CC BY
76
генетическая дифференциация популяции POPULUS TREMULA Ь. Б пЕрмском крае на ОСНОВАНИИ ПОЛИМОРФИЗМА ISSR-MAPKЕPOB
т. н. светлакова,
аспирант,
и. В. БОБОШИНА,
аспирант,
Ю. с. НЕЧАЕВА, аспирант,
с. В. БОРОННИКОВА,
доцент, профессор, Пермский государственный национальный
исследовательский университет 614990' Пермь' ул‘ Букирева' д «г™: А^о^б™.;
Положительная рецензия представлена Е. Г. Плотниковой, доктором биологических наук, профессором, ведущим научным сотрудником лаборатории Института экологии и генетики микроорганизмов.
Ключевые слова: IssR-маркеры, Populus tremula, генетическое расстояние Keywords: Issr-markers, Populus tremula, genetic distance
Пермский край относится к группе многолесных регионов, являющихся ведущими лесозаготовительными базами России. Общая площадь лесного фонда равна 9,3 млн га, что составляет 69 % территории края. В настоящее время в лесном хозяйстве широко применяются молекулярно-генетические маркеры, одной из областей применения которых является определение генетической дифференциации [1]. Особый интерес представляет анализ генетического разнообразия в природных популяциях практически ценных видов растений, таких как тополь дрожащий или осина — Populus tremula L. Осина является одной из быстрорастущих лесообразующих пород, которые позволяют сохранять баланс между потреблением и восстановлением древесной массы [2]. На территории Пермского края имеются высокопродуктивные формы осины, для изучения которых возможно использование межмикроса-теллитного или ISSR (Inter-Simple Sequence Repeats) метода анализа полиморфизма ДНК. Его основой является полимеразная цепная реакция (ПЦР) с одним или несколькими праймерами длиной в 15-24 нуклеотида. Такие праймеры амплифицируют фрагменты ДНК, которые находятся между двумя достаточно близко расположенными микросателлитными повторами [3]. Этот тип маркеров был успешно протестирован на нескольких видах рода Populus, среди которых не было P. tremula [4]. Кроме этого, ISSR-метод превзошел многие технические ограничения RELP- и RAPD-методов [4]. Целью данной работы является изучение генетического разнообразия и генетической структуры пяти популяций P. tremula в Пермском крае на основании анализа полиморфизма ISSR-маркеров.
Материалы и методы.
Было изучено пять популяций P. tremula, которые располагались в разных участковых лесничествах Пермского края: Pt 1 — в Верхне-Курьинском, Pt 2 — в Кунгурском, Pt 3 — Суксунском, Pt 4 — Чермозском, Pt 5 — Губахинском участковом лесничестве. В каждой популяции листья были собраны с 35 случайно отобранных деревьев, находящихся на расстоянии не менее 50 м друг от друга.
Для выделения ДНК использовали СТАВ метод [5] с небольшими модификациями. Концентрацию определяли прибором NanoDrop 2000 («Thermo scientific», USA). Концентрация ДНК P. tremula для ПЦР-анализа — 10 нг/jl.
Амплификацию проводили в термоциклере Gene Amp PCR System 9700 («Applied Biosystems», USA), по стандартной для ISSR-метода программе [6]. Эффективность выявления полиморфизма ДНК рассчитана в соответствии со шкалой от 1 (очень низкая) до 5 (очень высокая) [7]. В качестве отрицательного контроля (К-) в реакционную смесь для проверки чистоты реактивов добавляли вместо ДНК 5 мкл деионизированной воды. Продукты амплификации разделяли электрофорезом в 1,5 % агарозном геле в 1х ТВЕ буфере (Tris-Borate-EDTA), окрашивали бромистым этидием и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете в системе гель-документации Gel Doc XR («Bio-Rad», USA). Для определения длины фрагментов ДНК использовали маркер молекулярной массы (100 bp +
1.5 + 3 КЬ DNA Ladder) (ООО «СибЭнзим-М», Москва). Все ПЦР были проведены трижды для верификации воспроизводимости результатов. Для анализа из 20 праймеров были отобраны 5, в ПЦР с которыми были получены четкие и хорошо воспроизводимые фрагменты.
фрагменты были трансформированы в матрицу бинарных данных, в которой наличие или отсутствие в спектре одинаковых по размеру фрагментов ДНК рассматривалось, соответственно, как состояние 1 или 0. Компьютерный анализ молекулярно-генетического полиморфизма ДНК проведен с помощью компьютерной программы POPGENE1.31 [8] и с помощью специализированного макроса GenAlEx6 [9] для MS-Excel с определением доли полиморфных локусов (Р95) [10] и числа редких аллелей (R), абсолютного числа аллелей (na ), эффективного числа аллелей (ne) [11], ожидаемой гетерозиготности (HE) [12]. Для описания генетической структуры популяций P. tremula были использованы следующие параметры: ожидаемая доля гетерозиготных генотипов (HT ) во всей популяции как мера общего генного разнообразия; ожидаемая доля гетерозиготных генотипов (HS ) в субпопуляции как мера ее внутрипопуляционного разнообразия; доля межпопуляционного генетического разнообразия в общем разнообразии или показатель подразделенности популяций (Grs) [13]. Генетическое расстояние (D) между популяциями определено по формуле M. Nei [13]. На основе матриц бинарных признаков были рассчитаны матрицы генетических различий [13], на основании полученной матрицы невзвешенным парно-групповым методом (UPGMA — unweighed
www.m-avu. narod. ru
її
таблица 1
Эффективность issR-праймеров
№ п/п Обозначение праймера Нуклеотидная последовательность праймера (5'^3') Эффективность праймера
1 M1 (AC)„CG 5
2 M2 (AC)8CC 4
3 M3 (AC)„CT 4
4 М17 (АТ)„С 2
5 M27 (ga)„c 5
6 X9 (ACC)BG 5
7 X10 (agc)ec 5
8 Х11 (AGC)aG 5
9 ISSR-1 (AC)8T 4
10 ISSR-3 (TG)„AA 3
11 ISSR-4 (TG)8GC 4
12 ISSR-5 (AG)„CA 2
13 ISSR-6 (AG)8CG 2
14 ISSR-7 (CTC)eC 1
15 ISSR-8 (GAG)BC 3
16 ISSR-9 (ACG)7G 2
17 ISSR-10 (ATG),C 3
18 CR-212 (CT)8TG 2
19 CR-215 (CA)BGT 3
20 CR-218 (GALCC 3
3 — средняя, 2 — низкая, 1 — очень низкая [календарь, Боронникова, 2007].
таблица 2
полиморфизм P. tremula, выявленный с использованием пяти ISSR-праймеров
Праймер Число фрагментов ДНК Число полиморфных фоагментов ДНК Процент полиморфных фоагментов ДНК Число редких фрагментов ДНК
М1 (AC)8CG 27 22 82 % 6
М27 (ga^c 24 13 54 % 2
X9(ACC)6G 24 16 67 % 1
X10(agc)6c 26 21 81 % 5
X11(AGC)6G 21 15 71 % 3
Всего 122 87 71 % 17
pair-grup method using arithmetic average) были построены дендрограммы, отражающие степень родства исследуемых популяций по ISSR-спектрам при помощи компьютерных программ Treecon 1.3b и POPGENE 1.31.
Результаты исследований.
Каждый ISSR-праймер был проанализирован индивидуально в ПЦР с геномной ДНК P. tremula. В результате этого анализа были выявлены наиболее эффективные ISSR-праймеры (табл. 1).
Из 20 протестированных ISSR-праймеров 5 обладали самой высокой эффективностью, обозначенной в соответствии со шкалой цифрой 5. Среди них два праймера динуклеотидные, т. е. у них повторяющаяся часть праймера содержит два нуклеотида, а три праймера — тринуклеотидные. Эти пять высокоэффективных праймеров были избраны для дальнейшего анализа (табл. 2). Среднее число амплифицированных фрагментов на праймер равнялось 24,4, максимальное — 27 (праймер М1), минимальное — 21 (праймер Х11). Среднее число полиморфных фрагментов на праймер составило 17,4, максимальное — 22 (праймер М1), минимальное — 13 (праймер М27).
Всего было детектировано 122 ISSR-фрагмента, из которых 87 были полиморфными, что составило 71 %. Обнаружено 17 редких фрагментов ДНК, т. е. тех фрагментов, у которых частота встречаемости менее 5 %. На основе ISSR-спектров, полученных электрофорезом продуктов ПЦР с этими пятью праймерами, удалось обнаружить идентификационные фрагменты или их сочетания для популяций. К примеру, фрагмент ДНК Pt1u1410M1 (фрагмент длинной 1410 пар нуклеотидов, амплифицированный с праймером М1) был обнаружен только в популяции Pt1, а фрагмент Ptp770X9 является полиморфным для всех изученных популяций, кроме
12
т. к. был амплифицирован у каждой изученной особи (рис. 1).
По показателям генетического разнообразия, используемым для анализа, изученные популяции неоднородны (табл. 3). Популяции Pt2 и Pt3 имеют высокую долю полиморфных фрагментов ( Р95= 0,73 и Р95= 0,77 соответственно). Вторая популяция имеет наибольшее число редких фрагментов ^ = 9), что говорит о ее генетической обособленности. Наиболее однородна по этому показателю популяции РМ.
Ожидаемая гетерозиготность (Не) выше в популяции Pt2 (0,157), имеет средние значения в популяциях РМ и Pt3 (0,144 и 0,143 соответственно). Низкие показатели ожидаемой гетерозиготности отмечены в Pt4 и Pt5 (0,118 и 0, 092 соответственно), что подтверждает их генетическую однородность, о которой можно судить и по отсутствию у этих популяций редких и уникальных фрагментов.
Рассчитаны генетические расстояния между исследуемыми популяциями. Наибольшее генетическое расстояние отмечено между исследованными популяциями РМ и Pt4 (О = 0,455), а наименьшее — между Pt2 и Pt4 (0,338). Таким образом, в первый кластер объединены РМ и Pt2, которые имеют между собой небольшое генетическое расстояние (О = 0,222). Второй кластер представляет собой Pt3, Pt4 и Pt5. На основе матрицы бинарных данных, составленной по ISSR-спектрам, была построена дендрограмма родственных отношений между популяциями (рис. 2).
Дендрограмма состоит из двух кластеров, подтверждая вышеуказанные показатели генетических расстояний.
Генетическая структура изученных популяций представлена в табл. 4. Общее генетическое разнообразие Р ^ети1а на общую популяцию составило (НТ = 0,269),
'М'М'М. т-эуи. пэгоб. ги
м
Ft 1
Ft 2
Pt3
Ft 4
Ft 5
3000
1500
1000
500
2 3 4
2 3
1234 12 34
2 3 4
Рисунок 1
ISSR-спектр пяти популяций Р. &ети1а с праймеромХ9. Цифрами обозначены номера проб; М — маркер молекулярного веса, с фрагментами размером сверху вниз 3000 пн, 1500 пн, 1000 пн, 500 пн. Стрелкой указан Pt 770х9 фрагмент ДНК
Таблица 3
Показатели генетического разнообразия популяций
P. tremula
Таблица 4
Генетическая структура популяций P. tremula
Pt 1 Pt 2 Pt Э Pt 4 Pt 5
P95 0,53 0,73 0,77 0,б7 0,б4
R 4 9 Э 1 0
І A 0,144 (0,018) 0,157 (0,018) 0,143 (0,01б) 0,118 (0,01б) 0,092 (0,014)
I л 1,371 (0,485) 1,454 (0,500) 1,471 (0,501) 1,371 (0,485) 1,330 (0,472)
ne 1,253 (0,3б8) 1,2б5 (0,352) 1,232 (0,318) 1,191 (0,300) 1,148 (0,273)
ISSR-праймер Hr Hs Gsr
М1 0,2б8 (0,023) 0,175 (0,015) 0,347
М27 0,299 (0,02б) 0,119 (0,004) 0,б00
X9 0,253 (0,041) 0,093 (0,00б) 0,бЭЭ
X10 0,301 (0,030) 0,149 (0,009) 0,505
X11 0,222 (0,037) 0,105 (0,008) 0,530
На общую выборку 0,2б9 (0,031) 0,128 (0,008) 0,523
выборке; H -всем локусам; G
локус; Пе — эффективное число аллелей на локус; I, — ожидаемая гетерозиготность; в скобках даны стандартные
1Т — общее генное разнообразие в суммарной - среднее выборочное генное разнообразие по т — показатель подразделенности популяций; в скобках даны стандартные отклонения.
отклонения.
0.6
—I—
0.5
—I—
0.4
—I—
0.3
—I—
0.2
—I-------
0.1
—I—
UPGMA-дендрограмма пяти популяций P. tremula. Шкала сверху -
Рисунок 2
■ генетические дистанции. На дендрограмме цифрами указаны значения бутстрепа, %
а среднее генетическое разнообразие (И8 ) — 0,128. Коэффициент подразделенности популяций (05т) показывает, что на межпопуляционную компоненту приходится 0,523 разнообразия (табл. 4).
Таким образом, нами подтверждена успешная применимость ISSR-метода в генетических исследованиях Р. ^ети1а. Этот метод информативен и позволяет выявить уникальные идентификационные фрагменты, определить уровень генетического разнообразия, а также установить родственные связи между популяциями.
Литература
1. Политов Д. В. Применение молекулярных маркеров в лесном хозяйстве для идентификации, инвентаризации и оценки генетического разнообразия лесных ресурсов // Лесохозяйственная информация. 2008. № 3-4. С. 24-27.
2. Петрова Г А., Калашникова Е. А. Применение методов клеточной биотехнологии для сохранения биоразнообразия осины (Populus tremula L.) // Вестник Казанского ГАУ 2008. № 1 (7). С. 147-150.
3. Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification // Genomics. 1994. V. 20. P. 176-183.
4. Gao J., Zhang S., Qi L., Zhang Y. Application of ISSR Markers to Fingerprinting of Elite Cultivars (Varieties / Clones) from Different Sections of the Genus Populus L. // Silvae Genetica. 2006. V. 55 (1). P. 1-6.
5. Rogers S. O. Bendich A. J. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues // Plant Molecular Biology. 1985. V. 5. Р 69-76.
6. Молекулярная генетика : учеб.-метод. пособие / под ред С. В. Боронниковой. Пермь, 2007. 150 с.
7. Боронникова С. В., Календарь Р Использование IRAP-метода для анализа генетической изменчивости ресурсных и редких видов растений // Генетика. 2010. Т 46. № 1. С. 1-7.
8. Yeh F. C., Young R. C., Mao J. [et al.]. POPGENE, the Microsoft Windows-based user-friendly software for population genetic analysis of co-dominant and dominant markers and quantitative traits. Edmonton : Alta, 1999. 238 p.
9. Peakall R., Smouse P E. GenAlEx6: Genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research // Mol. Ecol. Not. 2006. V. 6. P. 288-295.
10. Williams J. G. K., Kubelik A. R., Livak K. J. [at al.]. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers // Nucl. Acids Res. 1990. V. 18. P 6531-6535.
11. Kimura M., Crow J. F. The number of alleles that can be maintained in a finite population // Genetics (US). 1964. V. 49. P 725-738.
12. Nei M. Molecular evolutionary genetic. New York : Columbia Univ. press, 1987. 512 p.
13. Nei M. Genetic distance between populations // Amer. Naturalist. 1972. V. 106. P 283-292.
www.m-avu.narod.ru 13
Pt 4
Pt 5
Pt З
Pt l
Pt 2
