CC BY-ND
22
36
ЗНиСО pm №12 (261)
15. McLean D.V, Donohue W.L. Powassan virus: isolation of virus from a fatal human case of encephalitis. Can Med Assoc J. 1959; 80: 708-712.
16. Ando K., Kuratsuka S., Arima S., Hironaka N., Honda Y., Ishii K. Studies on the viruses isolated during epidemic of Japanese B encephalitis in 1948 in Tokyo area. Kitasato Exp Med. 1952: 24: 557-562.
17. Venugopal K., Buckley A., Reid H.W. and Gould E.A. Nucleotide sequence of the envelope glycoprotein of Negishi
virus shows very close homology to louping ill virus. Virology. 1992; 190: 515-521._
УДК 616.993-097.1
Контактная информация:
Беликов Сергей Иванович, тел.: 8 (395) 251-18-74, e-mail: sergeibelikov47@gmail.com Contact information: Belikov Sergei, phone: 8 (395) 251-18-74, e-mail: sergeibelikov47@gmail.com
ПОЛУЧЕНИЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ АНТИГЕНОВ КЛЕЩЕВЫХ А-ПРОТЕОБАКТЕРИЙ
Л.В. Кумпан12, Н.В. Рудаков12, И.Е. Самойленко2, А.П. Красиков, Н.В. Абрамова 12,
Т.А. Решетникова2, Е.В. Матущенко1,2
'ГБОУ ВПО «Омская государственная медицинская академия», г. Омск 2ФБУН «Омский НИИ природно-очаговых инфекций», г. Омск
Материалы серии статей доложены на научной конференции с международным участием «Актуальные аспекты природной очаговости болезней» (г. Омск, 12—13 ноября 2014 г.), организованной при частичной поддержке гранта РФФИ № 14-04-20351
Представлены результаты получения и экспериментальное изучение антигенов клещевых а-протеобактерий (риккетсий и анаплазм). Эксперимент был проведен на перевиваемых культурах клеток Vero и Hep-2, с использованием штаммовриккетсий«5/98-Караганда» генотип R.sp. RpA 4 и «23/95-Еланда» генотип R. sp. DnS 28. В работе также были использованы гипериммунизированные кролики штаммом анаплазм (A.sp.Omsk). С помощью культуры клеток получены культуральные антигены для РНИФ, позволяющие выявлять антитела у серонегативнъх клещевых больных. С использованием культур клеток Vero выделен и изучен первый в России штамм анаплазм (Anaplasma sp.Omsk). Установлена возможность накопления биомассы анаплазм и получен цельнорастворимый антиген для проведения диагностических исследований.
Ключевые слова: штаммыриккетсий«5/98-Караганда» генотип R.sp. RpA 4 и «23/95-Еланда» генотип R. sp. DnS28, культура клеток Vero, Hep-2,штамм анаплазм Anaplasma.sp. Omsk гипериммунизированные кролики.
L.V. Kumpan, N.V. Rudakov, I.E. Samojlenko, A.P. Krasikov, N.V. Abramova, T.A. Reshetnicova, E.V. Matuschenko □ PRODUCTION AND EXPERIMENTAL STUDY OF TICK-BORNE a-PROTEOBACTERIA ANTIGENS □ SBEI HE «Omsk State Medical Academy», Omsk; Omsk Research Institute of natural focal infections, Omsk.
In the article the results of producing and the experimental study of tick-borne a- proteobacteria antigens (rickettsiae and Anaplasma) are presented. The experiment was conducted on a continuous culture of Vero and Hep-2 cells, using strains of Rickettsia «5/98-Karaganda» genotype R.sp. RpA 4 and «23/95-Elanda» genotype R. sp. DnS 28. In our research we also used rabbits which were hyperimmunized with the strain of Anaplasma (A.sp.Omsk). Using the cell culture we derived antigens which enable us to detect the antibodies in reaction of indirect immunofluorescence among seronegative patients with tick-borne encephalitis. Using cultures of Vero cells the first Russian strain of Anaplasma (Anaplasma sp.Omsk) was isolated and studied. We found a possibility of accumulating Anaplasma biomass for obtaining soluble antigen for diagnostic studies.
Key words: Rickettsia strains «5/98-Karaganda» genotype R.sp. RpA 4and «23/95-Elanda» genotype R. sp. DnS 28, Vero cell culture, Hep-2 cell culture, Anaplasma strain Anaplasma.sp. Omsk, hyper immunized rabbits.
ü
Введение. Серологические методы до сих пор остаются основными для лабораторной диагностики заболеваний, вызываемых клещевыми а — протеобактериями. При этом одним из наиболее значимых методов является реакция непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ).
Постановка серологических реакций требует наличия набора специфических антигенов и антисывороток. Применительно к риккетсиям и анаплазмам это связано с необходимостью массового накопления определенных штаммов микроорганизмов, наиболее универсальной моделью для этого являются культуры клеток. Полученные антигены могут эффективно использоваться для лабораторной диагностики в различных серо-
логических реакциях, поскольку коммерческие антигены из риккетсий и анаплазм в России в настоящее время не выпускают [3,4—7].
Методика приготовления водорастворимого антигена. С целью получения антигенов нами были накоплены инфицированные риккетсия-ми и анаплазмами культуры клеток Vero и Hep-2. Зараженные клетки накапливали в течение 8 пассажей. Перед приготовлением антигена зараженные культуры клеток подвергали центрифугированию при 5 000 оборотах в минуту течение 15 мин, далее убирали супернатант, а из полученной взвеси делали мазки, которые окрашивали по Романовскому—Гимза. После микроскопического контроля во взвесь зараженных
4ШШ №12 (2161) ЗНиСО
37
клеток добавляли физиологический раствор и '— 0,5 %-й фенол.
После тщательного встряхивания в шейкере ^ пробирки с зараженной клеточной взвесью помещали в рефрижератор на 3—4 дня для осаждения lj посторонних белковых примесей. ^^ После выдерживания в рефрижераторе клее точную взвесь подвергали многократной эфирной обработке по [4]. Полученные антигены испытывали в перекрестной РСК на специфичность и чувствительность. После испытания антиген разливали в ампулы по 1,0 мл и лиофильно высушивали. Высушенный антиген хранили при температуре —20 °С.
Получение цельнорастворимого риккетсиоз-ного антигена и его изучение.
Для получения цельнорастворимого антигена необходимо было накопить биомассу риккетсий в культуре клеток Vero и Нер-2. В данной работе были использованы 2 штамма риккетсий:
1) «5/98-Караганда» генотип R.sp. RpA 4;
2) «23/95-Еланда» генотип R. sp. DnS 28.
Культивирование риккетсий генотипов R. sp.
RpA 4 и R. sp. DnS28 штаммы «5/98-Караганда» и «23/95-Еланда», проводилось на протяжении 11 пассажей (срок наблюдения). На протяжении 11 пассажей у генотипов R.sp. RpA 4 и R. sp. DnS28 отмечали незначительные дегенеративные изменения в обеих клеточных культурах. Наши наблюдения подтверждают наблюдения авторов [2] о том, что риккетсии оказывают цитопатическое действие на клетки, хотя оно выражено менее четко, чем при культивировании вирусов.
При обработке данных однофакторным дисперсионным анализом максимальное накопление риккетсий в культуре клеток Vero у генотипа генотип R. sp. DnS28 штамм «23/95-Еланда», наблюдали на 7—8 пассаже, а в культуре клеток Нер-2 на 3—4 пассаже.
У генотипа R. sp. RpA 4 штамм «5/98-Караганда» максимальное накопление в культуре клеток Vero и Hep-2 наблюдали на 9—10 пассаже. Как показал однофакторный дисперсионный анализ, значительных различий по уровню накопления риккетсий в культуре клеток Vero и Hep-2 не наблюдалось (F < F05).
Из накопленной биомассы риккетсий генотипов R.sp. RpA 4 и R.sp. DnS 28 R. raoultii готовили цельнорастворимый риккетсиальный антиген, полученный в соответствии с [1]. Исходным материалом для приготовления цельнораствори-мых антигенов являлась зараженная клеточная
взвесь. Полученные серии антигенов были исследованы в перекрестном РСК с коммерческими сыворотками R. sibirica и R. prowazekii, перекрестной антигенной реактивности не отмечено. Далее антиген проверен в перекрестной РСК с сыворотками больных. Сыворотки были получены из эпидемического очага клещевого риккет-сиоза в Алтайском крае и не эндемичного района по клещевому риккетсиозу Новосибирской области. Результаты исследования сывороток представлены в табл. 1.
При исследовании 174 сывороток от больных с клещевыми инфекциями из Усть-Таркского района Новосибирской области и 21 сыворотки от больных из Алтайского края в РСК с антигеном R. sibirica получен отрицательный результат. Выявлено 12 (6,8 ± 1,9) % больных из Усть-Таркского района и 9 (42,8 ± 10,8) % больных из Алтайского края, сыворотки крови которых положительно реагировали в РСК с антигенами риккетсий генотипов, относящихся к новому виду R. raoultii. С антигенами R. sp. RpA 4 и R.sp. DnS 28 сыворотки больных реагировали одинаково, поскольку, вероятно, эти генотипы риккетсий имеют близкую к 100 % гомологию и относятся к одному виду R. raoultii.
Получение анаплазмозного антигена и его экспериментальное изучение. Задачей опыта было получить диагностическую анаплазмозную иммунную сыворотку и изучить её специфичность и активность в РНИФ.
Для гипериммунизации использовали 8-суточ-ную культуру полевого штамма A. sp. Omsk, полученную на культуре клеток Vero. Для выделения анаплазм из клеток использовали способ попеременного замораживания (при —20 °С — 30 мин) и размораживания при комнатной температуре. После оттаивания клеточную взвесь центрифугировали при 3 000 g в течение 15 мин. Для дальнейшей работы использовали супернатант, который центрифугировали при 6 000 g в течение часа. Полученный осадок трижды отмывали стерильным физиологическим раствором, центрифугируя в том же режиме, и доводили до концентрации 1,7 х 109 микробных тел в 1 мл по ОСМ ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Гипериммунизацию проводили на 3 кроликах породы шиншилла весом 2,5—3,0 кг по схеме, указанной в табл. 2.
Антиген для гипериммунизации готовили из штамма A.sp.Omsk и использовали после инактивации в водяной бане при 70 °С в течение 30 мин в концентрации 1 млрд микробных тел. Титры
Таблица 1. Результаты исследования сывороток крови клещевых больных в РСК с антигенами риккетсий новых генотипов
Административная территория Количество обследованных Положительные результаты исследований с антигенами
R. sibirica R.sp. RpA 4(R. raoultii) R.sp. DnS 28 (R. raoultii)
абс. абс. % абс. %
Новосибирская область (с. Усть-Тарка) 174 0 12 6,8 ± 1,9 12 6,8 ± 1,9
Алтайский край 21 0 9 42,8 ± 10,8 9 42,8 ± 10,8
Таблица 2. Схема гипериммунизации кроликов культурами анаплазм
Время введения, сут. 1 4 7 10 14 18 22 30
Доза антигена, млрд. м.т. 0,85 1,7 1,7 1,7 3,4 3,4 3,4 Полное обескровливание
38
ЗНиСО pm №12 (2С1)
Таблица 3. Специфичность и активность анаплазмозных: антигена и кроличьей сыворотки в РНИФ
Антигены Анаплазмозная сыворотка
1/5 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320
A.sp. Omsk + + + + + + +
Микоплазмы + - - - - - -
Бруцеллы + - - - - - -
Хламидии + - - - - - -
Антиген Сыворотки 1/10
анаплазмозная микоплазмозная бруцеллезная хламидиозная ИРТ листериозная лептоспирозная
A.sp. Omsk + - - - - - -
антител учитывали на 7, 14, 22 и 30 сутки после введения A. sp. Omsk.
Из полученной гипериммунной сыворотки готовили ряд последовательных двукратных разведений на физиологическом растворе, начиная с 1 : 5. Разведения делали микродозатором в пластиковых планшетах.
Реакцию непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) ставили по следующей методике. На чистые тщательно обезжиренные предметные стекла наносили параллельно друг другу несколько капель антигена. Антиген высушивали и фиксировали над пламенем спиртовки. Затем на каждую каплю антигена наносили равную по объёму каплю сыворотки из каждого разведения, начиная с последнего. Одновременно ставили контроль:
1. Антиген + сыворотка положительная.
2. Антиген + сыворотка отрицательная.
3. Антиген + физиологический раствор.
Стёкла выдерживали во влажной камере при
37—38 °С в течение 50—60 мин для образования комплекса антиген—антитело. После чего их промывали дистиллированной водой от не связавшихся антител, подсушивали и наносили в красящем титре (подобранном опытным путём) ослиный антикроличий глобулин, меченный ФИТЦ (флуоресцеин изотиоционатом натрия), изготовленный НИИ ЭМ им. Н.Ф. Гамалеи. Затем стёкла помещали на 15—20 мин во влажную камеру при температуре 37—38 °С. По истечении этого времени мазки промывали дистиллированной водой, просушивали и просматривали в люминесцентном микроскопе.
7 14 22 30
Время после иммунизации, сутки □ полевой штамм A. sp. Omsk
Рис. 1. Динамика синтеза антител у кроликов, иммунизированных культурой анаплазм
Интенсивность свечения оценивали в крестах: очень яркая люминесценция по периферии микробной клетки, чётко контрастирующая с телом клетки, — ++++; яркая люминесцирующая периферия клетки — +++; слабое свечение периферии клетки — ++ или +; при отрицательной реакции люминесценция клеток отсутствует. За положительный результат принимали яркое специфическое свечение контуров микробов в виде ободков с оценкой в 3 и 4 креста; сомнительные результаты оценивали в 2 креста при наличии слабого свечения контуров клеток.
Полученная при гипериммунизации антисыворотка была изучена на специфичность и активность в РНИФ. В ходе этого изучения выяснили, что антисыворотка, полученная на кроликах, была строго специфична к антигену, против которого она получена. Анаплазмозная сыворотка, полученная путем гипериммунизации кроликов анаплазмами, выделенными от больной коровы, в разведении 1 : 5 давала перекрестную реакцию с микоплазмами, бруцеллами, хламидиями, а в разведениях 1 : 20, 1 : 40 и 1 : 320 была строго специфична к анаплазмам (табл. 3).
При этом высокий уровень антител регистрировали на 22—30 сутки после начала гипериммунизации, до 1 : 320 ± 153,2 (рис. 1).
Сыворотка, полученная нами при гипериммунизации кроликов, обладает строгой специфичностью к гомологичному возбудителю в титрах до 1 : 320. Полученная сыворотка может использоваться в РНИФ индикации и идентификации возбудителя анаплазмоза крупного рогатого скота, изучения его антигенных свойств и родства, патогенеза болезни.
Полученные результаты свидетельствуют об актуальности дальнейшей разработки диагностических препаратов на основе риккетсий группы КПЛ. Полученные антигены использованы для создания диагностических тест-систем на основе ИФА и РНИФ. Анаплазмозный антиген может применяться для РНИФ и других серологических методов диагностики для выявления антител.
ЛИТЕРАТУРА
1. Здродовский П.Ф. и др. Учение о риккетсиях и риккетсио-зах / П.Ф. Здродовский, Е.М. Голиневич. 3-е изд., пере-раб. и доп. М.: Медицина.1972. 496 с.
2. Паутов В.Н. и др. Биология риккетсий / В.Н. Паутов, А.И. Игумнов. М. 1968. С. 27.
3. Шпынов С.Н. и др. Молекулярное типирование риккетсий, анаплазм и эрлихий в иксодовых клещах в Российской Федерации и Республике Казахстан / С.Н. Шпынов, Н.В. Рудаков, Р.-Е. Роигтег, D. РаоиН //Здоровье населения и среда обитания. 2012. № 1 (226). С. 33—35.
ЦШШ №12 (261) ЗНиСО
39
I.H
6.
Graigie J. Application and control of ethyl-ether-walter interface effect to separation of rickettsia from yolk sac/ Graigie J.// Canad. Res., E. 1945. 8. 23. 104—114. Шпынов С.Н. и др. Новые данные о распространении риккетсий RpA4 и R.aeschlimannii в Северной Азии / С.Н. Шпынов, Н.В. Рудаков, М.А. Танкибаев [и др.] //Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. 2002. Т. 2. №4. С. 136-138. Samoylenko I.E., Rudakov N.V., Shpynov S.N., et al. Study of biological characteristics of spotted fever group rickettsial genotypes RpA4, DnS14 and DnS28 // Ann. NY Acad. Sci. 2003. Vol.990. P. 612-616.
Mediannikov O. et al. Rickettsia raoultii sp.nov., a spotted fever group rickettsia associated with Dermacentor ticks in Europe and Russia / O. Mediannikov, K. Matsumoto, I. Samoylenko [et al] //Int .J.Syst.Evol. Microbiol. 2008. №58. P. 1635—1639.
Контактная информация: Contact Information:
Кумпан Людмила Валерьевна, Kumpan Lyudmila, тел.: 8 (923) 685-32-93, '
е-mail: Ludmilavirus@mail.ru
V-
phone: тел.: 8 (923) 685-32-93, e-mail: Ludmilavirus@mail.ru
616.98:578.833.6:577.21
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА, ВЫДЕЛЕННЫХ В 1958-1960 ГОДАХ В ПРИМОРСКОМ КРАЕ
И.Г. Кондратов1, Т.Н. Леонова2, О.С. Майстровская2, С.И. Беликов1 'Лимнологический институт СО РАН, г. Иркутск 2НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН, г. Владивосток
Материалы серии статей доложены на научной конференции с международным участием «Актуальные аспекты природной очаговости болезней» (г. Омск, 12—13 ноября 2014 г.), организованной при частичной поддержке гранта РФФИ № 14-04-20351
Охарактеризованы геномы 8 штаммов вируса клещевого энцефалита (КЭ), выделенные в период с 1958 по 1960 год из различных источников. Предсказанные аминокислотные последовательности полипротеина характерны для дальневосточного субтипа вируса КЭ. Филогенетический анализ штаммов по предсказанным аминокислотным последовательностям позиционирует все штаммы в ветвь Софьино-подобных штаммов. У трех штаммов ВКЭ обнаружена обширная делеция в гене NS4 протяженностью 30 аминокислотных остатков. Кроме того, у трех штаммов вируса КЭ обнаружена гетерогенность в 3' нетранслируемой области генома.
Ключевые слова: вирус клещевого энцефалита, геном, репликация, патогенность.
I.G. Kondratov, G.N. Leonova, O.S. Maistrovskaya, S.I. Belikov □ MOLECULAR-GENETIC CHARACTERISTIC TICK-BORNE ENCEPHALITIS VIRUS STRAINS, ISOLATED ON RUSSIAN FAR-EAST REGION IN 1958—1960 □ Limnological Institute of the SB RAS, Irkutsk; Institute of Epidemiology and Microbiology of the SB RAMS, Vladivostok.
In this work we describe molecular-genetic properties 9 full genomes of tick-borne encephalitis virus strains, isolated in Far East region during period 1958 to 1960from various sources. The predicted amino acid sequences of the polyprotein gene are similar of the Far Eastern subtype tick-borne encephalitis virus. Phylogenetic analysis predicted amino acid sequences shown are highly homology to Sofjin-like trains. Three strains detected extensive deletion length 30 amino acid residues in the NS4B ' gene, without loss ofpathogenicity. Additionally, the heterogeneity found in the 3 'untranslated region in the three strains.
Key words: tick-borne encephalitis virus, genome, replication, pathogenicity.
Клещевой энцефалит (КЭ) является наиболее значимой трансмиссивной природно-очаговой вирусной инфекцией лесной зоны Евразийского континента. Заболеваемость КЭ регистрируют более чем в 25 странах Европы и 7 странах Азии, в Российской Федерации (РФ) — на 46 административных территориях, в том числе на 18 территориях Сибири и Дальнего Востока. В Российской Федерации в 1990-х гг. ежегодно регистрировали более 10 тысяч случаев КЭ. В 2000-х гг. интенсивный показатель заболеваемости КЭ по РФ стал заметно снижаться
[1]. Несмотря на его снижение в 2006 г. до 2.44 на 100 тыс. населения, по мнению Г.Г. Онищенко
[2], эпидемическая ситуация по КЭ в РФ остается напряженной.
На данный момент существует ряд работ, посвященных поиску взаимосвязи между структурой вирусного генома и тяжестью заболевания [3, 4]. Между тем, все имеющиеся работы опираются на достаточно современный материал. Самый «старый» геном вируса КЭ датируется 1938 годом (штамм Софьин), а далее имеется перерыв в несколько десятилетий. Для понимания механизмов эволюции вируса КЭ наиболее актуальным
на сегодняшний день является анализ материала, отражающего динамику накопления изменений в вирусном геноме. Целью данной работы является анализ структуры геномов более «ранних» штаммов вируса КЭ дальневосточного субтипа, датируемых 1958-1960 гг.
Материалы и методы. Суммарную РНК выделяли реагентом Trizol (Life Technology) согласно протоколу фирмы-производителя. Синтез первой цепи кДНК осуществляли с помощью набора Maxima Reverse Transcriptase (Thermo Scientific) с использованием четырнадцатичленного олигонукле-отидного праймера 5'-GGAAAAACACCCGC-3', комплементарного 3'нетранслируемому участку генома. Амплификацию проводили с использованием набора High Fidelity PCR Enzyme Mix (Thermo Scientific). Ампликоны фрагментов геномов, содержащих 3' нетранслируемую область, клонировали в вектор pTZ-57R, анализ рекомбинантов осуществляли посредством амплификации с использованием стандартных универсальных плаз-мидных олигонуклеотидных праймеров. Анализ ампликонов осуществляли в агарозном геле по общепринятым методикам. Секвенирование полученных ампликонов осуществляли с использо-
