CC BY
71
УДК 575.2:575.22:574.3
Пришнивская Я.В.1,2, Нечаева Ю.С.1,2, Красильников В.П.1, Боронникова С.В.1
1Пермский государственный национальный исследовательский университет
E-mail: yana_prishnivskaya@mail.ru Естественнонаучный институт Пермского государственного национального исследовательского университета
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЧЕТЫРЕХ ПОПУЛЯЦИЙ PINUS SILVESTRIS L. НА ВОСТОКЕ РУССКОЙ РАВНИНЫ НА ОСНОВАНИИ ПОЛИМОРФИЗМА ISSR-МАРКЕРОВ
Для решения современных проблем сохранения и возобновления лесов необходима оценка биоразнообразия лесных экосистем, важным элементом которой является изучение генетического разнообразия популяций основных лесообразующих видов растений, одним из которых является сосна обыкновенная (Pinus sylvestris L.). Популяционно-генетические исследования P. sylvestris проведены, большей частью, на основании данных изоферментного анализа, а с использованием анализа полиморфизма ДНК-маркеров, таких как ISSR-маркеры, исследования единичны и проведены только в искусственных насаждениях.
Молекулярно-генетический анализ проведен у четырех популяций P. sylvestris L., расположенных на востоке Русской равнины. Выявлено 125 ISSR-маркеров, из которых 120 являлись полиморфными (P95= 0,960). Установлено, что изученные на востоке Русской равнины четыре популяции характеризуются высоким уровнем генетического разнообразия (Р95=0,960; He=0,159; ne=1,543), при этом наибольшие значения изученных параметров отмечены в популяции PsIV (Р95=0,783; He=0,211; ne=1,367), а наименьшие - в PsIII (Р95=0,553; He=0,101; ne= 1,157). Изученные популя-ци и сильно дифференцированы, так как на межпопуляционную ком поненту приходится 50,14% генетического разнообразия. Исследование генетической структуры популяций с использованием программы STRUCTURE 2.3.4 выявило четкое соответствие между кластерами генотипов и изученными популяциями.
Таким образом, анализ полиморфизма ISSR-маркеров позволяет эффективно оценить генетическое разнообразие и дифференциацию P. sylvestris, что необходимо для рационального лесопользования.
Ключевые слова: генетическое разнообразие, полиморфизм ДНК, ISSR-маркеры, генетическая структура, Pinus sylvestris L.
Для решения современных проблем сохранения и возобновления лесов необходима оценка биоразнообразия лесных экосистем, важным элементом которой является изучение генофонда основных лесообразующих видов растений [1]. Сосна обыкновенная (Pinus sylvestris L.) - один из наиболее широко распространенных экономически важных лесообра-зующих видов растений России, играющий исключительно важную роль в формировании структуры и функций лесных экосистем [2]. Древесина высокого качества делает её ценным объектом для лесопромышленного комплекса. Однако, возрастающее число несанкционированных вырубок леса нарушает важную роль сосны обыкновенной в формировании структуры и функций лесных экосистем и наносит значительный ущерб бюджету Российской Федерации [3]. Популяционно-генетические исследования P. sylvestris проведены, большей частью, на основании данных изоферментного анализа, а с использованием анализа полиморфизма ДНК-маркеров, таких как ISSR-маркеры,
исследования единичны и проведены только в искусственных насаждениях. Молекулярно-генетический анализ P. sylvestris на основании полиморфизма ДНК-маркеров на востоке Русской равнины ранее не проводился [4]-[6].
Материал и методы
Объектами исследований являлись четыре популяции Pinus sylvestris L. (Pinaceae): Северодвинская (PsI), Верхневетлужская (PsII), Ветлужско-Вятская (PsIII), Волжско-Ветлужская (PsIV). Эти популяции были выделены на основании специфики географической изменчивости аллометрических индексов шишек [3]. Первая популяция расположена в бассейне р. Юг и р. Северной Двины, вторая -в верховьях р. Ветлуги, третья - в бассейне среднего течения р. Ветлуги, четвертая - в бассейне нижнего течения р. Ветлуги и левобережье р. Волги на участке от устья р. Ветлуги до г. Новочебоксарска.
Для проведения исследований собраны свежие вегетативные почки с 368 деревьев. Выбор-
ки располагались на расстоянии не менее 100 километров друг от друга, и в каждой из них был взят материал с 92 деревьев расположенных на расстоянии 100 метров. Выделение ДНК проводили по методике С. Роджерса [6], c небольшими модификациями [7].
Для определения генетического разнообразия был избран ISSR (Inter Simple Sequence Repeats) [8] - метод выявления полиморфизма ДНК. Отбор праймеров осуществлялся по эффективности выявления полиморфизма ДНК [9]. Амплификацию проводили в термоцикле-ре GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, USA) по стандартной для ISSR-метода программе [10].
Продукты амплификации разделяли путем электрофореза в 1,7% агарозном геле, которые окрашивали бромистым этидием и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете в системе гель-документации Gel Doc XR (Bio-Rad, USA). Для проверки достоверности полученных ДНК-спектров опыт повторяли не менее трех раз.
Компьютерный анализ полученных данных проведен с помощью программы POPGENE 1.31 [11] и с помощью специализированного макроса GenAlEx6 [12] для MS-Excel с определением: доли полиморфных локусов (Р95) [13], абсолютного числа аллелей (na), эффективного числа аллелей (ne) [14], ожидаемой гетерозиготности (H ) [15]. Для описания генетической структуры популяции были использованы следующие па-
раметры [16]: ожидаемая доля гетерозиготных генотипов (НТ) во всей популяции, как мера общего генного разнообразия; ожидаемая доля гетерозиготных генотипов (HS) в субпопуляции, как мера ее внутрипопуляционного разнообразия; доля межпопуляционного генетического разнообразия в общем разнообразии или показатель подразделенности популяций (GST).
Кластерный анализ исследуемых популяций Р. sylvestris был проведен и с помощью программы STRUCTURE 2.3.4 [17], которая использует методы Монте Карло по схеме марковской цепи (Markov Chain Monte Carlo, MCMC), что позволяет минимизировать неравновесие Харди-Вайнберга и неравенство по сцеплению локусов в кластерном анализе индивидов [18]. Количество кластеров (К) находилось в диапазоне от 2 до 6. Для визуализации результатов, их математического подтверждения методами Evanno [19] была использована веб-программа STRUCTURE Harvester [20].
Результаты и обсуждение
В четырех популяциях Р. sylvestris с использованием ПЦР с пятью эффективными ISSR-праймерами выявлены 125 ISSR-маркеров, из которых 120 (Р95=0,960) являются полиморфными (табл. 1). Доля полиморфных локусов выше в популяции PsI (Р95 =0,820), а ниже - в PsII (Р95 = 0,549). Отличие этого показателя, установленного в популяциях PsI и PsII, достоверно (F = 8,085, что выше F=1,96).
4 опыт 7 7 st 7 '
Таблица 1. Характеристика ISSR-маркеров четырех популяций P. sylvestris
ISSR-маркеры и показатели/популяции Число ISSR-маркеров в популяциях, амплифицированных праймерами
ISSR-1 CR-212 CR-215 M27 X10 На выборку
P P P P P N P
PsI 12 (0,857) 16 (0,800) 16 (0,842) 14 (0,778) 15 (0,833) 89 73 (0,820)
PsII 6 (0,400) 12 (0,667) 11 (0,611) 8 (0,571) 8 (0,471) 82 45 (0,549)
PsIII 8 (0,500) 10 (0,588) 10 (0,588) 7 (0,438) 12 (0,632) 85 47 (0,553)
PsIV 17 (0,944) 14 (0,824) 13 (0,813) 9 (0,563) 12 (0,750) 83 65 (0,783)
На общуювыборку 21 (0,955) 23 (0,920) 23 (0,958) 25 (0,962) 28 (1,000) 125 120 (0,960)
Примечание: N - число ISSR-маркеров, Р - число полиморфных ISSR-маркеров, в скобках указана доля полиморфных локусов; PsI - Северодвинская популяция, PsII - Верхневетлужская популяция, PsШ -Ветлужско-Вятская популяция, PsIV - Волжско-Ветлужская популяция
Из 125 ISSR-маркеров 28 (22,4%) являются уникальными, представленные только в одной популяции, а 120 ISSR-маркеров (77,6%) являются общими для всех изученных популяций (табл. 1).
С помощью ISSR-метода анализа полиморфизма ДНК в PsIV выявлено наибольшее число уникальных ISSR-маркеров - 17, характерных лишь для особей этой популяции. В популяции PsI выявлено 8 уникальных, а PsII и PsIII выявлено 2 и 1 уникальных ISSR-маркера соответственно (табл. 2).
Ожидаемая гетерозиготность (HE) на общую популяцию P.sylvestris составила 0,154. Этот показатель (табл. 2) наибольший в популяции PsIV (HE = 0,211), а наименьший - в популяции PsIII (HE =0,101).
Абсолютное число аллелей на локус (nj на общую популяцию составило 1,976. Этот параметр наивысший в популяции PsI, в популяции PsIII он наименьший. Эффективное число аллелей (n) является функцией от доли полиморфных локусов, числа аллелей на ло-
кус и выравненности частот аллелей и, таким образом, является мерой генетического разнообразия популяции или вида. Эффективное число аллелей на локус (ne) на общую выборку равно 1,543. Большее значение этого показателя отмечено в популяции PsIV, а наименьшее значение - в PsIII (табл. 2).
Анализ генетической структуры изученных популяций P. sylvestris показал, что ожидаемая доля гетерозиготных генотипов (HT) на общую выборку составила 0,318, а ожидаемая доля гетерозиготных генотипов в отдельной популяции по всем локусам (HS) равна 0,159 (табл. 3).
Наименьшие показатели доли гетерозиготных генотипов (HS) отмечены при ПЦР проб ДНК с праймером М27 (HS =0,125), а самые высокие значения этого показателя отмечены при использовании в ПЦР праймера CR-215 (HS = 0,178).
Таким образом, изученные популяции P. sylvestris сильно дифференцированы, так как на долю межпопуляционной компоненты приходится 50,14% генетического разнообразия.
Таблица 2. Генетическое разнообразие изученных популяций P. sylvestris
Популяции / показатели PsI PsII PsIII PsIV На общую выборку
P95 0,820 0,549 0,553 0,783 0,960
H 0,201 (0,017) 0,122 (0,016) 0,101 (0,014) 0,211 (0,018) 0,159 (0,008)
п а 1,608 (0,490) 1,384 (0,488) 1,368 (0,484) 1,560 (0,498) 1,976 (0,154)
п 1,336 (0,356) 1,205 (0,331) 1,157 (0,265) 1,367 (0,385) 1,543 (0,336)
R 8 (0,064) 2 (0,016) 1 (0,008) 17 (0,136) 28 (0,224)
Примечание: НЕ - ожидаемая гетерозиготность; па - абсолютное число аллелей на локус; пе - эффективное число аллелей на локус; у всех вышеуказанных параметров в скобках даны стандартные отклонения; R - число редких ISSR-маркеров, в скобках указана их доля от общего числа ISSR-маркеров
Таблица 3. Генетическая структура и межпопуляционная дифференциация четырех популяций P. sylvestris
ISSR-праймер Hj G ST
ISSR-1 0,319 (0,029) 0,164 (0,010) 0,486
CR-212 0,315 (0,020) 0,178 (0,012) 0,433
CR-215 0,337 (0,024) 0,178 (0,012) 0,4735
M27 0,311 (0,031) 0,125 (0,011) 0,596
X10 0,319 (0,025) 0,152 (0,011) 0,514
На общую выборку 0,318 (0,024) 0,159 (0,008) 0,5014
Примечание: Нт - ожидаемая доля гетерозиготных генотипов как мера общего генного разнообразия во всей популяции; Н5 - ожидаемая доля гетерозиготных генотипов в отдельной популяции, как мера ее внутрипопуляционного разнообразия или среднее выборочное генное разнообразие по всем локусам; GST - доля межпопуляционного генетического разнообразия в общем разнообразии или показатель подразделенности популяций; в скобках даны стандартные отклонения
Кластерный анализ невзвешенным парно-групповым методом (UPGMA), выявил степень сходства исследуемых популяций по ISSR-спектрам (рис. 1). На дендрограмме выборки образовали три кластера: в первый входят популяции PsII и PsIII, к которому примыкает популяция PsI, а в дальнейшем и популяция PsIV. Наименьшее генетическое расстояние отмечено между популяциями PsII и PsIII (D=0,135), а наибольшее - между популяциями PsII и PsIV ф=0,454).
Кроме того, для описания генетической структуры и исследования соответствия между кластерами генотипов и группами популяций применялась программа STRUCTURE 2.3.4. [21] В ней реализован байесовский алгоритм кластеризации генотипов в К кластеров с учетом априорной информации о географическом положении рассматриваемых популяций. Для выбора оптимального K, где 2 < K < 6, использовался логарифм правдоподобия LnPD с помощью on-line-приложения к программе STRUCTURE Harvester [22] в которой для определения наиболее вероятного числа генетических групп используется метод Evanno [19].
Анализ структуры распределения генотипов в программе STRUCTURE показывает, что
наиболее вероятным оказывается разделение исследуемой популяции на четыре кластера (К=4), соответствующим четырем группами генотипов (рис. 2).
Генетическая структура Р. 8уЬв8М8 выражена четко, большинство деревьев могут быть отнесены к одной из исследованных популяций с апостериорной вероятностью > 0,95, что говорит о значительном уровне дифференциации популяций.
Заключение
Таким образом, молекулярно-генетические исследования на основе ISSR-метода анализа полиморфизма ДНК показали, что изученные на востоке Русской равнины четыре популяции Р. характеризуются высоким уров-
нем генетического разнообразия (^=0,960; #=0,159; п,=1,543), при этом наибольшие значения изученных параметров отмечены в популяции PsIV (Рр=0,783; Я=0,211; пе = 1,367), а наименьшие - в PsШ (Р,=0,553; Н =0,101;
V 95 ' ' е ' '
П = 1,157).
Анализ генетической структуры четырех популяций Р показал, что ожидаемая
доля гетерозиготных генотипов (Нг) на общую выборку составила 0,318, ожидаемая доля ге-
Рисунок 1. Дендрограмма, построенная UPGMA-методом по ISSR-спектрам популяций P. sylvestris, шкала сверху - генетическое расстояние; на дендрограмме цифрами указаны значения бутстрепа (в%); PsI, PsII, PsIII, PsIV - обозначения изученных популяций P. sylvestris
Рисунок 2. Структура распределения генотипов в популяциях P. sylvestris при К=4; по вертикали - доля частот аллелей соответствующего кластера (апостериорная вероятность), по горизонтали - номера популяций
терозиготных генотипов в отдельной популяции по всем локусам (Н5) равна 0,159, поэтому показатель подразделенности популяций (б^) высок и составил 0,501. Изученные популяции сильно дифференцированы, так как на межпо-пуляционную компоненту приходится 50,14%
генетического разнообразия. Формирование кластеров на дендрограмме и распределение генотипов четырех изученных популяций в программе STRUCTURE показало четкую выраженность генетической структуры популяций Р. sylvestris.
22.12.2015
Работа выполнена при финансовой задания 214/153 государственных работ в сфере научной деятельности в рамках базовой части государственного задания минобрнауки России (проект 144, №гос. рег. 01201461915)
Список литературы:
1. Видякин А. И. Пространственная организация и факторы формирования групп популяций сосны обыкновенной в Южном Зауралье // А.И. Видякин, Г.Я. Кантор / Вестник Оренбургского государственного университета. - 2013. - №10. - С. 34-39.
2. Тараканов В.В. Структура изменчивости, селекция и семеноводство сосны обыкновенной в Сибири. Дисс.....д-ра с./х. наук.
Новосибирск: Ин-т леса СО РАН, 2003. - 454 с.
3. Видякин А.И. Популяционная структура сосны обыкновенной на востоке европейской части России: Автореф. дис.... д-ра биол. наук. Екатеринбург, 2004. - 48 с.
4. Гончаренко Г.Г. Исследование генетической структуры и уровня дифференциации у Pinus sylveslris L. в центральных и краевых популяции Восточной Европы и Сибири // Г.Г. Гончаренко, А.Е. Силин, В.Е. Падутов / Генетика. - 1993. - Т. 29, №12. - С. 2019-2036.
5. Петрова Е. А. Генетическое разнообразие и дифференциация популяций кедра сибирского на южной границе ареала в равнинной части Западной Сибири // Е. А. Петрова, С. Н. Велисевич, М. М. Белоконь, Ю. С. Белоконь, Д. В. Политов, С. Н. Го-рошкевич / Экологическая генетика. -2014. - T.XXII. №1. - С. 48-61
6. Rogers S.O. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues // S.O. Rogers, A.J. Bendich / Plant Molecular Biology. - 1985. - Vol. l. №19. - P. 69-76.
7. Нечаева Ю.С. Оптимизация методики выделения ДНК некоторых хвойных видов растений Пермского края // Ю.С. Нечаева [и др] / Материалы международной конференции «Синтез знаний в естественных науках. Рудник будущего: проекты, технологии, оборудование». - Пермь, 2011. - С. 278 - 282.
8. Zietkiewicz E. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification // E. Zietkiewicz, A. Rafalski, D. Labuda / Genomics. - 1994. - V. 20. - P. 176-183.
9. Боронникова С.В., Календарь Р. Использование IRAP-метода для анализа генетической изменчивости ресурсных и редких видов растений // Генетика. - 2010. - Т.46, №1 - С. 44-50 (Boronnikova, S.V., Kalendar', R.N. Using IRAP markers for analysis of genetic variability in populations of resource and rare species of plants // Genetika - 2010 - 46 (1), - P. 44-50).
10. Боронникова С.В. Молекулярно-генетический анализ и оценка состояния генофондов ресурсных видов растений Пермского края: монография. Перм. гос. нац. исслед. ун-т. Пермь, 2013. 223 с.
11. Yeh F.C. POPGENE, the Microsoft Windows-based user-friendly software for population genetic analysis of co-dominant and dominant markers and quantitative traits / F.C. Yeh, R.C. Young, J. Mao et al. - Department of Renewable Resources, Univ. of Alberta, Edmonton. Alta, 1999. - 238p.
12. Peakall R. GenAlEx6: Genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research // R. Peakall, P.E. Smouse / Mol. Ecol. Not. - 2006. - V. 6. - P. 288-295.
13. Williams J.G.K. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers // J.G.K. Williams, A.R. Kubelik, K.J. Livak еt al. / Nucl. Acids Res. - 1990. - V. 18. - P. 6531-6535.
14. Kimura M. The number of alleles that can be maintained in a finite population // M. Kimura, J.F. Crow / Genetics (US). - 1964. -V. 49. - P. 725-738.
15. Nei M. Molecular Evolutionary Genetics / M. Nei. - New York: Columbia University Press, 1987. - 512р.
16. Nei M. Molecular population genetics and evolution. / M. Nei. - Amsterdam, 1975. - 278 p.
17. Falush D. Inference of population structure using multilocus genotype data: linked loci and correlated allele frequencies // D. Falush, M. Stephens, J.K. Pritchard / Genetics. - 2003. - Vol. 164. - P. 1567-1587.
18. Smulders M.J.M. Trinucleotide repeat microsatellite markers for black poplar (Populus nigra L.) // M.J.M. Smulders, J. van der Schoot, P. Arens / Mol. Ecol. Notes. - 2001. - Vol. 1. - P. 188-190.
19. Evanno G. Detecting the number of clusters of individuals using the software STRUCTURE: a simulation study // G. Evanno, S. Regnaut, J. Goudet / Mol. Ecol. - 2005. - Vol. 14. - P. 2611-2620.
20. Earl A. STRUCTURE HARVESTER: a website and program for visualizing STRUCTURE output and implementing the Evanno method // A. Earl, M.von Holdt / Conservation Genetics Resources. - 2012. - Vol. 4 (2). - P. 359-361.
21. Hubisz M.J. In ferring weak population structure with the assistance of sample group information // M.J. Hubisz, D. Falush, M. Stephens, J.K. Ritchard / Mol. Ecol. Resources. - 2009. - V. 9, - P. 1322-1332.
22. Dent A.E., vonHoldt, (2012): STRUCTURE HARVESTER: a website and program for visualizing STRUCTURE output and implementing the Evanno method. // A.E. Dent, B.M. vonHoldt / Conservation Genetics Resources. - 2012. - №4 - P. 359-361.
Сведения об авторах:
Пришнивская Яна Викторовна, аспирант биологического факультета Пермского государственного национального исследовательского университета, инженер-исследователь Естественно научного института Пермского государственного национального исследовательского университета 614990, г Пермь, ул. Букирева, 15, тел. (3422) 2-396-729, e-mail: yana_prishnivskaya@mail.ru
Нечаева Юлия Сергеевна, ассистент кафедры ботаники и генетики растений Пермского государственного национального исследовательского университета, научный сотрудник Естественно научного института Пермского государственного национального исследовательского университета 614990, г Пермь, ул. Букирева, 15, тел. (3422) 2-396-279, e-mail: yulianechaeva@mail.ru
Красильников Виталий Павлович, магистрант биологического факультета Пермского государственного национального исследовательского университета, 614990, г. Пермь, ул. Букирева, 15, e-mail: trait969@gmail.com
Боронникова Светлана Витальевна, заведующий кафедрой ботаники и генетики растений Пермского государственного национального исследовательского университета, заведующий научно-исследовательской лабораторией молекулярной биологии и генетики Естественно научного института Пермского государственного национального исследовательского университета, доктор биологических наук, профессор 614990, г. Пермь, ул. Букирева, 15, тел. (3422) 2-396-279, e-mail: svboronnikova@yandex.ru
