CC BY
193
Биомедицина • № 3, 2010, С. 68-70
Молекулярно-генетические маркеры в диагностике острого лимфобластного лейкоза у детей
Д.С.Джумагазиева*, О.В.Шевченко*, В.Б.Бородулин**, А.А.Свистунов ***
* Саратовский государственный медицинский университет им. В.И.Разумовского, Саратов ** ООО «Геночип», Саратов
*** Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова, Москва
Острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ) - самое распространенное злокачественное заболевание у детей. ОЛЛ -это злокачественное заболевание гемо-поэтической ткани, возникающее в результате соматической мутации генетического материала в кроветворной клетке с последующим формированием опухолевого клона. В структуре педиатрической онкологической патологии доля ОЛЛ составляет до 25% всех опухолей и до 75% всех гемобластозов. Характерной особенностью является так называемый младенческий пик - увеличение заболеваемости ОЛЛ до 75 на млн. в год в возрасте от 2 до 5 лет. Заболеваемость ОЛЛ претерпевает существенные географические вариации, составляя в среднем 30-40 случаев на 1 млн. населения в год.
Современная классификация острых лейкозов основывается на принципе принадлежности бластных клеток к определенному ростку кроветворения. В классификации учитываются цитогенетические и молекулярно-биологические особенности опухолевых клеток, их морфологические свойства, уровень диффе-ренцировки, а также возможность развития болезни после лучевой терапии и применения химиопрепаратов (классификация ВОЗ 2001г.) Существует классификация, учитывающая экспрессию иммунологических маркеров - CD (кла-
стеры дифференцировки), которые указывают на степень зрелости составляющих опухоль клеток. Морфологическая классификация ОЛЛ, основанная на морфологических признаках опухолевых клеток, включает 3 группы согласно FAB-классификации - L1, L2, L3. Цитохимическая и цитогенетическая классификация более разнообразна и необходима как для уточнения морфологической классификации в сложных случаях, так и для выбора тактики лечения. Для диагностики и прогнозирования лейкозов применяется комплекс лабораторных методов. В настоящее время в клинических условиях стали регулярно использоваться методы цитогенетического определения лейкозного клона клеток.
Целью работы явилось сопоставление информативности цитогенетического и молекулярно-генетического методов диагностики ОЛЛ у детей.
Материалы и методы
Изучались лабораторные данные детей с онкогематологическими заболеваниями. В группу больных с первичным ОЛ вошли 17 детей, находившихся на лечении в клинике профпатологии и гематологии СГМУ с 2009 по 2010 гг., из них 8 девочек и 9 мальчиков. На момент постановки диагноза средний возраст со-
ставил 7,1 год (максимальный возраст 16 лет, минимальный - 1год 8 месяцев).
Результаты и их обсуждение
При изучении пунктата костного мозга медиана количества бласт-ных клеток составила 81,6% (максимум 99, минимум 45). В соответствии с FAB-классификацией у 11 пациентов (64,7%) выявлен L2 вариант, у 5 (29,4%)
- L1 вариант, у 1 пациента (5,9%) - морфологический вариант идентифицировать не удалось, при иммунофенотипи-ровании у данного пациента был выявлен острый бифенотипический лейкоз с преобладанием Т зрелого лейкоза (Т-ГУ). У остальных пациентов, согласно EGГL-классификации В - ОЛЛ (1995) диагностировано: у 12 пациентов (70,6%) выявлен В-ОЛЛ В-соттоп (В-ГГ)- достоверно более высокий уровень CD10+ и HLA-DR+; у 4 пациентов (23,5%) выявлен Т-клеточный ОЛЛ - про Т (Т-Г) с экспрессией CD7+ и CD5+ маркеров и зрелый Т (Т-ГУ) с экспрессией CD3+ и CD1а+ маркеров.
Изменения в структуре хромосом, специфические хромосомные перестройки, приводящие к образованию химерных или слившихся генов, составляют генетическую основу ОЛЛ. Эти изменения являются независимыми диагностическими и прогностическими маркерами при лейкозах и могут применяться для определения прогноза и выбора стратегии терапии. Хромосомные аберрации встречаются примерно в 40-50% случаев острых нелимфобластных лейкозов и в 30-40% случаев острых лимфобластных лейкозов. Традиционно для анализа хромосомных аберраций используется цитогенетический метод. В данной работе проводилось культивиро-
вание костного мозга, дифференциальное G-окрашивание (по методу Seabright M.). Препараты анализировались с учетом Международной цитогенетической номенклатуры (Shaffer L.G., Slovak M.L., Campbell L.J., 2009). Кариотипирова-ние проводилось с помощью микроскопа Axiostar plus FL и программного обеспечения Видео-тест Карио 3.1. В каждом случае проанализировано не менее 20 метафазных пластинок клеток костного мозга.
При проведении цитогенетических исследований кариотипа костного мозга (7 пациентов при первичной диагностике и 4 исследования в динамике заболевания) были получены следующие результаты: в 4-х случаях (36,4%) выявлены структурные перестройки кариоти-па dup (l)(q21; q32), t (8; 21) (q22;q22), t (9;12) (p12; p12), t (11;19) (q23; p13.3). В трех случаях (27,2%) был выявлен нормальный кариотип.
В настоящее время доступна и активно внедряется в клиническую медицину методика, разработанная в институте молекулярной биологии им. В.А. Энгель-гардта РАН, основанная на гибридизации на биологическим микрочипе. Данный метод позволяет анализировать большое количество химерных транскриптов одновременно и очень удобен для диагностики лейкозов. Основой анализа является комбинированный подход, включающий обратную транскрипцию РНК пациента с последующей мультиплексной амплификацией продуктов химерных генов и гибридизацию амплифицированных фрагментов на биочипе. (Работа проводилась совместно с ООО «Геночип» г. Саратов). В исследовании использовался «ЛК-биочип» и были выбраны хромосомные транслокации для ОЛЛ: t (12;21) TEL/AML1, t (9;22)p190BCR/ABL,
^1;19)Е2А/РВХ1, для ОНЛЛ - t (8;21) AML1/ETO, t (15;17)PML/RARA и инверсия ^ (16) CBFB/MYH1, транслокация с участием гена MLL: t (4;11) MLL/ AF4, t (9;11) MLL/AF9, К11;19) MLL/ Е^Ц 1(11;19) MLL/ELL, t (6;11) MLL/ AF6, t (10;11) MLL/AF10.Транслокация с участием гена MLL встречается у детей до года в 70-80% случаев ОЛЛ и 5060% случаев ОНЛЛ и является важным фактором прогноза и подбора фармакотерапии. При хроническом миелоид-ном лейкозе патогмоничным признаком является наличие транслокации ^9;22) р210ВС^АВ^
При анализе гибридизации на микрочипах было выявлено отсутствие транслокаций К12;21), К9;22), 1(1;19), ^8;21), 1(15;17), inv(16), 1(4;11), 1(9;11), 1(11;19), t(6;11), t(10;11); у 1 пациента при стандартном цитогенетическом обследовании выявлены численные изменения в кариотипе 47, XX +8. У 1 пациента выявлена транслокация (12;21), при цитогенетическом анализе данная перестройка не была выявлена, возможно, в связи с минимальным клеточным клоном данной перестройки. Чувствительность цитогенетического метода 1:100, а чувствительность анализа на биочипах 1:10000.
Выводы
В работе показано, что результаты стандартного цитогенетического исследования кариотипа костного мозга коррелируют с результатами молекулярно-генетического тестирования на ДНК-биочипе. Использование этих методик в комплексе можно считать наиболее целесообразным.
Список литературы
1. Гра О.А. Генетический полиморфизм GST, NAT2, и MTRR и предрасположенность к развитию острого лейкоза у детей // Гра О.А., Глотов А.С., Ко-жекбаева Ж.М. // Молекулярная Биология. - 2008. - Т. 42. - С.1-13.
2. Исаева, Е.А. Хромосомные аберрации при лимфобластном лейкозе у детей. / Исаева Е.А., Жаринов В.С., Наседкина Т.В. // Детская онкология - 2004.
- №4. - С.1-6.
3. Mullighan C.G. Genome-wide analysis of genetic alterations in acute lymphoblastic leukaemia. / Mullighan C.G., Goorha S., Radtke I. // Nature. -2007. - №446. - С.758-764.
4. Pulte D. Improvement in survival in younger patients with acute lymphoblastic leukemia, from the 1980s to the early 21st century // Pulte D., Gondos A., Brenner H. // Blood. - 2009. - № 113(7). - С.1408-1411.
