CC BY
74
Известия ТСХА, выпуск 1, 2007 год
УДК 633.112.9:575.224.234.2:631.523:577.21
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ МАРКЕРОВ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ПШЕНИЧНО-РЖАНОЙ ТРАНС ЛОКАЦИИ У ГЕКСАПЛОИДНОЙ ТРИТИКАЛЕ
М.Г. ДИВАШУК, Г.И. КАРЛОВ, А.А. СОЛОВЬЕВ (Центр молекулярной биотехнологии, кафедра генетики)
С помощью микросателлитных маркеров, специфичных для D-генома пшеницы, изучена линия гексаплоидной тритикале 131/7, несущая пшенично-ржаную транслокацию. Установлено, что в геноме линии 131/7 присутствует длинное плечо 2D хромосомы. Подобраны 3 специфичных микросателлитных маркера на вторую хромосому D генома пшеницы, которые могут быть использованы для быстрого скрининга замещений 2D/R у различных форм гексаплоидной тритикале. Гексаплоидная форма тритикале 131/7 может быть использована в селекционно-генетических программах яровой тритикале, а также для генетических исследований пшенично-ржаных транслокаций.
По данным Всемирной организации ФАО за 2004 г., посевные площади под тритикале неукоснительно растут и составляют более 3 млн га [2]. Это связано с широкими возможностями использования этой новой синтезированной человеком культуры. Одно из важных преимуществ тритикале — способность давать в сравнении с другими культурами высокий урожай, особенно на почвах с невысоким уровнем плодородия в различных климатических условиях. Основными направлениями использования тритикале являются кормовое и техническое для производства спирта [7].
Гексаплоидная тритикале объединяет в своем геноме хромосомы пшеницы (как правило геномы А и В, иногда D) и ржи что позволяет проводить
манипуляции как с количественным составом, так и их соотношением. Использование в селекции форм тритикале с разными хромосомными наборами позволяет решать проблему изменения качественного состава зерна тритикале, укорочения вегетационного периода и др. [4, 9]. Важное значение в селекции тритикале имеют манипуляции с хромосомами D-генома.
На кафедре генетики РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева создана коллекция форм тритикале, различающихся по уровню плоидности, геномному и хромосомному составу. Одной из наиболее интересных в генетическом и селекционном плане является линия гексаплоидной тритикале 131/7. Эта линия превосходит лучшие образцы коллекции тритикале по многим агрономически ценным признакам. Как было показано [13] методом геномной in situ гибридизации, линия 131/7 несет транслокацию пшеничной хромосомы в ржаную, причем короткое плечо и прицентромерная область представлена генетическим материалом ржи, а длинное плечо — генетическим материалом пшеницы. Геномная формула данного тритикале — 28П +12Р + 2Р/П (П — пшеница, Р — рожь, Р/П — рекомбинантная хромосома рожь/пшеница). Также было показано, что данная линия мейотически стабильна. Это может свидетельствовать об участии в транслокации хромосомы D-генома.
Для идентификации чужеродных интрогрессий наиболее широко используются методы молекулярно-генети-
ческого маркирования. Одними из наиболее информативных являются мик-росателлитные маркеры.
Микросателлиты, или SSR — это участки ДНК, состоящие из тандемно повторяющихся коротких единиц размером 1-6 пар нуклеотидов, наследуемых кодоминантно [3]. Они широко распространены в геномах эукариот и имеют высокий уровень полиморфнос-ти. Микросателлиты могут быть расположены в кодирующих и некодиру-ющих областях генома [10].
Среди нескольких наиболее важных систем ДНК-маркеров, микросателлит-ные маркеры показывают наибольший уровень полиморфизма [8]. На данный момент на пшенице и ржи построено несколько молекулярно-генетических карт сцепления с использованием микросателлитных маркеров (http:// wheat.pw.usda.gov), причем установлено, что определенные SSR маркеры являются строго специфичными как для отдельных хромосом, так и для конкретных плеч хромосом. В этом случае по наличию или отсутствию продуктов амплификации микросателлит-ных маркеров после проведения поли-меразной цепной реакции можно судить о наличии или отсутствии участка хромосомы, в котором картирован данный маркер.
Целью данной работы являлась идентификация пшеничного хроматина, вовлеченного в транслокацию на линии гек-саплоидной тритикале 131/7, с помощью микросателлитных маркеров.
Материалы и методы
В работе использовали линию гек-саплоидной тритикале 131/7; в качестве положительного контроля — мягкую пшеницу сорта Иволга, октаило-идную тритикале линию ПРАО-1, линию гексаплоидной тритикале к-1185, несущую 2D/2R замещение; в качестве отрицательного контроля — яровую рожь сорта Селенга, гексап-лоидную тритикале линию 131/16, гек-саплоидную тритикале линию к-1242;
а также образцы твердой пшеницы — сорт Безенчукская янтарная, линию Ш-82775 и гибрид F; тритикале линия 131/7 на рожь сорта Селенга.
Тотальную ДНК выделяли по методу, описанному в [11].
Полимеразную цепную реакцию проводили в 25 мкл реакционной смеси. В 25 мкл ПЦР-смеси содержалось: 70 мМ Трис- НС1, рН 8,6 (25°С), 0,001% Тритон X 100, 16,6 мМ (МН4)^04, 1,5 мМ Mg С12, 0,25 мМ каждого dNTP (Силекс М), 0,5 мкМ каждого прайме-ра, 100-150 нг ДНК и 1 ед. Taq-поли-меразы («Силекс М», Москва).
Для проведения анализов были отобраны следующие микросателлитные маркеры, специфичные для длинных плеч хромосом D-генома: ХЬагс271 — 1DL; Xgwm349, Xgwm539, Xgwm301 — 2DL; ХЬагс270 — 3DL; ХЬагсИ83 — 4DL; ХЬагсИО — 5DL; ХЬагс96 — 6DL; ХЬагс53 — 7DL.
Праймеры синтезированы в ЗАО «Синтол», Москва. Условия ПЦР: t 94,0°С — 2 мин, далее 35 циклов t 94,0°С — 1 мин, температура, специфичная для каждой пары прайме-ров — 45 с, t 72,0°С — 30 с, конечная элонгация t 72,0°С — 7 мин. ПЦР проводили на амплификаторах «Терцик-МЦ2» («ДНК-Технология», Москва). Детекцию полученных результатов проводили в 2%-м агарозном геле.
Результаты и их обсуждение
На основании литературных данных были выбраны микросателлитные маркеры, специфичные для длинного плеча каждой хромосомы D-генома: ХЬагс271 — 1DL, Xgwm349 — 2DL; ХЬагс270 — 3DL; ХЬагсН83 — 4DL; ХЬагсИО — 5DL; ХЬагс96 — 6DL; ХЬагс53 — 7DL (рис. 1). На рис. 1 стрелками показаны использованные в нашей работе микросателлитные маркеры. По карте сцепления можно увидеть, что все они расположены в дис-тальной части длинных плеч хромосом, что должно обеспечивать их амплифи-
111 ц
II Ii
IM*"» 7Г>«-<
о
г-
КЖШШЩЦЩЩШ! I
л?;«а й S5S Ssî6SiJE8SiaiSïSS5S=;ss s; г
asa 3
11 цц цц u^i^L'üuiüij^n^i'iMmtiir^i^^^
'* ---- "sis a ssíssííscccssssssssss i
ixii жшщ
oi.j.a^tgujljKjjj^jjj sádsécs ss t Hit ssuasssi siss
го
cl
x
л
x x
го
с; о с о
x
ф *
о п; о с: о го
О.
о
x
го
СО
го
с
ф
о. 1-о
>
о сп го
"о
ел
го ф
х:
о
x
ш
го h-CL
го ^
о; го
м О ф т s
H
ф
X
ф
cl m к о ц cl ^ ш
ф о.
Ц ГО " ф
Ь О
ю
кацию при вовлечении того или иного плеча хромосомы в изучаемую нами транслокацию.
В качестве контроля нормального прохождения ПЦР использованы мягкая пшеница сорта Иволга и октапло-идная тритикале — линия ПРАО-1, имеющие в своем составе все хромосомы D-генома. В контрольных образцах используемые нами SSR маркеры демонстрировали наличие ПЦР-продук-та после амплификации.
После проведения полимеразной цепной реакции и электрофореза амп-ликонов результатов в 2%-м агарозном геле получены следующие результаты на линии 131/7. Хромосомноспеци-фичные микросателлитные маркеры D — генома ХЬагс271 (ГО), ХЬагс270 ХЬагс1 183 ХЬагс110 (5D),
ХЬагс96 (6D), ХЬагс53 (7D) отсутствуют в геноме линии гексаплоидного тритикале 131/7. После проведения ПЦР на микросателлитный маркер Xgwm349, являющийся специфичным для 2DL, обнаружено, что у линии 131/7 амп-лифицируется фрагмент ожидаемого размера 243 Ьр (рис. 2).
На рис. 2 представлены результаты электрофореза в агарозном геле после амплификации с праймерами маркера Xgwm349 на ряде образцов. Как можно видеть, продукт амплификации маркера Xgwm349 отсутствует у следую-
Хд\лип349 (243 Ьр)
щих образцов: гексаплоидная тритикале (геномный состав AABBRR), твердая пшеница (геномный состав ААВВ). В то же время продукт амплификации присутствовал у следующих образцов: мягкая пшеница (геномный состав AABBDD), октаплоидная тритикале (геномный состав AABBDDRR), линия к-1185 — гексаплоидная тритикале, несущая 2D/2R замещение, линия гек-саплоидной тритикале 131/7 и у гибридов линии 131/7 с рожью. Полученные результаты свидетельствуют, во-первых, о том, что данный маркер является специфичным для 2D хромосомы (амплификация на замещенной форме к-1185 и отсутствие амплификации на полнокомплектных гексапло-идных образцах тритикале), во-вторых, что линия гексаплоидной тритикале 131/7 несет в своем геноме длинное плечо 2D хромосомы. Следует отметить, что в настоящее время в длинном плече 2D хромосомы пшеницы уже картирован ряд хозяйственно ценных признаков [1, 5, 6, 12].
Для проверки полученных результатов нами были подобраны дополнительно еще два микросателлитных маркера, специфичных для длинного плеча 2D хромосомы — Xgwm539 и Xgwm301. Результаты электрофореза приведены на рис. 3, из которого видно, что маркеры Xgwm539 и Xgwm301
»•■•■■•» »•••••••« шн,.» «к* «мим щтт тми «им»
Т 7 8 «
¡ГГГЬС^НЬ-Ь-Ь-НН
Рис. 2. Результаты ПЦР на маркер Xgwm349. Д-2-1а, Д-2-16 — мягкая пшеница сорта Иволга; Д-6-1 — октаплоидная тритикале линия ПРАО-1; Д-8-1а, Д-8-1-6 — гексаплоидная тритикале линия 131/16; Д-12-1а, Д-12-16 — твердая пшеница сорта Безенчукская янтарная; Д-7-1а, Д-7-16 — твердая пшеница линия Ю-82775; Д-13-1а — гибрид F, 31/7 х рожь сорта Селенга; Ч.Т.-1, Ч.Т.-2 — гексаплоидная тритикале линия к-1242; к-1185 — линия гексаплоидная тритикале с 2D/2R замещением; Т-2, Т-3, Т-4, Т-5, Т-6, Т-7 — гексаплоидная тритикале линия 131/7
Xgwm539(143-157 bp)
Xgwm301 (171 bp)
Рис. 3. Результаты ПЦР на Xgwm539 и Xgwm301. Д-2-1 — мягкая пшеница сорта Иволга; Д-12-1 — твердая пшеница сорта Безенчукская янтарная; Ч.Т.-1 — гексаплоид-ная тритикале линия к-1242; Рожь-1 — яровая рожь сорта Селенга; Т-2 — гексаплоидная тритикале линия 131/7
присутствуют в геноме линии гексап-лоидной тритикале 131/7, это подтверждает результаты, полученные с маркером Xgwm349.
Таким образом, линия гексаплоид-ного тритикале 131/7 несет в своем геноме длинное плечо 2D хромосомы. Подобраны 3 специфичных микросателлит-ных маркера на вторую хромосому D-генома пшеницы, которые могут быть использованы для быстрого скрининга 2D/R-замещений и транслокаций с участием 2D хромосомы у различных форм гексаплоидной тритикале.
ЛИТЕРАТУРА
1. Breseghello Flavio, Sorrells Mark E. // Genetics, 2006, 172: 1165-1177. — 2. FAO Plant Production and Protection Paper. 179. Triticale improvement and production. Ed. M. Mergoum. FAO, Rome, 2004. — 3. Johansson М., Ellegren H., Adersson L. // Heredity, 1992, 83, 196— 198. — 4. Lukaszevski A.I. // Genome,
1994, 37, 945-949. — 5. Mardi М., Bu-erstmayr H., Ghareyazie B. et al. // Plant Breeding, 2005, 124, 329-333. — 6. Prasad М., Varshney R.K., Kumar A. et al. // Theoretical and Applied Genetics, 1999, 99:341-345. — 7. Preifer W.A. // Triticale: Today and Tomorrow, 1996, 551-580. — 8. Russell J.R., Fuller J.D., Macaulay M. et al. // Theoretical and Applied Genetics, 1997, 95, 714-722. — 9. Schlegel R. // Triticale: Today and Tomorrow, 1996, 2531. — 10. Tyth G., G6sp6ri Z., Jurka J. // Genome Research, 2000, 10, 967-981. — 11. Van der Beek J.G., Verkerk K., Zabel P., Lindhout P. // Theoretical and Applied Genetics, 1991, 84: 106-112,— 12. Varshney R.K., Prasad М., Roy J.K. et al. // Cereal Research Communications, 2001, 29(1-2), 33-40. — 13. Карлов Г.И., Андреева Г.Н., Хрусталева ЛИ., Соловьев А.А Характеристика линии тритикале, несущей пшенично-ржаную транслокацию // Сельскохозяйственная биотехнология. Изб. работы. Т. 1. М.: Воскресение, 2000. С. 39-43. — 14. Материалы сайта http: / / wheat.pw.usda.gov
SUMMARY
With the help of microsatellite markers, specific for wheat D-genome, hexaploid triticale 131/7 line having wheat-rye translocation has been studied. Three specific microsatellite markers for the second chromosome of wheat D-genome have been sorted out that can be used for quick screening of 2D/R substitutions with various forms of hexaploid triticale hybrid. The presence of 'long shoulder' of 2D chromosome has been found out. Hexaploid triticale 131/7 form can be used in genetic selection programmes of spring triticale and also for genetic research into wheat-rye translocations.
