CC BY
61
УДК 633.112.9:631.528:632.168
ИЗУЧЕНИЕ ОБРАЗЦОВ ОЗИМОЙ ТРИТИКАЛЕ НА НАЛИЧИЕ ХРОМОСОМНЫХ ЗАМЕЩЕНИЙ И ИХ СВЯЗЬ С УСТОЙЧИВОСТЬЮ К ПРОРАСТАНИЮ НА КОРНЮ
М.С. БАЖЕНОВ1, М.Г ДИВАШУК2, В.В. ПЫЛЬНЕВ1, Г.И. КАРЛОВ2, В.С. РУБЕЦ1
(1 Кафедра селекции и семеноводства полевых культур, 2 Центр молекулярной биотехнологии РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева)
Работа выполнена на материале селекционной станции имени П.И. Лисицына РГАУ имени К.А. Тимирязева. С помощью ПЦР проанализировано наличие R/D-замещений и транслокаций у образцов коллекционного питомника озимой тритикале. Сортообразцы Александр, Валентин, Ставропольский 2, Фиделио и КП-08-№2 обладают нормальным хромосомным набором гексаплоидной тритикале. Образец 21759/97 имеет 2R/2D хромосомное замещение. Показана связь между наличием данного замещения и устойчивостью к предуборочному прорастанию зерна в колосе.
Ключевые слова: озимая тритикале, хромосомное замещение, ПЦР, прорастание на корню.
Тритикале — новый род культурных растений семейства злаковых (Poaceae Barnhart), созданный человеком путем гибридизации пшеницы с рожью, и представляющий собой совокупность аллополиплоидов различного геномного состава. В настоящее время наибольшее распространение в сельском хозяйстве получила гек-саплоидная тритикале (2n=42) с геномной формулой AABBRR [8], которую выращивают для получения зерна и зеленого корма.
Зерно тритикале, обладающее высокой активностью амилаз и меньшим содержанием пентозанов по сравнению с зерном ржи, может быть использовано для производства этилового спирта без добавления ферментативных препаратов [15]. Низкое качество клейковины и высокая активность гидролитических ферментов делают муку тритикале мало пригодной для хлебопечения. Для производства хлеба в нее. как правило, приходится добавлять от 10 до 50% муки сильной пшеницы [9].
Частой причиной снижения урожайности и качества зерна тритикале является его прорастание в колосе, вызываемое атмосферными осадками в предуборочный период [6, 22, 23]. Основной способ решения данной проблемы — создание устойчивых к прорастанию на корню сортов [1, 6]. Существуют три основных подхода в селекции на устойчивость к прорастанию в колосе. Главным из них считается увеличение периода физиологического покоя семян после созревания [1, 22]. Второй путь — отбор растений с особой морфологией колоса, не позволяющей воде задерживаться на нем и проникать к зерну — грубый восковой налет, отсутствие опушения, рыхлость колоса, безостость и т.д. [14]. Третий путь — борьба с последствиями
явного и «скрытого» прорастания — отбор на пониженную активность амилаз зерна [1, 17]. Существуют и другие пути селекции на это свойство.
Известно, что улучшение гексаплоидной тритикале по многим хозяйственно значимым признакам и свойствам может быть осуществлено за счет привнесения в ее геном фрагментов генома Б мягкой пшеницы путем хромосомных замещений либо транслокаций [3, 4]. Было показано, что наиболее сильное и положительное влияние на устойчивость к прорастанию на корню оказывают 3И/3Б и 2И/2Б хромосомные замещения [22].
Первые существенные шаги по улучшению тритикале связаны именно с 2И/2Б-замещением. Старые формы и сорта тритикале, несмотря на то что давали большую биомассу, были чрезвычайно позднеспелыми, высокорослыми, чувствительными к длине дня и имели сильно морщинистое, щуплое зерно. Привнесение генов фотопериодической нейтральности и короткостебельности (ЯЫ8) вместе с 2Б-хромосомой позволило исправить некоторые из этих недостатков [23]. Вот почему получение, выявление и использование в селекции И/Б-замещенных линий весьма актуально.
Целью нашей работы было выявление форм тритикале с И/Б-замещениями и изучение признаков и свойств, связанных с данными замещениями.
Материал и методика
Нами было проанализировано шесть образцов тритикале: из коллекционного питомника — сорта Фиделио, Ставропольский 2 и образец 21759/97; собственной селекции — сортообразцы Валентин, Александр и КП-08-№2. Весь изучаемый материал выращивали на полях Селекционной станции имени П.И. Лисицына в 2008-2009 гг. Площадь делянки 1 м2, повторность 3-кратная.
Характеристика образцов тритикале по устойчивости к прорастанию зерна в колосе давалась путем подсчета доли проросших зерен во влажной камере на 8-е сутки. Колосья после уборки просушивали в течение одной недели, связывали в снопики по 10 шт., намачивали путем погружения в воду на 2 мин и помещали в полиэтиленовые пакеты. В течение восьми дней ежедневно производили дополнительное увлажнение из пульверизатора. После этого колосья высушивали на открытом воздухе, обмолачивали на молотилке и производили подсчет доли проросших зерен. Провокация прорастания в колосьях осуществлялась при естественных температурных условиях в открытом помещении, в тени. С каждой делянки было взято по 10 колосьев.
Уровень покоя семян определяли путем вычисления взвешенного индекса прорастания (ИП) вымолоченных зерен в чашках Петри по Walker-Simmons [24]
с модификацией для 14 дней испытания: ИП = (14хп\ +13хп2 + —+1х,
В х N
где п1, п2, ... п14 — число вновь проросших зерен за первые, вторые и последующие сутки; N — общее число зерен; В — общее число дней испытания; 14, 13, ..., 1 — веса, данные числам проросших зерен в первый, второй и последующие дни соответственно. Максимальный ИП=1,0. Для проведения данного испытания колосья каждого сорта убирали с поля в фазу восковой спелости зерна. Зерна вымолачивали из колоса вручную и немедленно укладывали в чашки Петри (ё = 10 см) бороздкой вниз на два слоя фильтровальной бумаги, смоченной 10 мл дистиллированной воды. Проращивание проводили при нерегулируемой температуре (22-26°С). Для опреде-
ления индекса прорастания с каждой делянки было отобрано по три типичных колоса. Зерна, вымолоченные из колосьев с одной делянки, смешивали. В чашку Петри помещали по 25 случайно взятых из объединенной пробы зерен. Повторность лабораторного опыта соответствует полевой — 3-кратная.
Среднее время прорастания вычисляли по формуле, приведенной в обзоре к к
Ranal и Santana [19]: t = ^ nttt / ^ ni, где ti — промежуток времени от начала экс-
i =1 i=1
перимента до наблюдения i (дни или часы); ni — число вновь проросших семян от наблюдения i-1 до наблюдения i; к — последнее наблюдение, связанное с окончанием прорастания.
ДНК выделяли из молодых листьев и корешков по методу Bernatzky и Tanksley [10] с некоторыми модификациями. Размер выделенной ДНК и степень загрязненности РНК оценивали методом электрофореза в 1,5%-м агарозном геле.
Анализ наличия хромосом генома D у образцов выполняли по описанной ранее методике [2] с помощью следующих SSR-маркеров: Xbarc149, Xbarc271, Xwmc111, Xgwm349, Xbarc6, Xbarc270, Xwmc285, Xbarc1183, Xwmc233, Xbarc110, Xbarc196, Xbarc1030, Xwmc432 [25], STS-маркеров Sec1, Sec2 [16], рожьспецифичного маркера [13], STS-маркера на аллельное состояние локуса Glu-D1 [11].
Все праймеры синтезированы в ЗАО «Синтол» (Москва).
Продукты ПЦР разделяли в 2%-м агарозном геле с буфером TBE при напряженности поля 6 V/см. В качестве маркера размеров использовали «100 bp leader» (Fermentas).
Для статистической обработки данных использовали однофакторный дисперсионный анализ, критерий Стьюдента (при вычислении НСР), коэффициент корреляции Пирсона, коэффициент контингенции Пирсона и коэффициент ассоциации Юла [7].
Результаты и их обсуждение
По результатам оценки образцов во влажной камере неустойчивыми к прорастанию в колосе оказались сорта Валентин и Фиделио (таблица). Доля проросших зерен в колосьях других образцов тритикале не отличалась значимо от нуля.
Индекс прорастания отражает уровень покоя семян, который считается главным фактором устойчивости зерна к прорастанию в колосе [20, 1]. Сопоставление индекса прорастания с долей проросших зерен в колосе во влажной камере не по-
Некоторые показатели устойчивости образцов тритикале к предуборочному прорастанию в колосе
Образец Доля проросших зерен в колосе во влажной камере на 8-е сут. Индекс прорастания Среднее время прорастания зерна в чашке Петри, сут.
21759/97 0,03 0,58 6,9
Александр 0,04 0,50 8,0
Валентин 0,20 0,75 4,5
КП-08-№2 0,00 0,69 5,4
Ставропольский 2 0,02 0,71 5,1
Фиделио 0,10 0,77 4,2
НСР05 0,09 0,13 1,8
казало статистически значимой связи между данными показателями. Высокие индексы прорастания, практически не отличающиеся друг от друга, отражают слабый послеуборочный покой семян сортообразцов Валентин, Фиделио, Ставропольский 2 и КП-08-№2. Образцы Александр и 21759/97 показали средний уровень покоя семян (см. таблицу).
Из всего этого можно заключить, что при общем низком уровне покоя семян у тритикале на первый план выступают иные факторы устойчивости к прорастанию на корню. Так, зерно сортообразцов Ставропольский 2 и КП-08-№2 плотно заключено в чешуи колоса, что, по-видимому, препятствует его быстрому увлажнению и задерживает прорастание (см. таблицу).
Между индексом прорастания и средним временем прорастания имеется функциональная зависимость: ВП = -14ИП + 15, где ВП — время прорастания в сутках; ИП — 14-дневный индекс прорастания. Данная зависимость наблюдается только лишь в том случае, если за период наблюдения (14 дней, исключая день закладки опыта) прорастут все зерна. Преимущество среднего времени прорастания состоит в том, что эта величина, в отличие от индекса, имеет размерность (сутки, часы и т.д.), что существенно упрощает статистическую обработку и интерпретацию данных. Если же процесс прорастания в установленный срок не завершился, то вычисление среднего времени становится невозможным без продления наблюдений. Однако в последнем случае будет иметь место корреляция между индексом прорастания, вычисленным за 14 дней, и средним временем прорастания, найденным по завершению прорастания. Таким образом, индекс прорастания позволяет более эффективно использовать данные, полученные за ограниченный срок наблюдения.
В результате испытания во влажной камере сорт Валентин показал больший процент проросших зерен, чем сорт Фиделио, несмотря на то, что первый имеет нео-пушенный колос с достаточно сильным восковым налетом (см. таблицу). Возможно, здесь проявляется действие еще одного фактора, скорее всего, ингибиторов прорастания, вырабатывающихся в чешуях колоса Фиделио.
Таким образом, изучаемые сортообразцы различаются по устойчивости к предуборочному прорастанию. Подобная устойчивость могла быть обусловлена R/D -замещениями.
Для поиска всех возможных R/D-замещений у исследуемых сортообразцов мы использовали микросателлитные маркеры хромосом генома D, по одному маркеру на короткое и длинное плечо соответственно. По наличию амплификации маркеров делали вывод о присутствии в геноме соответствующей хромосомы. Для выявления наличия генетического материала ржи мы использовали рожьспецифичный ДНК-маркер (RYE) [12], молекулярные маркеры на запасные белки пшеницы и ржи, кодоминантный маркер на локус Glu-Dl и молекулярные STS-маркеры Secl и Sec2 [11, 16]. Данные маркеры также могут показывать наличие хромосом 1D, 1R, 2R соответственно.
ПЦР-анализ с использованием вышеприведенных молекулярных маркеров показал отсутствие каких-либо замещений или интрогрессий генома D у образцов Александр, Валентин, Фиделио, Ставропольский 2 и КП-08-№2. С помощью SSR-маркеров было выявлено, что растения образца 21759/97 несут в своем геноме хромосому 2D либо ее фрагменты — это проявлялось в амплификации маркеров Xwmc111 и Xgwm349, локусы которых расположены в коротком и длинном плече 2D-хромосомы соответственно.
Применение дополнительных маркеров, специфичных для хромосомы 2D (Xbarc228, Xbarc1143, Xgwm539, Xgwm301, Xgwm102, Xgwm157, Xbarc168,
Xgwm484, Xwmc111, Xgwm261) подтвердило наличие у образца 21759/97 целой хромосомы 2D. Одновременно у растений этого образца отсутствовала хромосома 2R, судя по отсутствию амплификации STS- маркера гена Sec2. Наличие других хромосом D генома у растений образца 21759/97 с помощью SSR-маркеров, используя по одному маркеру на каждое хромосомное плечо, не было выявлено. Кроме того, положительные результаты при ПЦР-анализе дали маркеры Sec1 (на первую хромосому ржи) и RYE (маркер, позволяющий находить интрогрессии ржаной ДНК в геном пшеницы). Наличие R/D-замещения подтверждается также морфологическими особенностями тритикале 21759/97, характерными для мягкой пшеницы: формой зародыша зерна, раннеспелостью, относительной низкорослостью и способностью давать зерно высокого качества.
Во время проведения амплификации SSR- и STS-маркеров на 2D и 2R хромосомы было обнаружено, что часть растений изучаемого образца 21759/97 не несет замещения либо является гетерозиготной. Анализ большей по объему выборки (70 вегетирующих в поле растений) с использованием молекулярных маркеров показал, что 80% растений 21759/97 имеют 2D-хромосому при отсутствии 2Я-хромосомы, 11% растений несут обе хромосомы и 9% растений имеют хромосому 2R при отсутствии 2D-хромосомы. Таким образом, изучаемый нами образец коллекционного питомника на самом деле представляет собой популяцию. Большая часть растений данной популяции имеет 2R/2D замещение. Однако в ней присутствует существенная доля гетерозиготных и растений без 2D-хромосомы. Вероятнее всего, это результат перекрестного опыления с нормальными гексапло-идными тритикале.
Несмотря на то, что в целом образец тритикале 21759/97 характеризуется как достаточно устойчивый к прорастанию на корню, все же среди его семян урожая 2009 г. были обнаружены проросшие и слегка наклюнувшиеся зерна. При выборе примерно одинакового числа зерен с явными признаками прорастания и без признаков прорастания нам удалось получить 14 проростков из наклюнувшихся в колосе зерен и 15 — из непроросших зерен. С помощью ПЦР-анализа нами было установлено наличие 2D- и 2Я-хромосом в геноме проростков.
Среди четырнадцати проростков, полученных из наклюнувшихся в колосе зерен, половина имела 2Я-хромосому. Причем пять из них имели хромосому 2R совместно с 2D, т.е. они были гетерозиготами, а два — несли 2Я-хромосому в чистом виде. Среди растений, полученных из непроросших в колосе зерен, практически все (14 из 15-и) были гомозиготны по 2D-хромосоме, и лишь одно растение несло 2R- совместно с 2D-хромосомой.
Так как сравнение выборок по критерию %2-Пирсона в данном случае невозможно вследствие малой численности класса растений с 2Я-хромосомой, то мы использовали в данном случае коэффициент ассоциации Юла (Q) и коэффициент кон-тингенции Пирсона (ф), показывающие, существует ли связь между исследуемыми факторами, но не отражающие ее тесноту. В связи с этим нами была принята гипотеза следующей взаимосвязи — при наличии в геноме тритикале хромосомы 2R у образца 2I759/97 снижается устойчивость зерна к прорастанию в колосе. Расчет коэффициента ассоциации Юла (Q=0,87) и коэффициента контингенции Пирсона (ф=0,48) подтверждает существование взаимосвязи в данном случае, так как связь между двумя качественными признаками считается подтвержденной, если Q>0,5, а ф>0,3 [7]. Кроме того, следует обратить внимание на то, что количество растений с хромосомой 2R в общей совокупности всех растений образца 21759/97 равно приблизительно 20%, а в образцах, полученных из проросших зерен, — 50%.
Влияние 2R/2D-замещения на устойчивость тритикале к прорастанию на корню, скорее всего, является комплексным. С одной стороны, устойчивость может объясняться отсутствием 2Я-хромосомы, которая, как было показано, несет в себе QTL, влияющий на прорастание зерна в колосе. С другой стороны — наличие 2D-хромосомы обуславливает раннеспелость, которая в большинстве климатических условий обеспечивает более глубокий покой семян [20]. Низкорослость растений, обуславливаемая геном Rht8 в 2D-хромосоме, сама по себе не должна способствовать устойчивости к прорастанию на корню, так как колосья растений оказываются в более влажном и менее подвижном припочвенном слое воздуха, который не позволяет им быстро просохнуть после дождя. В то же время ген короткостебельности может в результате плейотропного действия дать устойчивость к прорастанию в колосе за счет снижения чувствительности клеток алейронового слоя и зародыша зерна к ги-береллинам [17].
Выводы
1. Сортообразцы Валентин и Фиделио имеют пониженную устойчивость к прорастанию зерна в колосе. Александр, 21759/97, Ставропольский 2 и КП-08-№2 отличаются повышенной устойчивостью к прорастанию зерна, причём у первых двух это обусловлено более глубоким покоем семян.
2. В результате проведенных нами исследований выявлено, что образец тритикале 21759/97 является популяцией по 2К/2Б-замещению.
3. Наличие 2К/2Б-замещения приводит к повышению устойчивости к прорастанию на корню и усилению признаков, характерных для мягкой пшеницы.
4. С помощью используемых нами молекулярных маркеров не выявлено наличие каких-либо замещений или интрогрессий генома D у сортообразцов Александр, Валентин, Фиделио, Ставропольский 2 и КП-08-№2.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и образования РФ, ГК 02.740.11.0286.
Библиографический список
1. Беркутова Н.С., Буко О.А. Оценка и отбор зерновых культур на устойчивость к прорастанию в колосе. М.: ВНИИТЭИ Агропром, 1982.
2. ДивашукМ.Г., Карлов Г.И., Соловьев А.А. Использование микросателлитных маркеров для идентификации пшенично-ржаных транслокаций у гексаплоидной тритикале // Известия ТСХА, 2007. Вып. і. С. 61-65.
3. ДивашукМ.Г., Крупин П.Ю., СоловьевА.А., КарловГ.И. Молекулярно-цитогенетическая характеристика линии яровой тритикале 131/7, несущей ржано-пшеничную транслокацию // Генетика, 2010. Т. 46, № 2. С. 211-217.
4. Крупин П.Ю., ДивашукМ.Г., Хомякова О.В., Дьячук Т.И., Карлов Г.И. Молекулярно-цитогенетичекая характеристика первичных тритикале, межамфидиплоидного гибрида и перспективных линий селекции нИиСХ Юго-Востока // Известия ТСХА, 2009. Вып. 3. С. 74-80.
5. Практикум по селекции и семеноводству полевых культур / Под ред. В. В. Пыльнева. М.: КолосС, 2008.
6. Сергеев А.В. Селекция, семеноводство и возделывание тритикале. М.: ВНИИТЭИ Агропром, 1989.
7. Теория статистики / Под ред. проф. Р.А Шмойловой. М.: Финансы и статистика, 1996.
8. Частная селекция полевых культур / В. В. Пыльнев, Ю. Б. Коновалов, Т. И. Хупаца-рия и др. М. : КолосС, 2005.
9. Шевченко В.Е. Тритикале. Воронеж : ВГАУ, 1997.
10. Bernatzky, R., Tanksley S.D. Genetics of actin-related sequences. Theor. Appl. Genet., І986. 72: 3І4-32І.
11. Ishikawa G., Nakamura T. A new co-dominant PCR-based marker to identify the high-molecular-weight glutenin subunit combination “5+10” of common wheat // Wheat Information Service, 2007. І03. P. І-4.
12. Kato et al. Germination and growth inhibitors from wheat (Triticum aestivum L.) husks. J. Agric. Food Chem., 2002. Vol. 50. No. 22. Pp. 6307-63І2.
13. Katto M.C., Endo T.R., Nasuda S.A. PCR-based marker for targeting small rye segments in wheat background // Genetics & Genetic Systems, 2004. Vol. 79. № 4. P. 245-250.
14. King R. W., Wettstein-Knowles P. Epicuticular waxes and regulation of ear wetting and pre-harvest sprouting in barley and wheat. // Euphytica, 2000. ІІ2: І57-І66.
15. Kucerova J. The effect of year, site and variety on the quality characteristics and bioethanol yield of winter triticale // Journal of the Institute of Brewing & Distilling, 2007. ІІЗ: І42-І46.
16. Lee J.H., Graybosch R.A., Lee D.J. Detection of rye chromosome 2R using the polymerase chain reaction and sequence-spesific DNA primers // Genome, І994. Vol. 37. P. 19-22.
17. Marva et al. a-Amylase and programmed cell death in aleurone of ripening wheat grains. Journal of Experimental Botany, 2006. Vol. 57, No. 4. Pp. 877-885.
18. Masojc P. Three classes of loci controlling preharvest sprouting in rye (Secale cereale L.) discerned by means of bidirectional selective genotyping (BSG). Euphytica (2009) 170:123-129.
19. RanalM.A., De Santana D.G. How and why to measure the germination process? // Revista Brasil. Bot., 2006. V29. №.1. P. І-ІІ.
20. Reddy L. V. et. al. Effect of temperature on seed dormancy of wheat // Crop Science, І985 Vol. 25. P. 455-458.
21. Ren Xiao-bo et. al. Mapping QTLs for pre-harvest sprouting tolerance on chromosome 2D in a synthetic hexaploid wheat^common wheat cross // J Appl Genet., 2008 49(4). Pp. 333-34І.
22. Rybka K. An approach to identification of rye chromosomes affecting the pre-harvest sprouting in triticale // J. Appl. Genet. 44(4), 2003. Pp. 49І-496.
23. Triticale improvement and production: FAO Plant production and protection paper — І79; edited by Mohamed Mergoum and Helena Gomez-Macpherson; FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS. Rome, 2004. — І72 pg. — Режим доступа: http://www.fao.org/docrep/009/y5553e/y5553e00.HTM (24 мая 20І0).
24. Walker-Simmons M. Enhancement of ABA responsiveness in wheat embryos by high temperature // Plant, Cell and Environment (І988) ІІ, 769-775.
25. http://wheat.pw.usda.gov
26. http://www.desicca.de/Rye%20gene%20map/index.html
Рецензент — д. б. н. А. А. Соловьев
SUMMARY
The research is done using materials of plant breeding station named after Lisitsin (Timiryazev Academy).Presence of both R/D substitutions and translocations in winter triticale nursery samples have been analyzed by means of PCR method. Alexander, Valentine, Stavropolskiy 2, Fidelio and KP-08-№2 varieties are found to have normal number of chromosomes of hexaploid triticales. 21759/97 is found to have 2R/2D chromosome substitution. Connection between this substitution and resistance to pre-harvest sprouting has been determined.
Key words: winter triticale, chromosomal substitution, PCR, germination on root.
Баженов Михаил Сергеевич — асп. кафедры селекции и семеноводства полевых культур. E-mail: bajenovmi@mail.ru.
Дивашук Михаил Георгиевич — к. б. н. Эл. почта: Divashuk@gmail.com.
Пыльнев Владимир Валентинович — д. б. н. Тел. (499) 976-12-72.
Карлов Геннадий Ильич — к. б. н. Эл. почта: karlov@timacad.ru
Рубец Валентина Сергеевна — к. б. н. Тел. (499) 976-12-72.
