CC BY
16УДК:633.63:581.3
Диагностические признаки гаплоидных регенерантов сахарной свёклы в культуре in vitro
Е.Н. ВАСИЛЬЧЕНКО, Е.О. КОЛЕСНИКОВА, канд. биолог. наук(е-mail: kolelkbn@mail.ru) О.А. ЗЕМЛЯНУХИНА, канд. биолог. наук, Н.А. КАРПЕЧЕНКО, канд. биолог. наук
ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свёклы и сахара им. А.Л. Мазлумова»
Введение
Традиционные методы селекции сахарной свёклы являются слишком длительными, однако могут успешно дополняться современными приёмами биотехнологии. Метод гаплоидии на основе культивирования неоплодотворённых семязачатков in vitro открывает широкие возможности для селекции. Благодаря генетической однородности линий удвоенных гаплоидов представляется возможным уже в течение двух лет получать гомозиготный селекционный материал и тем самым сокращать период его создания для производства. Созданные гомозиготные линии, отличающиеся ценными признаками, являются перспективным исходным материалом для селекции [1].
Необходимыми условиями формирования гаплоидных регенерантов являются: первичная оценка морфологических признаков, проведение цитологического и цитофотометрического анализов плоидности [2]. Важными являются также биохимические исследования полиморфизма изо-ферментных спектров гаплоидных регенерантов, культивируемых in vitro, и молекулярное маркирование для выделения гомозиготных линий сахарной свёклы с ценными селекционными признаками.
В связи с этим выявление биохимических и молекулярно-генети-ческих характеристик созданных
линий удвоенных гаплоидов является актуальным.
Материалы и методы
В ходе экспериментов использовали селекционные материалы лаборатории ЦМС и лаборатории исходного материала ВНИИСС.
Изоферментный анализ проводили по методу Дэвиса в ПААГ [3, 4]. Совокупный белковый спектр растений сахарной свёклы выявляли с помощью ЭФ в 7,5 % ПААГ по стандартной методике Лэммли [5]. Количественное содержание белка выполнено по методу Брэдфорда [6].
Определение степени сходства митохондриального генома у гаплоидных регенерантов осуществляли с использованием реакции амплификации (ПЦР-анализ) и двух пар праймеров (nadl exonB — nadl ехопС, nadl BF2 - nadl BR3) [7]. Секвенирование полученных продуктов амплификации осуществляли по методу Сенжера [8]. Результаты электрофоретического фракционирования проводили с применением программного обеспечения Sequencing Analysis 6.
Результаты экспериментов
и их анализ
Для создания гомозиготных линий на основе гаплоидов большое значение имеет отбор с использованием диагностических признаков, обеспечивающих ценные селекционные свойства.
Биохимическая оценка выявила различия в уровне активности ферментов у опытных образцов. Гаплоидные растения по сравнению с контрольными исходными формами характеризовались повышенным количеством белка в 1,6 раза и усилением активности ферментов: пероксидазы — в 1,8 раза; глюкоз о-6-ф осфатдегидрогеназы — в 1,4 раза; изоцитратдегидро-геназы — в 1,75 раза. У растений после удвоения хромосом эти показатели возвращались к уровню контроля или незначительно превышали контроль (рис. 1).
По-видимому, выявленные различия в активности ферментов отражают более глубокие изменения в регуляции активности генов.
Распределение изоформ фермента 1- и 2-эстеразы (а- и Р-эстераза), показало различия во всех группах образцов: контрольные (К), гаплоидные (Г1—Г5), колхицинированные (ДГ1—ДГ5) (см. табл.).
Согласно современным представлениям можно предположить, что разная регуляция активности генов в растениях-регенерантах сахарной свёклы обусловлена метилированием ДНК соответствующих участков генома, связанных с функционированием белка [9].
Используя ДНК-маркеры, можно контролировать передачу генетической информации от донорских растений и проводить отбор на искомый селекционный
№ 7 • 2018 САХАР 11
СИСТЕМА УПРАВЛЕНИЯ ВЕГЕТАЦИЕЙ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ: эффективные ХСЗР, [Щ ЩЕЛКОВО
W агрохимикаты, высококачественные семена, полный цикл агросопровождения АГРОХИМ
controlled vegetation system WWW.betaren.rU
Мг/мл 0,25
Содержание белка
Общая активность ПО
ФЕ/мл 0,05
ФЕ/мл 0,05
^ V
Общая активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы
^ 5С
Общая активность изоцитратдегидрогеназы
Рис. 1. Распределение активности ферментов (К1 — контроль, К1-1, К1-2, К1-3 — гаплоидные растения; К1-1К, К1-2К, К1-3К—растения с удвоенным числом хромосом)
ccK2 ссааасдддасадддссаадс
ccKI-1 ссааасдддасадддссаадс
ccK2-1 ссааасдддасадддссаадс
ccK2-2 ссааасдддасадддссаадс
ссКЗ-2 ссааасдддасадддссаадс
ссКЗ-З ссааасдддасадддссаадс
ссКЗ ссааасдддасадддссаадс
ссКЗ-1 ссааасдддасадддссаадс
ссК1 ссааасдддасадддссаадс
**********************
tl taggttgtttaagtaagttgggtgacagatcggcca tl taggttgtttaagtaagttgggtgacagatcggcca tt taggttgtttaagtaagttgggtgacagatcggcca tl taggttgtttaagtaagttgggtgacagatcggcca tl taggttgtttaagtaagttgggtgacagatcggcca tl taggttgtttaagtaagttgggtgacagatcggcca tl taggttgtttaagtaagttgggtgacagatcggcca tl taggttgtttaagtaagttgggtgacagatcggcca
tl taggttgtttaagtaagttgggtgacagatcggcca *********************************
Рис. 2. Нуклеотидные последовательности амплифицированных фрагментов с использованием праймеров nad1 BF2 — nad1 ВЯЗ (К1, К2, К1-1, К2-1, К2-2 — фертильные формы; К3, К3-1, К3-2 — стерильные формы)
Распределение изоформ 1- и 2-эстеразы в растениях-регенерантах
сахарной свёклы *
Образец Rf К Г1 Г2 Г3 Г4 Г5 ДГ1 ДГ2 ДГ3 ДГ4 ДГ5
1-и 2-эстераза
0,18 ++ + + + + + + — — — — —
0,23 + + + + + + — — — — —
0,29 + — — — — — — — — — —
0,58 + + + + + + + + + + +
0,61 + + + + + + + + + + +
*(+) — степень выраженности изоформы
признак, например признак цитоплазма-тической мужской стерильности (ЦМС). Молекулярные исследования последних лет свидетельствуют, что стерильность цитоплазмы данной культуры обусловлена изменением нукле-отидной последовательности в митохон-дриальном и хлоро-пластном геноме [10].
Анализ митохондри-ального генома культивируемых регене-рантов, проведённый при помощи праймеров (nad1 BF2 — nad1 BR3), амплифици-рующих фрагменты второго интрона первой субъединицы гена фермента NADH dehydrogenas, показал присутствие и выров-ненность локусов ми-тохондриальной ДНК сахарной свёклы как контрольных, так и опытных образцов.
Молекулярно-гене-тические исследования амплифициро-ванных фрагментов ДНК митохондриаль-ного генома, позволяющие проводить прямое определение первичной структуры с использованием секвенирования, дали возможность геноти-пировать регенеран-ты по стерильному и фертильному типам цитоплазмы (рис. 2).
Это дало возможность провести кластеризацию и выделить в отдельные кластеры фертильные
12 САХАР № 7 • 2018
F^O ЩЕЛКОВО IfQrOTIIUlf RPH Для обработки сахарной свеклы в период вегетации, борьбы
ПЩП ДГРПУИМ ПШ ИI ПИПу Dill с кагатными гнилями на корнеплодах при закладке на хранение
AI гили IVI зоо г/л бензойной кислоты в виде органической соли ЗйШ.Шли c-J'jÜ чфктопц
россиискии аргумент защиты r J J^ j-J J
Рис. 3. Дендрограмма нуклеотидной последовательности амплифицированных фрагментов митохондриального генома сахарной свёклы с праймерами nadl BF2 - nadl BR3
(К1, К2, К1-1, К2-1, К2-2) и стерильные (К3, К3-1, К3-2) формы (рис. 3).
Полученные результаты свидетельствуют о том, что изменения структуры ДНК в митохондриаль-ном геноме, ассоциированные с цитоплазматической мужской стерильностью у растений сахарной свёклы, дают возможность проводить целенаправленный отбор регенерантов по генотипическим признакам на гаплоидном уровне.
Заключение
Проведённые биохимические и молекулярно-генетические исследования гаплоидов и растений-ре-генерантов удвоенных гаплоидов доказывают возможность геноти-пирования их по стерильному и фертильному типам цитоплазмы на ранних этапах развития в культуре in vitro, что позволяет сокращать процесс создания новых гомозиготных линий для селекции сахарной свёклы.
Список литературы
1. Шепель, Л.С. Морфогенез в культурi in vitro рiзних експлантв ярого ячменю (Hordeum vulgare L.) i одержання форм, стшких до борошнисто!" роси (Erysiphegraminis DCf. sp. hordei Marchai): Дис. ... канд. биолог. наук: 03.00.20. — 2007.
2. Жужжалова, Т.П. Гаплоидный партеногенез in vitro у сахарной свёклы (Beta vulgaris): факторы и
диагностические признаки / Т.П. Жужжалова [и др.] // Сельскохозяйственная биология. — 2016. — Т. 51. — № 5. — С. 636—644.
3. Davis, B.J. Disc Electrophoresis. II. Method and application to human serum proteins / B.J. Davis // Ann. N.Y. Acad. Sci., 1964. — V. 121. — P. 404—427.
4. Землянухина, О.А. Молеку-лярно-биохимические признаки гаплоидных и дигаплоидных рас-тений-регенерантов сахарной свёклы / О.А. Землянухина [и др.] // Научные труды V Съезда физиологов СНГ, V Съезда биохимиков России, Конференции ADFLIM. — ACTANATURAE/СПЕЦВЫ-ПУСК. Т. 2. — 2016. — С. 59.
5. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage. T. 4 /
U.K. Laemmli // Nature. — 1970. — V. 227. — № 5259. — P. 680—685.
6. Bradford, V.V. A rapid and sensitive method for the quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / V.V. Bradford // Anal. Biochem. — 1976. — V. 72. — № 4. — P. 417—422.
7. Soranzo, N. Patterns of variation at a mitochondrial sequence-tagged-site locus provides new insights into the postglacial history of European Pinussylvestris populations / N. Soranzo [and oth.] // Molecular Ecology 9 (9). — 1205—1211.
8. Sanger, F. Nucleotide sequence of bacteriophage phi X174 DNA / F. Sanger [and oth.] // Nature. — 1977.
— Feb. 24; 265(5596). — Р. 687—695.
9. Ванюшин, Б.Ф. Метилирование ДНК — эпигенетическая регуляция роста и развитие растений // Биология развития: морфогенез репродуктивных структур и роль соматических, стволовых клеток в онтогенезе и эволюции: Матер. Междунар. конф., посв. 50-летнему юбилею Лаборатории эмбриологии и репродуктивной биологии БИН РАН (13—16 декабря 2010 г.)
— М. : Товарищество научных изданий КМК, 2010. — С. 41—43.
10. Cheng, D. The distribution of normal and male-sterile cytoplasmsin Chinese sugar-beet germplasm / D. Cheng [and oth.] // Euphytica. — 2009. — V. 165. — P. 345—354.
Аннотация. Представлены результаты исследований по выявлению диагностических признаков гаплоидных регенерантов сахарной свёклы. Биохимическая оценка выявила различия распределения изоформ фермента 1- и 2-эстеразы (а- и p-эстераза), свидетельствующие о разной регуляции активности генов в растениях-регенерантах сахарной свёклы, обусловленных метилированием ДНК соответствующих участков генома. Молекулярно-генетические исследования с использованием секвенирования амплифицированных фрагментов ДНК митохондриального генома гаплоидных растений позволило генотипировать гаплоидные регенеранты по стерильному и фертильному типам цитоплазмы. Ключевые слова: сахарная свёкла, гаплоидные растения, метилирование ДНК, секвенирование.
Summary. The results of the investigations on revealing diagnostic traits of sugar beet haploid regenerants in are presented. Biochemical evaluation has revealed differences in distribution of 1- and 2-esterase (a- and p-esterase) enzyme isoforms that are indicative of different activity regulation of genes (during cell differentiation of sugar beet haploid regenerants) caused, probably, by methylation of DNA of corresponding genome sites. Molecular-genetic studies using sequencing of amplified DNA fragments of sugar beet mitochondrial genome have allowed haploid regenerants' genotyping according to sterile and fertile cytoplasm types.
Keywords: sugar beet, haploid plants, methylation, sequencing.
№ 7 • 2018 САХАР 13
СИСТЕМА УПРАВЛЕНИЯ ВЕГЕТАЦИЕЙ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ: эффективные ХСЗР, [Щ ЩЕЛКОВО
W агрохимикаты, высококачественные семена, полный цикл агросопровождения АГРОХИМ
controlled vegetation system WWW.betaren.rU
