CC BY
22
152
Евразийский Союз Ученых (ЕСУ) # 8 (17), 2015 | БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
6. Philp A. Lactate -a signal coordinating cell and systemic function / A. Philp,A. L. Macdonald, P. W. Watt // J. Exp. Biol. - 2005. - Vol. 208, Pt. 24. - P.4561-4575.
7. Sharma, J., Menon, B.K., Vijayan, V.K. and Bansal, S.K. (2015) Changes in Adenosine Metabolism in
Asthma. A Study on Adenosine, 5-NT, Adenosine Deaminase and Its Isoenzyme Levels in Serum, Lymphocytes and Erythrocytes. Open Journal of Respiratory Diseases, 5, 33-49.
ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ЧЕТЫРЕХ ПОПУЛЯЦИЙ PINUS SYLVISTRIS L.
НА ВОСТОКЕ РУССКОЙ РАВНИНЫ
Пришнивская Яна Викторовна
Аспирант, Пермский государственный национальный исследовательский университет (ПГНИУ), Инженер-исследователь, Естественный научный институт ПГНИУ, г. Пермь
Нечаева Юлия Сергеевна
Аспирант, ассистент каф. ботаники и генетики растений, Пермский государственный национальный исследовательский университет (ПГНИУ), г. Пермь Красильников Виталий Павлович, Мартыненко Никита Александрович
Магистрант, Пермский государственный национальный исследовательский университет (ПГНИУ), г. Пермь
АННОТАЦИЯ
В четырех изученных популяциях Pinus sylvestrys L. выявлено 107ISSR-PCR маркеров, из которых 94 были полиморфными (P95 = 0,879). Ожидаемая гетерозиготность (HE) на общую выборку составила 0,156. Показатели генетического разнообразия выше в популяции, расположенной в Коротнинском лесничестве республики Марий Эл (P95 = 0,679; HE = 0,217; ne = 1,370), а самые низкие их значения отмечены в популяции в Уренском лесничестве Нижегородской области (P95 = 0,506; HE = 0,101; ne = 1,157). Анализ генетической структуры четырех популяций P. sylvestrys показал, что на межпопуляционную компоненту приходиться 53,7% генетического разнообразия.
ABSTRACT
In the four populations studied Pinus sylvestrys L. identified 107ISSR- PCR markers, of which 94 were polymorphic (P95=0,879). The expected heterozygosity (HE) for the total sample was 0,156. High levels of genetic diversity established in the population located in Korotninskom forestry, the Republic of Mari El (P95 = 0,679; HE = 0,217; ne = 1,370), and the lowest observed in the population at Uren forestry, Nizhny Novgorod region (P95 = 0,506; HE = 0,101; ne = 1,157). Analysis of the genetic structure of 4 populations of P. sylvestrys has shown that interoperation component account for 53.7% of the genetic diversity.
Ключевые слова: генетический полиморфизм, ISSR-PCR маркеры, генетическая структура, Pinus sylvestrys L.
Keywords: genetic polymorphism, ISSR-PCR markers, genetic structure, Pinus sylvestrys L.
Сохранение генетического разнообразия древесных растений возможно только при условии изучения популяционно-хорологической структуры вида и идентификации каждой элементарной популяции [1]. Основным критерием выделения популяций является специфика их генофондов [2], изучить которую можно с помощью методов молекулярно-генетического анализа.
Объектами исследований являлись четыре популяции Pinus sylvestris L. (Pinaceae), расположенные на востоке Русской Равнины: Ps_1 - в Ежихинском лесничестве Кировской области; Ps_2 - в Уренском лесничестве Нижегородской области; Ps_3 - в Коротнинском лесничестве Республики Марий Эл; Ps_4 - в Кокшайском лесничестве Республики Марий Эл.
Выделение ДНК проводили по методике С. Роджерса (S. Rogers) [3], модифицированный использованием в качестве сорбента PVPP (polyvinylpolypyrrolidone). Для проведения молекулярно-генетического анализа была выделена ДНК из свежих почек индивидуально у 46 деревьев каждой популяции. Навеска составляла 100 мг. Анализ полиморфизма ДНК проведен у 184 проб ДНК с пятью праймерами посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для изучения генетической изменчивости популяций P. sylvestris амплифицировано 920 проб ДНК. Концентрацию и качество ДНК определяли на спектрофотометре «NanoDrop 2000» (Thermo Fisher Scientific, США) и выравнивали до 10 нг/мкл.
Для молекулярно-генетического анализа был избран ISSR-метод (Inter Simple Sequence Repeats, [4]). Он
основан на использовании полимеразной цепной реакции с одним или несколькими праймерами длиной 15-24 нуклеотида [4; 5] с достаточно высокой точностью отжига. ISSR-праймеры состоят из тандемных коротких 2-4 нуклеотидных повторов и одного селективного нуклеотида на 3'-конце праймера [5; 6].
Для полимеразной цепной реакции объемом 25 мкл мы использовали реакционную смесь следующего состава: 2 единицы Tag-полимеразы, 2,5 мкл стандартного 10х буфера для ПЦР, 25 пМ праймера, 2,5 мМ Mg2+, 0,25 мМ dNTP, 5мкл тотальной ДНК. Амплификацию проводили в амплификаторе GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, США) по следующей программе: предварительная денатурация 94°C, 2 мин.; первые пять циклов 94°С, 20 сек.; t° отжига, 10 сек.; 72°С, 10 сек.; в последующих тридцати пяти циклах 94°С, 5 сек.; to отж., 5 сек.; 72°С, 5 сек. Последний цикл элонгации длился 2 мин при 72°С. Температура отжига в зависимости от G/С-состава праймеров варьировала от 52 до 64°С. Продукты амплификации разделяли путем электрофореза в 1,7% агарозном геле в 1х ТВЕ буфере. Гели окрашивали бромистым этидием и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете в системе Gel-Doc XR («Bio-Rad», США).
В изученных популяциях P. sylvestris выявлено 109 ISSR-PCR маркеров, из которых 94 были полиморфными. Доля полиморфных локусов (P95) в выборке в зависимости от ISSR-праймера колебалась от 0,826 до 0,950 и в
Евразийский Союз Ученых (ЕСУ) # 8 (17), 2015 | БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
153
среднем составила 0,879. Праймер (AGC)6C выявил самые низкие значения полиморфизма ISSR-PCR маркеров в популяциях, а праймер (АС)8Т - самые высокие (Таблица 1).
Доля полиморфных локусов (Р95) в изученных популяциях варьировала от 0,474 до 0,679. Ожидаемая гете-
розиготность (HE) в общей выборке составила 0,156. В популяции Ps_2 этот показатель минимальный (HE =0,101), а в популяции Ps_3 он максимальный - 0,217 (Таблица 2).
Абсолютное число аллелей на локус (na) на общую выборку составило 1,953. Этот параметр наивысший в популяции Ps_3, в популяции Ps_1 он наименьший.
Таблица 1
Характеристика ISSR-PCR маркеров четырех популяций P. sylvestris
ISSR- прай меры Нуклеотидная последо вательность (5'^ 3') Длина ISSR-PCR марке ров, пн Число ISSR- PCR маркеров в популяциях
Ps 1 Ps 2 Ps 3 Ps 4 На общую выборку
полиморф ных поли- морфных полиморф ных полиморф ных все го полиморф ных
IS1 (АС)8Т 220-1115 6 (0,400) 6 (0,400) 11 (0,647) 12 (0,706) 20 19 (0,950)
CR212 (CT)8TG 250-1400 6 (0,462) 7 (0,412) 14 (0,824) 11 (0,733) 22 19 (0,864)
CR215 (CA)6GT 150-1280 7 (0,500) 8 (0,471) 12 (0,800) 11 (0,688) 20 18 (0,900)
M27 (GA)8C 150-1020 7 (0,438) 6 (0,462) 8 (0,500) 5 (0,385) 22 20 (0,909)
X10 (AGC)6C 200-1400 10 (0,556) 6 (0,400) 10 (0,625) 13 (0,813) 23 19 (0,826)
Всего (частота) 36 (0,474) 39 (0,506) 55 (0,679) 52 (0,675) 107 94 (0,879)
Примечание: в скобках указана доля полиморфных локусов
Таблица 2
Генетическая изменчивость четырех популяций P. sylvestris
Популяция НЕ Па ne R
Ps 1 0,102 (0,016) 1,355 (0,481) 1,167 (0,296) 3
Ps 2 0,101 (0,015) 1,365 (0,484) 1,157 (0,263) 2
Ps 3 0,217 (0,019) 1,589 (0,494) 1,370 (0,370) 2
Ps 4 0,206 (0,020) 1,533 (0,501) 1,362 (0,396) 0
На общую выборку 0,156 (0,002) 1,953 (0,212) 1,598 (0,360) 7
Н n n
Примечание: Е - ожидаемая гетерозиготность; а - абсолютное число аллелей на локус; e -эффективное число
аллелей на локус; у всех вышеуказанных параметров в скобках даны стандартные отклонения; R - число редких ISSR-PCR маркеров, в скобках указана их доля от общего числа фрагментов
Эффективное число аллелей на локус (ne) на общую выборку равно 1,598. Наибольшее значение этого параметра отмечено в популяции Ps_3, а наименьшее значение - в популяции Ps_2. Для характеристики генетической структуры популяций полезны редкие, то есть встречающиеся с частотой менее 5% аллели. В Ps_1 выявлено наибольшее число уникальных ISSR-PCR маркеров - 3, характерных лишь для деревьев этой популяции. В Ps_2 и
Ps_3 выявлено по 2 уникальных ISSR-PCR маркера. В Ps_4 не отмечены уникальные аллели (Таблица 2).
Анализ генетической структуры изученных четырех популяций показал, что ожидаемая доля гетерозиготных генотипов (HT) в среднем составила 0,338, а ожидаемая доля гетерозиготных генотипов в отдельной популяции (HS) равна 0,156; поэтому коэффициент генетической подразделенности популяций (GST) составил 0,537 (Таблица 3).
Таблица 3
Генетическая структура и дифференциация четырех популяций P. sylvestris
ISSR-праймер Нуклеотидная последовательность (5'^- 3') HT Hs GST
ISSR-1 (АС)8Т 0,323 (0,026) 0,160 (0,011) 0,505
CR-212 (CT)8TG 0,323 (0,028) 0,159 (0,018) 0,509
CR-215 (CA)6GT 0,367 (0,026) 0,188 (0,024) 0,488
M27 (GA)8C 0,371 (0,032) 0,113 (0,019) 0,695
X10 (AGC)6C 0,306 (0,028) 0,165 (0,009) 0,462
Среднее 0,338 (0,028) 0,156 (0,016) 0,537
Примечание: HT - ожидаемая доля гетерозиготных генотипов как мера общего генного разнообразия во всей популяции; HS - ожидаемая доля гетерозиготных генотипов в субпопуляции, как мера ее внутрипопуляционного разнообразия или среднее выборочное генное разнообразие по всем локусам; GST - доля межпопуляционного генетического разнообразия в общем разнообразии или показатель подразделенности популяций; в скобках даны стандартные отклонения
На Урале так же были выявлены высокие показатели межпопуляционной изменчивости у Larix sibirica Ledeb. [7] и у Populus tremula L.[8]. Таким образом, изученные четыре популяции P. sylvestris дифференцированы сильно, так как на долю межпопуляционного генетического разнообразия приходится 53,7%.
Работа выполнена при частичном финансировании в рамках базовой части государственного задания Минобрнауки России (проект144, № гос. рег. 01201461915) и гранта РФФИ (проект № 12- 04-00062-а).
Список литературы
1. Видякин А. И., Кантор Г.Я. Пространственная организация и факторы формирования групп популяций сосны обыкновенной в Южном Зауралье //
154
Евразийский Союз Ученых (ЕСУ) # 8 (17), 2015 | БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
Вестник Оренбургского государственного универ- 6. ситета. - 2013. - № 10. - С. 34-39.
2. Тимофеев-Ресовский Н.В. Очерк учения о популяции / Н.В. Тимофеев-Ресовский, А.В. Яблоков, Н.В. Глотов - М.: Наука, 1973. - 278 с.
3. Rogers S. O., Bendich A. J. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues // Plant Molecular Biology. - 1985. - V. l, № 19. - P. 69-76.
4. Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification // Genomics. - 1994. - V. 20. - Р. 176-183.
5. Boronnikova S.V., Kalendar R.N. Using IRAP markers for analisis of genetic variability in populations of resource and rare species of plants // Russian Jornal of Genetics. - 2010. - №1 (46). - P. 36- 42.
Williams J.G.K., Kubelik A.R., Livak K.J. et al. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers // Nucleic Acids Res. - 1990.
- № 18. - Р. 6531-6535.
7. Нечаева Ю.С. С.В. Боронникова, А.И. Видякин и др. Молекулярно-генетический анализ популяций хвойных видов растений на Урале и востоке европейской части России для сохранения и возобновления лесных ресурсов // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. - 2014.
- Т. 16. №1(3). - С. 878-882.
8. Светлакова Т.Н., Бобошина И.В., Нечаева Ю.С., Боронникова С.В. Генетическая дифференциация популяций Populus tremyla L. в Пермском крае на основании полиморфизма ISSR-маркеров // Аграрный вестник Урала. - 2012. - №3 (95). - С. 11-13.
ХАРАКТЕРИСТИКА КАТАЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ДВУХ НОВЫХ РЕКОМБИНАНТНЫХ ФУКОИДАНАЗ ИЗ МОРСКОЙ БАКТЕРИИ FORMOSA ALGAE
Сильченко Артем Сергеевич
к.х.н., Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения Российской
академии наук, г. Владивосток; Зуева Анастасия Олеговна
Школа естественных наук, Дальневосточный федеральный университет, г. Владивосток.
АННОТАЦИЯ
В морской бактерии Formosa algae определены два гена кодирующие, фукоиданазы ФФА1 и ФФА2. Биоинформационный анализ аминокислотных последовательностей выявил их мультидоменную организацию. Для выявления функции того или иного домена, входящего в состав фукоиданаз, были получены усеченные с С-конца производные данных ферментов. Полноразмерные фукоиданазы и все их усеченные производные обладали ферментативной активностью. Наличие фукоиданазной активности у усеченных производных указывает на локализацию активного центра в N-концевой области данных ферментов. Ионы Ca2+, Ba2+, Mg2+ и Mn2+ активировали ФФА1 и ФФА2, в то время как ионы Al3+, Cu2+, Sn2+ и Fe3+ ингибировали оба фермента. На основании субстратной специфичности фукоиданазы ФФА1 и ФФА2 классифицированы нами как эндо-1^4-а-Т-фуканазы.
ABSTRACT
Two genes encoding fucoidanase (FFA1 and FFA2) were identified in a genome of the marine b acterium Formosa algae. Bioinformatic analysis of the amino acid sequences revealed to their multidomain organization. Truncated at the C-terminus derivatives offucoidanases were obtained to identify a function of these domains. Full-length fucoidanases and their truncated derivatives had an enzymatic activity. The presence of activity in truncated derivatives indicates the localization of the active site in the N-terminal portion of these enzymes. FFA1 and FFA2 were activated by the ions Ca2 +, Ba2 +, Mg2 + and Mn2 +, while ions Al3 +, Cu2 +, Sn2 + and Fe3 + inhibited both enzymes. We classified FFA1 and FFA2 as endo-1 ^ 4-а L-fucanases based on the substrate specificity.
Ключевые слова: бурые водоросли, фукоидан, морские бактерии, фукоиданазы, рекомбинантные ферменты.
Keywords: brown algae, fucoidan, marine bacteria, fucoidanases, recombinant enzymes
Введение
Полианионные полисахариды являются обширной группой биополимеров, которые обнаружены во всех классах морских водорослей. Интерес к изучению этих полисахаридов вызван широким спектром их биологического действия. Они обладают противовирусным, противоопухолевым, иммуномодулирующим, противовоспалительным, антикоагулянтным, антиадгезивным, антиангиогенным действием [22, 14, 16, 5, 21, 20, 2, 17, 9, 15, 4].
Среди полианионных полисахаридов наибольшее внимание привлекают фукоиданы - сульфатированнные полисахариды бурых водорослей. Фукоиданы принадлежат к семейству сульфатированных гетерополисахаридов, основным, а иногда единственным мономером которых являются сульфатированные и, в некоторых случаях, аце-тилированные по различным положениям остатки a-L-фу-козы. Кроме остатков фукозы, в состав фукоиданов бурых
водорослей часто входят и другие моносахариды, такие как галактоза (Gal), манноза (Man), ксилоза (Xyl), рамноза (Rha), уроновые кислоты (U). Неуклонно растет количество публикаций, посвященных исследованиям биологической активности фукоиданов, которые намного опережают исследования структуры этих полисахаридов. Механизм действия фукоиданов и влияние его молекулярной структуры на проявление той или иной биологической активности остаеются мало изученным. Это связано, прежде всего, с отсутствием сведений об особенностях строения молекулы фукоидана, например, о способах включения минорных моносахаридов в структуру молекулы.
К настоящему времени установлены только основные принципы построения молекул фукоиданов. Химические исследования этих полисахаридов затруднены из-за чрезвычайной нерегулярности их строения, в связи с чем
