J.M. Homoeologous recombination in 2n-gametes producing interspecific hybrids of Lilium (Liliaceae) studied by genomic in situ hybridization (GISH) // Genome, 1999. Vol. 42. № 4. Р. 681-686.
9. Katto M.C., Endo T.R., Nasuda S.A PCR-based marker for targeting small rye segments in wheat background // Genes & Genetic Systems, 2004. Vol. 79. № 4. Р. 245-250.
10. Kumlay A.M., Baenziger P.S., Gill K.S., Shelton D.R., Graybosch R.A., Lukaszewski A.J.,Wesenberg D.W. Understanding the effect of rye chromatin in bread wheat, 2003. Crop Sci. 43: 1643-1651.
11. Lee J.H., Graybosch R.A., Lee D.J. Detection of rye chromosome 2R using the polymerase chain reaction and sequence-spesific DNA primers // Genome, 1994. Vol. 37. Р. 19-22.
12. Lukaszewski A.J. Cytogenetically Engineered Rye Chromosomes 1R to improve Bread-making Quality of hexaploid triticale / A.J. Lukaszewski // Crop Sci., 2006. Vol. 46. P. 2183-2194.
13. Martinek P., Vinterovac M., Buresovaa I., Vyhnanekc T. Agronomic and quality characteristics of triticale (X Triticosecale Wittmack) with HMW glutenin subunits 5+10 // Journal of Cereal Science, 2008. Vol. 47, Issue 1. Р. 68-78.
14. Payne P.I. Genetics of wheat storage proteins and the effect of allelic variation on breadmaking quality. Annu. Rev. Plant Physiol., 1987. 38: 141-153.
15. Payne P.I., Holt L.M., Jackson E.A., Law C.N. Wheat storage proteins: Their genetics and their potential for manipulation by plant breeding. Philos. Trans. R. Soc. London B Biol. Sci., 1984. 304: 359-371.
16. Ribeiro-Carvalhot C., Guedes-Pintot H., Harrison G., Heslop-harrison J.S. Wheat—rye chromosome translocations involving small terminal and intercalary rye chromosome segments in the Portuguese wheat landrace Barbela // Heredity, 1997. 78. Р. 539-546.
17. Salmon et al. FAO,Triticale improvement and production,2004. P. 27-36.
18. Tsuchiya T. ,Larter E.N. Further results on chromosome stability of hexaploid triticale // Euphytica 20 (1971) : 591-596.
19. Zilinsky F.J. The influence chromosome substitutions in some agronomic characteristics of hexaploid triticale // Hodow. Rosl. Aklimat. I nasien., 1980. Vol. 24, № 4. S. 383-388.
20. http://wheat.pw.usda.gov
Рецензент — д. б. н. А.А. Соловьев
SUMMARY
The primary triticale lines, interamphiploid hybrid and perspective triticale lines have been studied by the microsatellite markers and genomic in situ hybridization. The four genotypes (the primary amphiploids AD-1 and AD-3 and the two perspective lines 491-07 and 497-07) have been shown to possess the standard genomic constitution of hexaploid triticale. The expected octaploid AD-4 has turned out to be the wheat hexaploid with the rye chromatin introgression into the subtelomere of a chromosome pair. The interamphipliod hybrid has been found to be the aggregation of the lines with the different genomic constitution. However, most of the plants of the given sample carries 1D/1R substitution which provides the opportunity to involve it in the breeding for triticale grain quality improvement.
Key words: triticale, cytogenetics, genomic in situ hybridization, DNA markers.
