CC BY
28
ISSN 2221-7711 Национальные приоритеты России. 2014. № 3 (13)
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
УДК 616.98:578.833.26:577.21
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И ЭВОЛЮЦИЯ ВИРУСОВ ГРУППЫ КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА В ДАЛЬНЕВОСТОЧНОМ ПРИРОДНОМ ОЧАГЕ
Беликов С.И.1, Кондратов И.Г.1, Леонова Г.Н.2 Лимнологический институт СО РАН, Иркутск 2Институт эпидемиологии и микробиологии СО РАМН, Владивосток
В статье представлены результаты молекулярно-генетического анализа флавивирусов, длительное время циркулирующих в Приморском природном очаге. Показано, что естественный инфекционный агент - вирус клещевого энцефалита - приобрел множество мутаций, приведших к снижению па-тогенности штаммов вируса для человека. Вирус Повассан, циркулирующий на североамериканском континенте, был однократно внесен в экосистему Приморья и образовал новый очаг инфекции, сменив переносчика и его хозяина-прокормителя. Вирус loupingill также был внесен в экосистему со сменой переносчика. Сделан вывод о возможности интродукции вирусов группы клещевого энцефалита в новые экосистемы, сопровождаемой сменой векторов и хозяев без существенных изменений в структуре вирусных геномов.
Ключевые слова: природный очаг, вирусы клещевого энцефалита, Повассан, loupingill.
MOLECULAR GENETIC CHARACTERISTICS AND EVOLUTION OF TICK-BORNE ENCEPHALITIS VIRUSES GROUPSIN FAR EASTERN NATURAL FOCI
S.I. Belikov, I.G. Kondrashov, Leonova G.N.1 Limnological Institute of the SB RAS, Irkutsk institute of Epidemiology and Microbiology of the SB RAMS, Vladivostok
The article presents the results of a molecular-genetic study of flaviviruses circulating for a long time in the Primorsky natural focus. It is shown that the natural infectious agent - virus encephalitis got many mutations that led to a decrease in the pathogenicity of strains of the virus to humans. Powassan virus circulating in North America was once introduced into the ecosystem of Primorye and formed a new source of infection by changing the carrier and its host. Louping ill virus has also been introduced into an ecosystem with the change of the carrier. It is concluded that the possibility of introduction of viruses group of tick-borne encephalitis in the new ecosystem, followed by the change of the vectors and hosts without significant changes in the viral genome.
Keywords: natural focus, tick-borne encephalitis virus, Powassan, louping ill virus.
Молекулярно-генетические исследования
Введение. Клещевой энцефалит (КЭ) является типичной трансмиссивной инфекцией, переносимой иксодовыми клещами, обитающими в лесной или лесостепной зоне. Возбудителем заболевания является вирус, содержащий одноцепочечную РНК положительной полярности, принадлежащий роду Flavivirus семейства Flaviviridae. Род Flavivirus включает около 80 видов, многие из которых являются патогенными для человека. Вирус клещевого энцефалита подразделяют на дальневосточный (Far-Eastern), сибирский (Siberian) и европейский (Western) субтипы [1]. На крайнем западе в Великобритании циркулирует вирус loupingill, родственный европейскому субтипу вируса КЭ, переносимый клещами Ixodesricinus [2]. На североамериканском континенте циркулирует флавивирус подразделяемый на вирус Powassan, переносимый клещами I. cookie, и deer tick virus, переносимый I. scapularis [3].
Целью данного исследования является мо-лекулярно-генетическое описание особенностей эволюции дальневосточного субтипа вируса КЭ в течении 30 лет наблюдений и молекулярно-генетическая характеристика флавивирусов Powassan и louping ill, образующих на территории Приморьясобственные природные очаги.
Материалы и методы
Изоляция штаммов. Выделение штаммов ВКЭ было выполнено как описано ранее [4]. Вкратце, для изоляции штаммов от умерших пациентов были использованы образцы мозга, для изоляции штаммов от пациентов с лихорадочным либо бессимптомным течением заболевания была использована венозная кровь. Все штаммы были выделены с помощью интрацеребральной инъекции вируссодержащей суспензии в 2-дневных мышей инбредных линий. Мониторинг клинических проявлений заболевания у животных осуществлялся ежедневно в течении 2-3 недель.
Выделение РНК и синтез кДНК. Суммарную РНК экстрагировали из 10% суспензии мозга или суспензии плазмы в PBS с использованием тризола LS (LifeScience, USA) в соответствии с рекомендациями изготовителя. Затем РНК осаждали этанолом, промывали дважды по 1 мл 80% этанолом и высушивали на воздухе в течение 5 мин. Осадок РНК повторно суспендировали в 50 мкл свежей Milli-Q воды и использовали в качестве матрицы в реакции обратной транскрипции. Для приготовления кДНК смесь 5 мкл РНК, 50 пМ смеси гексануклеотидов, 200 мМ каждого NTP, 5 мМ MgCl2, 200 ед. ревертазы MMLV (Promega, Madison, WI) и Milli-Q воды до суммарного объема 50 мкл инкубировали при 42 оС в течение 30 мин. Полученные образцы кДНК осаждали
равными объемами изопропанола и хранили в виде суспензии.
Амплификация фрагментов генома.
Олигонуклеотидные праймеры для амплификации были сконструированы на основе сравнения ранее опубликованных последовательностей полных геномов штаммов флавивирусов и их перечень опубликован ранее [5-8]. Для амплификации смесь 0,5 мкл кДНК, по 50 мкм соответствующих смыслового и антисмыслового ПЦР-праймеров, 25 мкл 2х PCR Mix (Ферментас, Литва) и воды до общего объема 50 млинкубировали при 95 оС в течение 1 мин, а затем проводили 25 циклов амплификации в режиме: 96 оС в течение 5 сек, 57 оС в течение 5 секунд и 72 оС в течение 30 сек. Ам-пликоны были очищены электрофорезом в 0,75 % геле агарозы (Promega, США) в 1хТАЕ буфере. Окрашенные бромистым этидиемфрагменты ДНК вырезали и элюировали из геля с помощью метода замораживания-оттаивания [9].
Секвенирование фрагментов ДНК. Для каждой реакции секвенирования от 50 до 100 нг очищенного фрагмента ДНК были смешаны с 3,2 пмоль одного из праймеров и с реакционным коктейлем, содержащим четыре дидеокси-нуклеотидных терминатора, меченых красителем BigDye V 3,1 (Life Science, USA). Реакцию проводили в режиме 25 циклов амплификации с параметрами: 96 оС в течение 30 с, 50 оС в течение 60 с, а 60 оС в течение 4 мин. Продукты реакции осаждали смесью этанол-ацетат калия, осадок растворяли в 16 мкл подавляющего реагента, нагревали в течение 2 мин при 95 оС и выдерживали на льду до загрузки в секвенатор Applied Biosystems Prism 3100.
Сборка геномов. Перекрывающиеся нук-леотидные последовательности объединяли с помощью программного пакета BioEdit v.7.2.0. Последовательность нуклеотидов была переведена в последовательность аминокислот на онлайн портале(http://web.expasy.org/translate). Нуклео-тидные и предсказанные аминокислотные последовательности штаммов были депонированы в базе GenBank, (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), соответствующие инвентарные номераприведены в статьях [5-8]. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности выравнивали и сравнивали между собой по программе MAFFT версии 7 на сайте сервера mafft.cbrc.jp/alignment.
Филогенетический анализ. Филогенетический анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей был выполнен с использованием метода максимального правдоподобия (ML). Филогенетические деревьястроили с использованием метода ML TreeFinder [10]. Наиболее подходящую модель эволюции определяли с помощью
ISSN 2221-7711 Национальные приоритеты России. 2014. № 3 (13)
jModel Test версия 0.1 [11]. Филогенетические деревья рассчитывали с использованием модели GTR+C+I бутсреп методом с 1000 повторами и визуализировали программой FigTree1.12 (http:// tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/)
результаты и обсуждение
В исследование эволюции вируса КЭ были взяты 35 штаммов, из них 11 штаммов, выделенных от пациентов, умерших от энцефалита, 4 штамма - от пациентов с лихорадочной формой заболевания и 20 штаммов - от инфицированных людей без клинических симптомов заболевания [4-6].
Было проанализировано также 10 штаммов вируса Повассан, причем 4 штамма были выделены из клещей Dermacentor silvarum, Haemaphysalis japonica и H. longicornis, 4 штамма из крови пациентов без клинических симптомов заболевания, и 2 штамма от умерших от энцефалита людей [7].
Два штамма вируса loupingill были выделены от клещей I. persulcatus и один штамм из крови инфицированного пациента [8].
Детальное описание времени и районов выделения штаммов, исследование их биологических и молекулярно-генетических свойств, включая проведение филогенетическогоанализадано нами ранее [4-8] и здесь не приводится.
Известно, что заражение дальневосточным субтипом вируса КЭ часто ассоциируется с тяжелым течением заболевания, так, коэффициент летальности в первой половине ХХ века достигал 20-40 % и более, также отмечалось большое количество тяжелых неврологических осложнений. В тоже время известно, что приблизительно две трети случаев заболевания, вызванных вирусом КЭ, протекает бессимптомно. Так, Павловский в своей монографии отмечал, что «Вирофорные клещи могут или вызывать заболевания людей клещевым энцефалитом разной тяжести и с разным исходом, или играть роль как бы живой вакцины, иммунизирующей людей против заболевания энцефалитом» [12]. Различная тяжесть заболевания может быть обусловлена множеством причин, в том числе молекулярно-генетичес-кими особенностями штаммов вируса КЭ. Мы сек-венировали полные геномы 35 штаммов вируса КЭ, вызвавших различную тяжесть заболевания у людей и выяснили, что тяжесть заболевания строго коррелируют с особенностями вирусного генома. Выявлено 17 мутаций в геноме вируса КЭ, приводящие к полному снижению патоген-ности штаммов для человека, в том числе 3 ключевых мутации, которые, по-видимому, влияют на патогенность штаммов. Эти мутации приводят к делеции одной аминокислоты в капсидном бел-
ке и к замене двух аминокислот в вирусной про-теазе. Совокупность этих замен может влиять на скорость размножения вируса посредством образования большого количество дефектных вирусных частиц, не содержащих РНК. Такие частицы не являются инфекционными, но способны вызывать образование защитных антител [13]. Отмечены также характерные замены в неструктурных вирусных белках NS1 и NS5, однако механизм влияния этих замен на патогенность штаммов остается неясным. Возможно, что указанные замены являются случайными, либо компенсаторными, необходимыми для выживания мутантных вариантов вируса, и не влияют на патогенность штаммов. Важно отметить, что все штаммы, выделенные от инфицированных пациентов без клинических симптомов заболевания были получены после 1990 г, во время снижения заболеваемости клещевым энцефалитом в Приморском крае. В связи с этим можно предположить, что нам удалось проследить изменчивость генома вируса КЭ при затухании эпидемического процесса. По-видимому, подобными изменениями в геноме вируса КЭ можно объяснить наблюдаемые периодические изменения заболеваемости, но для доказательства этого положения необходимо определять последовательности всего генома вируса, а не его отдельных фрагментов. Так, изменения в поверхностном белке проанализированных штаммов никак не коррелируют с важнейшим показателем заболеваемости - патогенностью штаммов вируса КЭ.
В отличие от вируса КЭ, естественный природный очаг которого был описан и изучен в 1939 г [14],обнаруженные нами штаммы вируса Повассан имеют другое происхождение. Результаты филогенетического анализапоказали, что предковой формой всех штаммов является штамм LB вируса Повассан, впервые выделенный в Канаде от умершего мальчика в 1958 г. [15]. Важно отметить, что эволюция дальневосточных и североамериканских вариантов вируса Повассан проходила в разных направлениях. Отсутствие миграции хозяев или переносчиков вируса между двумя континентами указывает на искусственное однократное внедрение вируса в экосистему Приморья с образованием своеобразного нового очага, который существует более 30 лет. Успешная интродукция вируса произошла не только в новую территорию, но и сопровождалась сменой переносчиков - клещей I. cookie или I. marxi североамериканского континента, на Dermacentor silvarum, Haemaphysalis japonica и H. longicornis в Приморье.
Другим примером искусственной интродукции вируса в новый биотоп являются штаммы
Молекулярно-генетические исследования
вируса loupingill, выделенные нами из клещей I. persulcatus в 1977 и 1979 гг. и из крови пациента с субклиническим течением заболевания в 1991 г. Их ближайшим родственником является штамм вируса Negishi, выделенный в Японии единственный раз [16]. Вирус Negishi является типичным представителем вируса loupingill, его ближайшим родственником является штамм LI/A,
выделенный в Англии [17]. Вирус Negishi не смог «прижиться» в экосистеме Японии, в то время как в Приморье длительное время существует природный очаг циркуляции вируса loupingill.
Таким образом, вирусы комплекса клещевого энцефалита могут быть занесены в новые биотопы, сосменой векторов и их хозяев без существенных изменений в вирусных геномах.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Virus taxonomy: classification and nomenclature of viruses: Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. (2012) In: King AMQ, Adams MJ, Carstens EB, Lefkowitz EJ, editors. San Diego: Elsevier
2. Shiu S.Y., Ayres M.D., Gould E.A. Genomic sequence of the structural proteins of louping ill virus: comparative analysis with tick-borne encephalitis virus. Virology.1991; 180: 411-415
3. Deardorff E.R., Nofchissey R.A., Cook J.A., Hope A.G., Tsvetkova A., Talbot S.L., Ebel G.D. Powassan virus in mammals, Alaska and New Mexico, U.S.A., and Russia, 2004-2007. Emerg Infect Dis. 2013; 19(12): 2012-2016
4. Leonova G.N., Belikov S.I., Kondratov I.G., Takashima I. Comprehensive assessment of the genetics and virulence of tick-borne encephalitis virus strains isolated from patients with inapparent and clinical forms of the infection in the Russian Far East. Virology.2013; 443(1): 89-98
5. Leonova G.N., Maystrovskaya O.S., Kondratov I.G., Takashima I., Belikov S.I. The nature of replication of tick-borne encephalitis virus strains isolated from residents of the Russian Far East with inapparent and clinical forms of infection. Virus Res. 2014; 189: 34-42
6. Belikov S.I., Kondratov I.G., Potapova U.V., Leonova G.N. The relationship between the structure of the tick-borne encephalitis virus strains and their pathogenic properties. PLoS One. 2014; 9(4): e94946. doi: 10.1371/journal.pone.0094946).
7. Leonova G.N., Kondratov I.G., Ternovoi V.A., Romanova E.V., Protopopova E.V., Chausov E.V., Pavlenko E.V., Ryabchikova E.I., Belikov S.I., Loktev V.B. Characterization of Powassan viruses from Far Eastern Russia. Arch Virol. 2009; 154(5): 811-820.
8. Leonova G.N., Kondratov I.G., Maystrovskaya O.S., Takashima I., Belikov S.I. Louping ill virus (LIV) in the Far East. Archives of Virology. 2014; 159 (in press).
9. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989.
10. Jobb G., von Haeseler A., Strimmer K. TREEFINDER: a powerful graphical analysis environment for molecular phylogenetics. BMC Evol Biol. 2004; 4: 18.
11. Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rate of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. J MolEvol.1980; 16: 111-120.
12. Pavlovsky E.N. Natural nidality of transmissible diseases, with special reference to the landscape epidemiology of zooanthroponoses. Urbana, Ill.: Univers ityofIllinoisPress; 1966.
13. Smith T.J., Brandt W.E., Swanson J.L., et al. Physical and biological properties of dengue-2 virus and associated antigens. J Virol. 1970;5: 524-532.
14. Zilber, L.A. Spring (spring-summer) epidemical tick-borne encephalitis. Arch.Biol. Nauk. 1939; 56 (2): 9-37 (in Russian).
15. McLean D.V, Donohue W.L. Powassan virus: isolation of virus from a fatal human case of encephalitis. Can Med Assoc J.1959; 80: 708-712.
16. Ando K., Kuratsuka S., Arima S., Hironaka N., Honda Y., Ishii K. Studies on the viruses isolated during epidemic of Japanese B encephalitis in 1948 in Tokyo area. KitasatoExp Med.1952: 24: 557-562.
17. Venugopal K., Buckley A., Reid H.W. and Gould E.A. Nucleotide sequence of the envelope glycoprotein of Negishi virus shows very close homology to louping ill virus. Virology.1992;190: 515-521.
Беликов Сергей иванович - доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией Лимнологического института Сибирского отделения СО РАН;
Кондратов илья Геннадьевич - старший научный сотрудник Лимнологического института Сибирского отделения СО РАН; Леонова Галина николаевна - заведующая лабораторией Института эпидемиологии и микробиологии СО РАМН.
© С.И. Беликов, И.Г. Кондратов, Г.Н. Леонова, 2014 Статья поступила в редакцию 26 сентября 2014 г.
