Молекулярно-генетическая оценка растений-регенерантов сахарной свёклы в культуре in vitro Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

ТЕХНОЛОГИЯ ВЫСОКИХ УРОЖАЕВ

УДК 633.63:581.3

мм« МАКРОМЕР4

MS!!/ им. B.C. ЛЕБЕДЕВА

Молекулярно-генетическая оценка растений-регенерантов сахарной свёклы в культуре in vitro

E.H. ВАСИЛЬЧЕНКО, старш. научн. сотр. H.A. КАРПЕЧЕНКО, канд. биолог. наук

ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свёклы и сахара им. А.Л. Мазлумова» (е-mail:biotechnologiya@mail.ru)

Введение

В популяциях сахарной свёклы, как и многих других видов растений, встречаются формы, имеющие стерильную пыльцу, т. е. обладающие мужской стерильностью [1]. Это очень важный для селекции признак, поскольку он даёт возможность экономить время и средства, избегая трудоёмкого процесса кастрации гермафродитных цветков при гибридизации. Установлено, что мужская стерильность у сахарной свёклы может быть двух типов: генетическая мужская стерильность, связанная с ядерными хромосомами, и генетико-цитоплазматическая мужская стерильность, контролируемая взаимодействием ядерного и цитоплазматического (митохондриального) генома. Мужская стерильность, обусловленная ядерным геномом, характеризуется действием рецессивного гена и проявляется только у гомозиготных по данному гену форм. Цитоплазматическую мужскую стерильность, согласно Оуэну, можно объяснить наличием в популяции сахарной свёклы растений с нормальной (^ цитоплазмой и со стерильной цитоплазмой. Растения с нормальной цитоплазмой имеют крупные пыльники, в которых формируется большое количество жизнеспособной пыльцы. Растения со стерильной цитоплазмой могут помимо фертильной пыльцы иметь и стерильную. В последнем случае их пыльники недоразвиты, пыльца в них формируется небольшого размера и нежизнеспособная. Стерильность по пыльце проявляется при взаимодействии стерильной цитоплазмы с рецессивными генами ядра. Гомозиготное состояние рецессивных генов обеспечивает полную мужскую стерильность. Присутствие одного из этих генов в доминантном состоянии приводит к образованию полустерильных по пыльце форм растений [2].

Выявление растений со стерильной цитоплазмой представляет значительный интерес со стороны селекционеров для селекции сахарной свёклы. Масштабное развитие методов молекулярной биологии в большей мере позволяет решить данную задачу. Использование ДНК-маркеров даёт возможность тестировать полиморфизм ДНК на уровне генов, а не на уровне продуктов генов. Кроме того, ДНК-маркеры позволяют использовать любые ткани и органы для анализа [3].

Молекулярные маркеры нейтральны по отношению к фенотипу, нетканеспецифичны, их можно обнаружить на любой стадии развития растений. Они позволяют контролировать передачу генетического материала от растений-доноров и вести отбор на искомый селекционный признак, например на цитоплазмати-ческую мужскую стерильность [4, 5]. Стерильность цитоплазмы у сахарной свёклы обусловлена изменением нуклеотидной последовательности в митохон-дриальном и хлоропластном геномах [6]. Выявление форм с ЦМС у растений сахарной свёклы считается актуальной задачей, поскольку данный признак является весьма ценным, облегчая задачу для селекционеров при формировании родительских пар и получении гибридов.

Материалы и методы

Для исследований использовали селекционные материалы лаборатории ЦМС и лаборатории исходного материала ФГБНУ ВНИИСС им. А.Л. Мазлумова. Объектами исследования были гаплоидные расте-ния-регенеранты сахарной свёклы (Beta vulgaris L.), культивируемые в условиях in vitro. Для получения препаратов тотальной ДНК использовался метод с применением ЦТАБ-буфера (цетилтриэтиламмония бромида). Амплификацию ДНК проводили в автоматическом режиме в термоциклере «ДНК-технологии». Для визуализации выявленных ампликонов проводили электрофорез в 1 %-ном агарозном геле с добавлением бромистого этидия. Для определения длины (размера) ампликона использовали стандартные маркеры с диапазоном от 100 до 1000 п.н. с шагом 200 пар нуклео-тидов. Амплификацию фрагментов ДНК, содержащих тандемные повторы, осуществляли с использованием двух пар праймеров: Е-G, SvulgF-SvulgR. Данные праймеры комплиментарны межгенному спейсеру хлоропластного генома сахарной свёклы и содержат специфические сайты рестрикции.

Результаты экспериментов и их анализ

Наши исследования показали, что PCR- и RFLP-анализ с использованием рестриктазы Hind III позволяет идентифицировать тип цитоплазмы у создавае-

24 САХАР № 2 • 2018

ОТ ИДЕИ К СОЗИДАНИЮ

www.macromer.ru

ТЕХНОЛОГИЯ ВЫСОКИХ УРОЖАЕВ

мых гаплоидов сахарной свёклы по числу рестриктов. У гаплоидных микроклонов с нормальной цитоплазмой амплифицировался один фрагмент (800 п.н.). У стерильных (S) форм выявлены два продукта рестрикции 320 и 480 п.н. (см. рис.).

Гаплоиды, у которых этот фрагмент не рестрициро-вался Hind III, были представлены полностью фер-тильными формами с нормальной цитоплазмой (N) и ядерными генами в рецессивном состоянии (rf). В остальных образцах наблюдался полиморфизм фрагментов, что, по-видимому, предполагает наличие у соответствующих гаплоидных форм стерильной цитоплазмы (S) и разное сочетание рецессивных и доминантных аллелей ядерных генов Rf1/rf1 и Rf2/rf2. Отметим, что PCR-профили у всех стерильных реге-нерантов (как гаплоидов, так и удвоенных гаплоидов) одинаковы. Поэтому выявление растений-регенеран-тов со стерильной цитоплазмой на разных этапах культивирования представляет значительный интерес для селекции сахарной свёклы, облегчая создание линий с ЦМС и высокопродуктивных гибридов на стерильной основе.

Заключение

Стерильность цитоплазмы у сахарной свёклы обусловлена изменением нуклеотидной последовательности в хлоропластном геноме. Идентификация таких растений возможна благодаря применению современных методов молекулярно-генетического анализа, таких как ПЦР и рестрикция. Сочетание этих методов позволяет выявлять полиморфизм в межгенном спей-сере хлоропластного генома, который ассоциирован

со стерильной цитоплазмой у сахарной свёклы. Использование RFLP-анализа ДНК даёт возможность вести отбор гаплоидных регенерантов на искомый селекционный признак, например ЦМС, и формировать гомозиготные линии по этому признаку.

Результаты проведённых исследований представляют как теоретический, так и практический интерес для селекции сахарной свёклы.

Список литературы

1. Arnaud, J.F. Evidence for gene flow via seed dispersal from crop to wild relatives in Beta vulgaris (Chenopodiaceae): consequences for the release of genetically modified crop species with weedy lineages / J.F. Arnaud, F. Viard, М. Delescluse // Proc. R. Soc. Lond. - 2003. - B. 270. - Р. 1565-1571.

2. Балков, И.Я. Селекция как фактор ускорения эволюции сахарной свёклы / И.Я. Балков [и др.] // Сахарная свёкла. -2014. - № 5. - С. 8-14.

3. Падутов, В.Е. Методы молекулярно-генетического анализа / В.Е. Падутов, О.Ю. Баранов, Е.В. Воропаев. -Минск : Юнипол, 2010. - 176 с.

4. Cheng, D. The distribution of normal and male-sterile cytoplasms in Chinese sugar-beet germplasm / D. Cheng [and oth.] // Euphytica. - 2009. - 165. - Р. 345-354.

5. Moritani, M. Identification of the predominant nonrestoring allele for Owen-type cytoplasmic male sterility in sugar beet (Beta vulgaris L.): development of molecular markers for the maintainer genotype / М. Moritani [and oth.] // Mol. Breeding. - 2013. - 32. - Р. 91-100.

6. Жужжалова, Т.П. Гаплоидный партеногенез in vitro у сахарной свёклы (Beta vulgaris): факторы и диагностические признаки / Т.П. Жужжалова [и др.] // Сельскохозяйственная биология. - 2016. - Т. 51. - № 5. - С. 636-644.

Электрофореграмма рестриктов амплифицированных фрагментов ДНК (RFLP-анализ, рестриктаза Hind III) у гаплоидныхрастений-регенерантов сахарной свёклы (Beta vulgaris L.):

К1 — контрольные фертильныерастения, К2 — контрольные стерильные растения; 1—5 — формы с нормальной (N) цитоплазмой, 6—8 — формы со стерильной (S) цитоплазмой; М — маркеры молекулярных масс (ДНК-маркер MassRuler™, 80-1031 п.н., SM0383, Thermo Scientific, США)_

Аннотация. Показана эффективность метода RFLP-анализа с использованием рестриктазы Hind III, позволившего идентифицировать гаплоидные микроклоны по типу цитоплазмы. Молекулярные маркеры свидетельствовали, что регенеранты с нормальной цитоплазмой (N) имели один ПЦР-продукт длиной 800 п.н., у форм (S) с цитоплазматической мужской стерильностью (ЦМС) обнаруживались два продукта рестрикции (320 и 480 п.н.). Выявление гаплоидных регенерантов со стерильной цитоплазмой из исходных популяций имеет важное теоретическое и прикладное значение для селекции, облегчая задачу создания гомозиготных линий с ЦМС и высокопродуктивных гибридов на стерильной основе. Ключевые слова: сахарная свёкла (Beta vulgaris L.), гаплоидный партеногенез, RFLP-анализ ДНК.

Summary. Efficiency of RFLP-analysis method using Hind III restrictase that has allowed for the first time to identify haploid microclones according cytoplasm type is shown. Molecular markers have indicated that regenerants with normal cytoplasm (N) have one PCR-product of 800 bp in length not digested by Hind III. Two fragments (320 and 480 bp) of 800 bp product digestion are found in cytoplasmic male sterile (CMS) forms (S) that reflects combination of recessive and dominant genes. Obtaining haploid regenerants with sterile cytoplasm from initial population is of great theoretical and practical importance for sugar beet breeding thus facilitating the problem of producing homozygous lines with CMS and high-productive hybrids on the sterile basis.

Keywords: sugar beet (Beta vulgaris L.) haploid parthenogenesis, RFLP-analysis.

№ 2 • 2018 САХАР 25