CC BY
22
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ НЕКОТОРЫХ ХВОЙНЫХ ВИДОВ РАСТЕНИЙ В ПЕРМСКОМ КРАЕ
Нечаева Юлия Сергеевна
м.н.с., аспирант, Пермский государственный национальный исследовательский университет (ПГНИУ), Естественный научный институт ПГНИУ г. Пермь Боронникова Светлана Витальевна
доктор биологических наук, профессор, зав. кафедрой ботаники и генетики растений, в.н.с., Пермский государственный национальный исследовательский университет (ПГНИУ), Естественный научный институт ПГНИУ г. Пермь
Пришнивская Яна Викторовна
инженер-исследователь, магистрант, Пермский государственный национальный исследовательский университет
(ПГНИУ), Естественный научный институт ПГНИУ г. Пермь
Изучение генетического разнообразия основных лесообразующих пород крайне важно для обоснования долгосрочных программ неистощительного пользования лесными биологическими ресурсами и воспроизводства ценного генофонда при выполнении селекционных мероприятий. В настоящее время трудно переоценить значение генетических исследований для сохранения биологического разнообразия и его воспроизводства при хозяйственном использовании [1]. Генетическая структура определяет адаптивный потенциал и устойчивость природных популяций, поэтому для разработки стратегии сохранения и рационального использования лесных ресурсов необходимы глубокие знания их генетического разнообразия. Одним из основных методов изучения динамики состояния генофондов является молекулярно-ге-нетический анализ полиморфизма ДНК [2].
Исследованы четыре популяции двух видов хвойных растений из семейства Pinaceae: ель сибирская (Picea obovata Ledeb.) и лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb.). Две выборки P. obovata были взяты из испытательных культур Ильинского района Пермского края, а именно семьи, семена которых были получены от естественных насаждений Верещагинского района (Po_1) и семьи, семена которых были получены от естественных насаждений Пермского района (Po_2). Две изученные выборки искусственных насаждений L. sibirica расположены в Пермском крае: около г. Очер (Ls_1) и в Кишертском районе на территории УНБ «Предуралье» (Ls_2).
Выделение ДНК проводили по методике С. Роджерса [3], модифицированной использованием в качестве сорбента PVPP (polyvinylpolypyrrolidone) [4]. ДНК была выделена из свежих почек, собранных от каждого дерева индивидуально. В каждой популяции изучено от 28 до 31 деревьев. Расстояние между деревьями не менее 50 м. Навеска растительного материала для выделения ДНК составляла 100 мг. Анализ полиморфизма ДНК проведен у 62 проб ДНК P. obovata и у 56 проб ДНК L. sibirica с пятью праймерами посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для изучения генетической изменчивости популяций P. obovata амплифицировано 310 проб ДНК, а L. sibirica - 280 проб ДНК. Концентрацию и качество ДНК определяли на спектрофотометре «NanoDrop 2000» (Thermo Fisher Scientific, США) и выравнивали до 10 нг/мкл. Эффективность праймеров по выявлению полиморфизма ДНК рассчитывали в соответствии со шкалой 1-5 [5]: от низкой (1) до высокой (5). Каждый праймер был проанализирован в ПЦР с геномной ДНК каждого дерева индивидуально.
Для полимеразной цепной реакции ISSR-методом объемом 25 мкл мы использовали реакционную смесь следующего состава: 2 единицы Tag-полимеразы, 2,5 мкл стандартного 10х буфера для ПЦР, 25 пМ праймера , 2,5 мМ Mg2+, 0,25 мМ dNTP, 5мкл геномной ДНК. Амплификацию проводили в амплификаторе GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, США) по следующей программе: предварительная денатурация 94°C, 2 мин.; первые пять циклов 94°С, 20 сек.; t° отжига, 10 сек.; 72°С, 10 сек.; в последующих тридцати пяти циклах 94°С, 5 сек.; t° отж., 5 сек.; 72°С, 5 сек. Последний цикл элонгации длился 2 мин при 72°С. Температура отжига в зависимости от G/С-состава праймеров варьировала от 52 до 64°С. В качестве отрицательного (К-) контроля в реакционную смесь для проверки чистоты реактивов добавляли вместо ДНК 5 мкл деионизированной воды. Продукты амплификации разделяли путем электрофореза в 1,7% агарозном геле в 1х ТВЕ буфере. Гели окрашивали бромистым эти-дием и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете в системе Gel-Doc XR («Bio-Rad», США). Для определения длины фрагментов ДНК использовали маркер молекулярной массы (100 bp +1.5 + 3 Kb DNA Ladder) («ООО-СибЭнзим-М», Москва). Определение длин фрагментов проводилось с использованием программы Quantity One в системе гель-документации Gel-Doc XR («Bio-Rad», USA).
Компьютерный анализ полученных данных [6] проведен с помощью программы POPGENE1.31 и с помощью специализированного макроса GenAlEx6 для MS-Excel с
определением: доли полиморфных локусов (Р95), абсолютного числа аллелей (na), эффективного числа аллелей
(Пе), ожидаемой гетерозиготности (НЕ). Для описания
генетической структуры популяции были использованы следующие параметры: ожидаемая доля гетерозиготных генотипов (HT) во всей популяции, как мера общего генного разнообразия; ожидаемая доля гетерозиготных генотипов (HS) в субпопуляции, как мера ее внутрипопуля-
ционного разнообразия; доля межпопуляционного генетического разнообразия в общем разнообразии или
показатель подразделенности популяций (GST).
Установлено, что доля полиморфных локусов (Р95
) высока в изученных популяциях обоих видов: 0,716 у P. obovata и 0,928 у L. sibirica (табл. 1).
Число полиморфных маркеров в общей выборке P. obovata варьировало от 9 до 14, а доля полиморфных локусов (Р95) в зависимости от ISSR-праймера колебалась от 0,600 до 0,800. Число полиморфных маркеров в общей выборке L. sibirica изменялось от 14 до 27, а доля полиморфных локусов (Р95) в зависимости от ISSR-праймера варьировала от 0,875 до 1,000. Ожидаемая гете-розиготность (Н^) по локусам (один из основных показателей генетического разнообразия на популяционном уровне) выше (табл. 1) в общей выборке P. obovata (НЕ
=0,231) по сравнению с L. sibirica (Н£ =0,207). Ожидаемая гетерозиготность выше в первой выборке P. Obovata
(Н^ =0,234), а ниже во второй (Н£ =0,228). Этот показатель выше в первой выборке L. sibirica (Ня =0,220) и ниже во второй выборке L. sibirica (Н£ =0,193). Эффективное число аллелей (ne) оценивает величину, обратную гомозиготности, и представляет собой такое число аллелей, при одинаковой частоте которых в популяции ожидаемая гетерозиготность будет равна фактической [10]. Этот показатель выше (табл. 1) в общей выборке
L. sibirica ( пе =1,439) по сравнению с P. obovata ( Пе =1,392).
Таблица 1
Генетическое разнообразие популяций P. sylvestris и L. sibirica
По казатели Po_1 Po_2 На общую выборку P. sylvestris Ls_1 Ls_2 На общую выборку L. sibirica
Р95 0.741 0.700 0.716 0.876 0.875 0.928
НЕ 0.234 0.228 0.231 0.220 0.193 0.207
(0.021) (0.021) (0.021) (0.018) (0.016) (0.017)
Па 1.753 1.716 1.753 1.703 1.703 1.973
(0.434) (0.454) (0.434) (0.459) (0.459) (0.163)
Пе 1.395 1.384 1.392 1.362 1.303 1.439
(0.375) (0.367) (0.364) (0.347) (0.309) (0.316)
R 1 0 1 22 22 44
Примечание: НЕ - ожидаемая гетерозиготность; na - абсолютное число аллелей на локус; Не - эффективное число
аллелей на локус; у всех вышеуказанных параметров в скобках даны стандартные отклонения; R - число редких маркеров, в скобках указана их доля от общего числа фрагментов; популяции P. sylvestris: Ps_1, Ps_2, Ps_3, Ps_4; популяции L. sibirica: Ls1, Ls_2, Ls_3, Ls_4.
Анализ генетической структуры изученных популяций P. obovata показал, что ожидаемая доля гетерозиготных генотипов в общей популяции (HT ) составила
0,234, а в субпопуляциях (Н S) - 0,231. Установлен интересный факт, что изученные выборки испытательных культур Р. obovata очень слабо дифференцированы, так
как коэффициент подразделенности популяций () равен 0,013 (табл. 2). У изученных природных популяций
L. sibirica генетическая структура иная, так как Нт равен 0,272, а Ысоставил 0,207. Следовательно, изученные популяции L. sibirica дифференцированы в большей степени, чем испытательные культуры Р. obovata, так как коэффициент подразделенности популяций L. sibirica составил 0,240.
Таблица 2
Генетическая структура и дифференциация изученных популяций P. obovata и L. sibirica
ISSR-прай-мер Нуклеотидная последова тельность (5W 3') HT HS GST ISSR-праймер Нуклеотидная последова тельность (5W 3') Ht Hs GST
CR-215 (CA)eGT 0,216 (0,036) 0,212 (0,035) 0,022 X10 (AGC)6C 0,308 (0,036) 0,146 (0,019) 0,525
M1 (AC)8CG 0,298 (0,039) 0,294 (0,039) 0,014 CR-215 (CA)6GT 0,308 (0,024) 0,249 (0,020) 0,190
M3 (АС)8СТ 0,270 (0,040) 0,266 (0,040) 0,012 М3 (AC)8CT 0,282 (0,019) 0,239 (0,016) 0,150
X9 (ACC)eG 0,204 (0,027) 0,0203 (0,026) 0,004 ISSR-8 (GAG)6C 0,226 (0,018) 0,187 (0,012) 0,172
ISSR-прай- мер ^^^отдная последова тельность (5W 3') HT HS GST ISSR-праймер ^к^тодная последова тельность (5W 3') Ht Hs GST
X10 (AGC)6C 0,199 (0,034) 0,196 (0,033) 0,014 М9 (GAC)sAC 0,261 (0,025) 0,201 (0,017) 0,229
Ш общую выборку P. obovata 0,234 (0,035) 0,231 (0,034) 0,013 Ш общую выборку L. sibirica 0,272 (0,023) 0,207 (0,017) 0,240
Примечание: HT - ожидаемая доля гетерозиготных генотипов как мера общего генного разнообразия во всей популяции; ИS - ожидаемая доля гетерозиготных генотипов в субпопуляции, как мера ее внутрипопуляционного разнообразия или среднее выборочное генное разнообразие по всем локусам; С5Т - доля межпопуляционного генетического
разнообразия в общем разнообразии или показатель подразделенности популяций; в скобках даны стандартные отклонения.
Только на основании точных сведений о генетической структуре популяций, уровне их генетической изменчивости и характере ее распределения в пределах ареалов может быть оценен генетический потенциал видов и разработан для каждого из них комплекс мероприятий, направленных на максимальное сохранение генетического разнообразия в процессе их использования и воспроизводства [7]. При отборе деревьев для лесовосстанов-ления необходимо учитывать генетическую структуру природных популяций, устойчивое сочетание гомозиготных и гетерозиготных генотипов, а также наличие редких ISSR-маркеров, которые наряду с другими маркерами могут быть использованы и для идентификации популяций, в том числе для генетического контроля происхождения древесины [8].
Работа выполнена при финансовой поддержке задания 2014/153 государственных работ в сфере научной деятельности в рамках базовой части государственного задания Минобрнауки России и гранта РФФИ (проект N° 12-04-00062-а).
Список литературы:
1. Алтухов, Ю.П. Генетические процессы в популя-циях:3-е издание, перераб. и доп.-ИКЦ «Академкнига», 2003. 431с.
2. Злобин Ю.А. Принципы и методы изучения ценоти-ческих популяций растений: учеб. -метод. пособие. / Казань: Изд-во Казан. ун-та, 1989. - 146 с.
3. Rogers, S.O. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues / S.O. Rogers, A.J. Bendich // Plant Molecular Biology. 1985. V. l. № 19. - P. 69-76.
4. Оптимизация методик выделения ДНК некоторых хвойных видов растений Пермского края / Ю.С. Нечаева, Н.Н. Бельтюкова, Я.В. Пришнивская, К.Е. Тайман // Синтез знаний в естественных науках. Рудник будущего: проекты, технологии, оборудование: материалы междунар. науч. конф. Т.2. Пермь: Изд-во Перм. гос. нац. иссл. ун-та, 2011. -С. 278-282.
5. Календарь, Р.Н. Анализ молекулярно-генетиче-ского полиморфизма природных популяций редких видов растений Урала с помощью ретротранспозо-нов / Р.Н. Календарь, С.В. Боронникова // Материалы Четвертого Московского международного конгресса «Биотехнология состояние и перспективы развития». - М.: ЗАО «Экспо-биохим-техноло-гии», РХТУ им. Д.И. Менделееева, 2007. - Ч.2. 121с.
6. Молекулярная генетика / под ред. С.В. Бороннико-вой. Учеб.-метод. пособие. - Пермь: Перм.ун-т., 2007. - 150с.
7. Шереметьева, И.Н. Оценка генетического разнообразия островных и материковых популяций дальневосточной полевки Microtus fortis (Rodentia, Cricetidae): данные RAPD-PCR анализа / И.Н. Шереметьева, Г.Н. Челомина // Биол. исследования на островах северной части Тихого океана. Владивосток. 2003. № 9. - С. 1-18.
8. Боронникова, С.В. Молекулярно-генетический анализ и оценка состояния генофондов ресурсных видов растений Пермского края. Монография. -Пермь: Перм. гос. нац. исслед. ун-т, 2013. - 239 с.
ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ПОЧВОВЕДЕНИИ ТРИХОТОМИЧЕСКОГО МЕТОДА
Иван Иванович Судницын
Доктор биол. наук, профессор, МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва
Поскольку почва является многофазной, поликом- проведении почвенных исследований необходимо учиты-
понентной и динамичной природной системой, в почвове- вать методические разработки, уже давно продуктивно ис-
дении проявляются все законы, открытые другими фунда- пользующиеся в этих дисциплинах. Это касается и мето-
ментальными научными дисциплинами. Поэтому при дов классификации объектов. Так, для определения вида
