CC BY-ND
22
4ШШ №12 (2161) ЗНиСО
33
r-Ь
в Республике Алтай (1 595,3), Новосибирской области (846,8), Республике Тыва (708,9), а низкие — в Санкт-Петербурге (215,8), Калининградской
(222.1), Еврейской АО (234,4), Амурской областях
(235.2). Если сгруппировать рассматриваемые приграничные территории по географическому местоположению, то для субъектов, расположенных в северо-западной европейской части, средний показатель обращений по поводу присасывания клеща на 100 тыс. населения равен 331,4; на Южном Урале — 463,2; в южной части Сибири — 670,1 и на Дальнем Востоке — 300,4.
Выводы.
1. Риск заболевания КВЭ наиболее высок для населения, проживающего в приграничных субъектах на юге Сибири.
2. Если рассматривать риск, продвигаясь вдоль границы в западном направлении, то он несколько уменьшается на Южном Урале и далее в приграничной северо-западной Европейской части.
3. На Дальневосточном направлении риск заражения значительно ниже, чем в Сибири. Конечно, такое деление территорий по риску заражения людей весьма условно, так как внутри субъекта на разных административных террито-
риях активность эпизоотического процесса в природных очагах может значительно отличаться.
ЛИТЕРАТУРА
1. Жигутиене М. Возбудители клещевых инфекций и распространение клещей вида I. ricinus в Литве //ЭпиНорт. 2009. Т. 10. № 2. С. 63—71.
2. Злобин В.И. Клещевой энцефалит в российской Федерации: современное состояние проблемы и стратегия профилактики //Вопр. вирусол. 2005. № 3. С. 26—32.
3. Конькова-Рейдман А.Б. и др. Актуальные аспекты эпидемиологического надзора за инфекциями, переносимыми клещами, на Южном Урале / А.Б. Конькова-Рейдман, В.И. Злобин, В.Н. Тарасов, Д.В. Тарасов //Здоровье населения и среда обитания. 2012. № 1 (226). С. 11—13.
4. Эпштейн Е. и др. Эпидемиологические тенденции заболеваемости клещевым энцефалитом в Эстонии / Е. Эпштейн, К. Кутсар //ЭпиНорт. 2009. Т. 10. № 2. С. 58—62.
5. Яаскеляйнен А. и др. Клещевой энцефалит в Финляндии / А. Яаскеляйнен, Е. Корхонен, М. Кууси, О. Вапалахти // ЭпиНорт. 2011. Т. 12. № 2. С. 40—43.
Контактная информация:
Андаев Евгений Иванович, тел.: 8 (3952) 22-00-70, е-mail: [email protected]
Contact information: Andaev Evgeny, рhone: 8 (3952) 22-00-70, e-mail: [email protected]
616.98:578.833.26:577.21
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И ЭВОЛЮЦИЯ ВИРУСОВ ГРУППЫ КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА В ДАЛЬНЕВОСТОЧНОМ ПРИРОДНОМ ОЧАГЕ
С.И. Беликов1, И.Г. Кондратов1, Т.Н. Леонова2 Лимнологический институт СО РАН, г. Иркутск 2Институт эпидемиологии и микробиологии СО РАМН, г. Владивосток
Материалы серии статей доложены на научной конференции с международным участием «Актуальные аспекты природной очаговости болезней» (г. Омск, 12—13 ноября 2014 г.), организованной при частичной поддержке гранта РФФИ № 14-04-20351
Представлены результаты молекулярно-генетического анализа флавивирусов, длительное время циркулирующих в Приморском природном очаге. Показано, что естественный инфекционный агент — вирус клещевого энцефалита — приобрел множество мутаций, приведших к снижению патогенности штаммов вируса для человека. Вирус Повассан, циркулирующий на североамериканском континенте, был однократно внесен в экосистему Приморья и образовал новый очаг инфекции, сменив переносчика и его хозяина-прокормителя. Вирус louping ill также был внесен в экосистему со сменой переносчика. Сделан вывод о возможности интродукции вирусов группы клещевого энцефалита в новые экосистемы, сопровождаемой сменой векторов и хозяев без существенных изменений в структуре вирусных геномов. Ключевые слова: природный очаг, вирусы клещевого энцефалита, Повассан, louping ill.
S.I. Belikov, I.G. Kondrashov, G.N. Leonova □ MOLECULAR GENETIC CHARACTERISTICS AND EVOLUTION OF TICK-BORNE ENCEPHALITIS VIRUSES GROUPS □ In Far Eastern natural fociLimnological Institute of the SB RAS, Irkutsk; Institute of Epidemiology and Microbiology of the SB RAMS, Vladivostok.
The article presents the results of a molecular-genetic study of flaviviruses circulating for a long time in the Primorsky natural focus. It is shown that the natural infectious agent — virus encephalitis got many mutations that led to a decrease in the pathogenicity of strains of the virus to humans. Powassan virus circulating in North America was once introduced into the ecosystem of Primorye and formed a new source of infection by changing the carrier and its host. Louping ill virus has also been introduced into an ecosystem with the change of the carrier. It is concluded that the possibility of introduction of viruses group of tick-borne encephalitis in the new ecosystem, followed by the change of the vectors and hosts without significant changes in the viral genome.
Key words: naturalfocus, tick-borne encephalitis virus, Powassan, louping ill virus.
Введение. Клещевой энцефалит (КЭ) является типичной трансмиссивной инфекцией, переносимой иксодовыми клещами, обитающими в лесной или лесостепной зоне. Возбудителем заболевания является вирус, содержащий одноце-
почечную РНК положительной полярности, принадлежащий роду Flavivirus семейства Flaviviridae. Род Flavivirus включает около 80 видов, многие из которых являются патогенными для человека. Вирус клещевого энцефалита подразделяют
34
ЗНиСО pm №12 (261)
на дальневосточный (Far-Eastern), сибирский (Siberian) и европейский (Western) субтипы [1]. На крайнем западе в Великобритании циркулирует вирус louping ill, родственный европейскому субтипу вируса КЭ, переносимый клещами Ixodes ricinus [2]. На североамериканском континенте циркулирует флавивирус, подразделяемый на вирус Powassan, переносимый клещами I. cookie, и deer tick virus, переносимый I. scapularis [3].
Целью данного исследования является молекулярно-генетическое описание особенностей эволюции дальневосточного субтипа вируса КЭ в течение 30 лет наблюдений и молекулярно-генетическая характеристика флавивирусов Powassan и louping ill, образующих на территории Приморья собственные природные очаги.
Материалы и методы. Изоляция штаммов. Выделение штаммов ВКЭ было выполнено, как описано ранее [4]. Вкратце, для изоляции штаммов от умерших пациентов были использованы образцы мозга, для изоляции штаммов от пациентов с лихорадочным либо бессимптомным течением заболевания была использована венозная кровь. Все штаммы были выделены с помощью интрацеребральной инъекции вируссодержащей суспензии в 2-дневных мышей инбредных линий. Мониторинг клинических проявлений заболевания у животных осуществлялся ежедневно в течение 2—3 недель.
Выделение РНК и синтез к ДНК. Суммарную РНК экстрагировали из 10 % суспензии мозга или суспензии плазмы в PBS с использованием тризола LS (Life Science, USA) в соответствии с рекомендациями изготовителя. Затем РНК осаждали этанолом, промывали дважды по 1 мл 80 %-м этанолом и высушивали на воздухе в течение 5 мин. Осадок РНК повторно суспендировали в 50 мкл свежей Milli-Q воды и использовали в качестве матрицы в реакции обратной транскрипции. Для приготовления кДНК смесь 5 мкл РНК, 50 пМ смеси гекса-нуклеотидов, 200 мМ каждого NTP, 5 мМ MgCl2, 200 ед. ревертазы MMLV (Promega, Madison, WI) и Milli-Q воды до суммарного объема 50 мкл инкубировали при 42 °C в течение 30 мин. Полученные образцы кДНК осаждали равными объемами изо-пропанола и хранили в виде суспензии.
Амплификация фрагментов генома. Олиго-нуклеотидные праймеры для амплификации были сконструированы на основе сравнения ранее опубликованных последовательностей полных геномов штаммов флавивирусов и их перечень опубликован ранее [5—8]. Для амплификации смесь 0,5 мкл кДНК, по 50 мкм соответствующих смыслового и антисмыслового ПЦР-праймеров, 25 мкл 2х PCR Mix (Ферментас, Литва) и воды до общего объема 50 мл инкубировали при 95 °C в течение 1 мин, а затем проводили 25 циклов амплификации в режиме: 96 °C в течение 5 с, 57 °C в течение 5 с и 72 °C в течение 30 с. Ампликоны были очищены электрофорезом в 0,75 % геле агарозы (Promega, США) в 1хТАЕ буфере. Окрашенные бромистым этидием фрагменты ДНК вырезали и элюировали из геля с помощью метода замораживания-оттаивания [9].
Секвенирование фрагментов ДНК. Для каждой реакции секвенирования от 50 до 100 нг очищенного фрагмента ДНК были смешаны с 3,2 пмоль
одного из праймеров и с реакционным коктейлем, содержащим четыре дидеоксинуклеотидных "— терминатора, меченых красителем BigDye V 3,1 (Life Science, USA). Реакцию проводили в режиме ^ 25 циклов амплификации с параметрами: 96 °C в -у течение 30 с, 50 °C в течение 60 с, а 60 °C в тече- i—v ние 4 мин. Продукты реакции осаждали смесью ^^ этанол-ацетат калия, осадок растворяли в 16 мкл е подавляющего реагента, нагревали в течение 2 мин при 95 °C и выдерживали на льду до загрузки в секвенатор Applied Biosystems Prism 3100.
Сборка геномов. Перекрывающиеся нуклео-тидные последовательности объединяли с помощью программного пакета BioEdit v.7.2.0. Последовательность нуклеотидов была переведена в последовательность аминокислот на онлайн портале (http://web.expasy.org/translate). Нуклеотидные и предсказанные аминокислотные последовательности штаммов были депонированы в базе GenBank, (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), соответствующие инвентарные номера приведены в статьях [5—8]. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности выравнивали и сравнивали между собой по программе MAFFT версии 7 на сайте сервера mafft.cbrc.jp/alignment.
Филогенетический анализ. Филогенетический анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей был выполнен с использованием метода максимального правдоподобия (ML). Филогенетические деревья строили с использованием метода ML TreeFinder [10]. Наиболее подходящую модель эволюции определяли с помощью jModelTest версия 0.1 [11]. Филогенетические деревья рассчитывали с использованием модели GTR+C+I бутсреп методом с 1 000 повторами и визуализировали программой FigTree 1.12 (http:// tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/)
Результаты и обсуждение. В исследование эволюции вируса КЭ были взяты 35 штаммов, из них 11 штаммов, выделенных от пациентов, умерших от энцефалита, 4 штамма — от пациентов с лихорадочной формой заболевания и 20 штаммов — от инфицированных людей без клинических симптомов заболевания [4—6].
Были проанализированы также 10 штаммов вируса Повассан, причем 4 штамма были выделены из клещей Dermacentor silvarum, Haemaphysalis japonica и H. longicornis, 4 штамма из крови пациентов без клинических симптомов заболевания и 2 штамма от умерших от энцефалита людей [7].
Два штамма вируса louping ill были выделены от клещей I. persulcatus и один штамм из крови инфицированного пациента [8].
Детальное описание времени и районов выделения штаммов, исследование их биологических и молекулярно-генетических свойств, включая проведение филогенетического анализа, дано нами ранее [4—8] и здесь не приводится.
Известно, что заражение дальневосточным субтипом вируса КЭ часто ассоциируется с тяжелым течением заболевания, так, коэффициент летальности в первой половине XX в. достигал 20— 40 % и более, также отмечалось большое количество тяжелых неврологических осложнений. В то же время известно, что приблизительно две трети случаев заболевания, вызванных вирусом КЭ, протекает бессимптомно. Так, Павловский в сво-
4ШШ №12 (2161) ЗНиСО
35
ей монографии отмечал, что «Вирофорные клещи "— могут или вызывать заболевания людей клещевым энцефалитом разной тяжести и с разным исходом, ^ или играть роль как бы живой вакцины, иммуни--у зирующей людей против заболевания энцефалитом» [12]. Различная тяжесть заболевания может ^^ быть обусловлена множеством причин, в том чис-е ле молекулярно-генетическими особенностями штаммов вируса КЭ. Мы секвенировали полные геномы 35 штаммов вируса КЭ, вызвавших различную тяжесть заболевания у людей и выяснили, что тяжесть заболевания строго коррелируют с особенностями вирусного генома. Выявлены 17 мутаций в геноме вируса КЭ, приводящие к полному снижению патогенности штаммов для человека, в том числе 3 ключевых мутации, которые, по-видимому, влияют на патогенность штаммов. Эти мутации приводят к делеции одной аминокислоты в капсидном белке и к замене 2-х аминокислот в вирусной протеазе. Совокупность этих замен может влиять на скорость размножения вируса посредством образования большого количество дефектных вирусных частиц, не содержащих РНК. Такие частицы не являются инфекционными, но способны вызывать образование защитных антител [13]. Отмечены также характерные замены в неструктурных вирусных белках N81 и N85, однако механизм влияния этих замен на патоген-ность штаммов остается неясным. Возможно, что указанные замены являются случайными либо компенсаторными, необходимыми для выживания мутантных вариантов вируса, и не влияют на патогенность штаммов. Важно отметить, что все штаммы, выделенные от инфицированных пациентов без клинических симптомов заболевания были получены после 1990 г. во время снижения заболеваемости клещевым энцефалитом в Приморском крае. В связи с этим можно предположить, что нам удалось проследить изменчивость генома вируса КЭ при затухании эпидемического процесса. По-видимому, подобными изменениями в геноме вируса КЭ можно объяснить наблюдаемые периодические изменения заболеваемости, но для доказательства этого положения необходимо определять последовательности всего генома вируса, а не его отдельных фрагментов. Так, изменения в поверхностном белке проанализированных штаммов никак не коррелируют с важнейшим показателем заболеваемости — пато-генностью штаммов вируса КЭ.
В отличие от вируса КЭ, естественный приро-дый очаг которого был описан и изучен в 1939 г. [14], обнаруженные нами штаммы вируса Повассан имеют другое происхождение. Результаты филогенетического анализа показали, что предковой формой всех штаммов является штамм LB вируса Повассан, впервые выделенный в Канаде от умершего мальчика в 1958 г. [15]. Важно отметить, что эволюция дальневосточных и североамериканских вариантов вируса Повассан проходила в разных направлениях. Отсутствие миграции хозяев или переносчиков вируса между двумя континентами указывает на искусственное однократное внедрение вируса в экосистему Приморья с образованием своеобразного нового очага, который существует более 30 лет. Успешная интродукция вируса произошла не только в новую территорию,
но и сопровождалась сменой переносчиков — клещей I. cookie или I. marxi североамериканского континента, на Dermacentor silvarum, Haemaphysalis japonica и H. Longicornis в Приморье.
Другим примером искусственной интродукции вируса в новый биотоп являются штаммы вируса louping ill, выделенные нами из клещей I. persulcatus в 1977 и 1979 гг. и из крови пациента с субклиническим течением заболевания в 1991 г. Их ближайшим родственником является штамм вируса Negishi, выделенный в Японии единственный раз [16]. Вирус Negishi является типичным представителем вируса louping ill, его ближайшим родственником является штамм LI/A, выделенный в Англии [17]. Вирус Negishi не смог «прижиться» в экосистеме Японии, в то время как в Приморье длительное время существует природный очаг циркуляции вируса louping ill.
Таким образом, вирусы комплекса клещевого энцефалита могут быть занесены в новые биотопы, со сменой векторов и их хозяев без существенных изменений в вирусных геномах.
ЛИТЕРАТУРА
1. Virus taxonomy: classification and nomenclature of viruses: Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. (2012) In: King AMQ, Adams MJ, Carstens EB, Lefkowitz EJ, editors. San Diego: Elsevier.
2. Shiu S.Y., Ayres M.D., Gould E.A. Genomic sequence of the structural proteins of louping ill virus: comparative analysis with tick-borne encephalitis virus. Virology. 1991; 180: 411-415.
3. Deardorff E.R., Nofchissey R.A., Cook J.A., Hope A.G., Tsvetkova A., Talbot S.L., Ebel G.D. Powassan virus in mammals, Alaska and New Mexico, U.S.A., and Russia, 20042007. Emerg Infect Dis. 2013; 19(12): 2012-2016.
4. Leonova G.N., Belikov S.I., Kondratov I.G., Takashima I. Comprehensive assessment of the genetics and virulence of tick-borne encephalitis virus strains isolated from patients with inapparent and clinical forms of the infection in the Russian Far East. Virology. 2013; 443(1): 89-98.
5. LeonovaG.N., Maystrovskaya O.S., Kondratov I.G., Takashima I., Belikov S.I. The nature of replication of tick-borne encephalitis virus strains isolated from residents of the Russian Far East with inapparent and clinical forms of infection. Virus Res. 2014; 189: 34-42.
6. Belikov S.I., Kondratov I.G., Potapova U.V., Leonova G.N. The relationship between the structure of the tick-borne encephalitis virus strains and their pathogenic properties. PLoS One. 2014; 9(4): e94946. doi: 10.1371/journal.pone.0094946).
7. Leonova G.N., Kondratov I.G., Ternovoi V.A., Romanova E.V., Protopopova E.V., Chausov E.V., Pavlenko E.V., Ryabchikova E.I., Belikov S.I., Loktev V.B. Characterization of Powassan viruses from Far Eastern Russia. Arch Virol. 2009; 154(5): 811-820.
8. Leonova G.N., Kondratov I.G., Maystrovskaya O.S., Takashima I., Belikov S.I. Louping ill virus (LIV) in the Far East. Archives of Virology. 2014; 159 (in press).
9. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989.
10. Jobb G., von Haeseler A., Strimmer K. TREEFINDER: a powerful graphical analysis environment for molecular phylogenetics. BMC Evol Biol. 2004; 4: 18.
11. Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rate of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. J Mol Evol. 1980; 16: 111-120.
12. Pavlovsky E.N. Natural nidality of transmissible diseases, with special reference to the landscape epidemiology of zooanthroponoses. Urbana, Ill.: University of Illinois Press; 1966.
13. Smith T.J., Brandt W.E., Swanson J.L., et al. Physical and biological properties of dengue-2 virus and associated antigens. J Virol. 1970; 5:524-532.
14. Zilber, L.A. Spring (spring-summer) epidemical tick-borne encephalitis. Arch.Biol. Nauk. 1939; 56 (2): 9-37. (in Russian).
36
ЗНиСО pm №12 (261)
15. McLean D.V, Donohue W.L. Powassan virus: isolation of virus from a fatal human case of encephalitis. Can Med Assoc J. 1959; 80: 708-712.
16. Ando K., Kuratsuka S., Arima S., Hironaka N., Honda Y., Ishii K. Studies on the viruses isolated during epidemic of Japanese B encephalitis in 1948 in Tokyo area. Kitasato Exp Med. 1952: 24: 557-562.
17. Venugopal K., Buckley A., Reid H.W. and Gould E.A. Nucleotide sequence of the envelope glycoprotein of Negishi
virus shows very close homology to louping ill virus. Virology. 1992; 190: 515-521._
УДК 616.993-097.1
Контактная информация:
Беликов Сергей Иванович, тел.: 8 (395) 251-18-74, e-mail: [email protected] Contact information: Belikov Sergei, phone: 8 (395) 251-18-74, e-mail: [email protected]
ПОЛУЧЕНИЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ АНТИГЕНОВ КЛЕЩЕВЫХ А-ПРОТЕОБАКТЕРИЙ
Л.В. Кумпан1,2, Н.В. Рудаков1,2, И.Е. Самойленко2, А.П. Красиков, Н.В. Абрамова 12,
Т.А. Решетникова2, Е.В. Матущенко1, 2
'ГБОУ ВПО «Омская государственная медицинская академия», г. Омск 2ФБУН «Омский НИИ природно-очаговых инфекций», г. Омск
Материалы серии статей доложены на научной конференции с международным участием «Актуальные аспекты природной очаговости болезней» (г. Омск, 12—13 ноября 2014 г.), организованной при частичной поддержке гранта РФФИ № 14-04-20351
Представлены результаты получения и экспериментальное изучение антигенов клещевых а-протеобактерий (риккетсий и анаплазм). Эксперимент был проведен на перевиваемых культурах клеток Vero и Hep-2, с использованием штаммовриккетсий«5/98-Караганда» генотип R.sp. RpA 4 и «23/95-Еланда» генотип R. sp. DnS 28. В работе также были использованы гипериммунизированные кролики штаммом анаплазм (A.sp.Omsk). С помощью культуры клеток получены культуральные антигены для РНИФ, позволяющие выявлять антитела у серонегативных клещевых больных. С использованием культур клеток Vero выделен и изучен первый в России штамм анаплазм (Anaplasma sp.Omsk). Установлена возможность накопления биомассы анаплазм и получен цельнорастворимый антиген для проведения диагностических исследований.
Ключевые слова: штаммыриккетсий«5/98-Караганда» генотип R.sp. RpA 4 и «23/95-Еланда» генотип R. sp. DnS28, культура клеток Vero, Hep-2,штамм анаплазм Anaplasma.sp. Omsk гипериммунизированные кролики.
L.V. Kumpan, N.V. Rudakov, I.E. Samojlenko, A.P. Krasikov, N.V. Abramova, T.A. Reshetnicova, E.V. Matuschenko □ PRODUCTION AND EXPERIMENTAL STUDY OF TICK-BORNE a-PROTEOBACTERIA ANTIGENS □ SBEI HE «Omsk State Medical Academy», Omsk; Omsk Research Institute of natural focal infections, Omsk.
In the article the results of producing and the experimental study of tick-borne a- proteobacteria antigens (rickettsiae and Anaplasma) are presented. The experiment was conducted on a continuous culture of Vero and Hep-2 cells, using strains of Rickettsia «5/98-Karaganda» genotype R.sp. RpA 4 and «23/95-Elanda» genotype R. sp. DnS 28. In our research we also used rabbits which were hyperimmunized with the strain of Anaplasma (A.sp.Omsk). Using the cell culture we derived antigens which enable us to detect the antibodies in reaction of indirect immunofluorescence among seronegative patients with tick-borne encephalitis. Using cultures of Vero cells the first Russian strain of Anaplasma (Anaplasma sp.Omsk) was isolated and studied. We found a possibility of accumulating Anaplasma biomass for obtaining soluble antigen for diagnostic studies.
Key words: Rickettsia strains «5/98-Karaganda» genotype R.sp. RpA 4and «23/95-Elanda» genotype R. sp. DnS 28, Vero cell culture, Hep-2 cell culture, Anaplasma strain Anaplasma.sp. Omsk, hyper immunized rabbits.
ü
Введение. Серологические методы до сих пор остаются основными для лабораторной диагностики заболеваний, вызываемых клещевыми а — протеобактериями. При этом одним из наиболее значимых методов является реакция непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ).
Постановка серологических реакций требует наличия набора специфических антигенов и антисывороток. Применительно к риккетсиям и анаплазмам это связано с необходимостью массового накопления определенных штаммов микроорганизмов, наиболее универсальной моделью для этого являются культуры клеток. Полученные антигены могут эффективно использоваться для лабораторной диагностики в различных серо-
логических реакциях, поскольку коммерческие антигены из риккетсий и анаплазм в России в настоящее время не выпускают [3,4—7].
Методика приготовления водорастворимого антигена. С целью получения антигенов нами были накоплены инфицированные риккетсия-ми и анаплазмами культуры клеток Vero и Hep-2. Зараженные клетки накапливали в течение 8 пассажей. Перед приготовлением антигена зараженные культуры клеток подвергали центрифугированию при 5 000 оборотах в минуту течение 15 мин, далее убирали супернатант, а из полученной взвеси делали мазки, которые окрашивали по Романовскому—Гимза. После микроскопического контроля во взвесь зараженных
