CC BY
160
УДК 582.333 + 57.065 + 575.86
МОЛЕКУЛЯРНО-ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ - НОВЫЙ ПОДХОД К СИСТЕМАТИКЕ ПЕЧЕНОЧНИКОВ
А.А. Вильнет, Н.А. Константинова
Полярно-альпийский ботанический сад-институт им. Н.А. Аврорина КНЦ РАН
Аннотация
Дается краткий обзор современных успехов молекулярной филогенетики печеночников. Приводятся основные результаты изучения систематики листостебельных печеночников подпорядков Cephaloziineae и Jungermaniineae на основе нуклеотидных
последовательностей внутренних транскрибируемых спейсеров ^1-2 рибосомного оперона ядерной ДНК и участка trnL-F хлоропластной ДНК.
Ключевые слова:
печеночники (Marchantiophyta), Cephaloziineae, Jungermaniineae, молекулярная
филогенетика, геносистематика, таксономия.
Печеночники представляют собой группу высших наземных растений, основной особенностью которых, наряду с мхами и антоцеротовыми, является преобладание гаметофитной
(гаплоидной) фазы в жизненном цикле. Длительное время эти растения объединяли под общим названием мохообразные, предполагая их происхождение от единого общего предка. Современное разнообразие печеночников, по разным оценкам, насчитывает от 5 до 8 тыс. видов [1]. Наибольшую роль виды этой группы играют в растительном покрове северных и горных районов. Печеночники имеют очень разные типы организации вегетативного тела - от слоевищ до листостебельных форм (рис. 1, 2). Размер слоевищных форм может достигать нескольких сантиметров, а размеры листостебельных печеночников, значительно преобладающих по видовому разнообразию, колеблются от 1-2 мм до нескольких сантиметров. Печеночники не имеют достаточно прочных тканей, сохранность ископаемого материала крайне низкая, поэтому прямых свидетельств их эволюции очень мало. Наиболее древние остатки, достоверно относящиеся к печеночникам, сохранились из девона [2].
Рис. 2. Листостебельный печеночник из рода Mаcrodiplophyllum (Н. Buch) Н. Perss.
Рис. 1. Слоевищный печеночник Blasia ртШа L.
К концу XX в. стало очевидно, что традиционная систематика группы в определенном смысле зашла в тупик. Доводы сторонников разных концепций базировались на недоказуемых предположениях (например, первичность слоевищных или листостебельных форм и пр.), поэтому предпочтение той или другой системы, было делом «вкуса» исследователя. Таксономический «вес»
признаков трактовался по-разному, в результате чего некоторые таксоны «перемещались» из одних родов и даже семейств в другие, причем неоднократно. Молекулярно-филогенетические методы дали новый импульс к развитию систематики печеночников и в значительной степени изменили сложившиеся к концу XX в. представления.
Сравнительный анализ нуклеотидного состава молекул ДНК разных организмов и возможность интерпретации его результатов с точки зрения эволюционного подхода дали начало новому направлению в биологии - молекулярной филогенетике, или геносистематике, основоположником которого в России был акад. А.Н. Белозерский. Бурное развитие геносистематики, связанное с автоматизацией и компьютеризацией всего исследовательского процесса, отмечается в последние два десятилетия. При этом использование метода геносистематики позволяет решать не только фундаментальные вопросы филогенеза и таксономии разных групп организмов, но и прикладные биомедицинские проблемы.
Использование молекулярно-филогенетического анализа, восстанавливающего генеалогию организмов по изменениям наследственного материала - ДНК, накапливающимся в ходе филогенеза, кардинально изменило представления о филогенезе растений. Установлено, что мохообразные являются искусственной сборной группой, при этом печеночники, мхи и антоцеротовые имеют независимое происхождение и представляют собой три отдела или даже надотдела [3-5]. Однако относительно положения этих отделов в системе высших растений нет единого мнения. Несмотря на то, что в недавних наиболее полных работах [6] печеночники занимают базальное положение на филогенетическом древе высших растений, т.е. являются самыми древним наземными высшими растениями, некоторые авторы считают эти доводы недостаточными и представляют связи печеночников, мхов и антоцеротовых в виде неразрешенной политомии [7].
Достигнутые к настоящему времени успехи в области молекулярно-эволюционных исследований печеночников заключаются в выявлении общей схемы их филогении [8, 9] и разработке на ее основе новой систематики отдела [10], которая кардинально отличается от систем, общепризнанных всего несколько десятилетий назад, основанных на разных сценариях эволюции спорофита и гаметофита [11]. Молекулярно-филогенетические данные подтвердили, что печеночники с просто организованным талломом объединялись в один таксон (Metzgeriidae) искусственно [8, 9, 12]. На филогенетическом древе печеночников бывшие метцгериевые распределились по нескольким удаленным друг от друга кладам, что стало свидетельством неоднократного возникновения в ходе эволюции слоевищной и листостебельной форм организации печеночников. На основе трех филумов, выявленных при молекулярно-филогенетических исследованиях, в систематике печеночников выделяют три класса: Haplomitriopsida, Marchantiopsida и Jungermanniopsida [10]. К настоящему времени макрофилогения печеночников в общих чертах выявлена. Приоритетным направлением геносистематики печеночников становится филогения и систематика таксонов более низкого ранга -порядков, семейств и родов.
Геносистематика печеночников в России на протяжении почти десяти лет активно развивается коллективом исследователей из Полярно-альпийского ботанического сада-института и Института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова. Объектами наших исследований являются листостебельные печеночники двух крупных подпорядков - Cephaloziianeae Schljakov и Jungermanniineae R.M. Schust. ех Stotler & Сга^.^ой., среди таксонов которых есть как широко распространенные в Голарктике, так и редкие виды. Систематика этих групп претерпела значительные изменения за последние несколько лет: изменились представления о положении и составе семейств, входящих в них родов, статусе видов и внутривидовых таксонов [13].
В данной работе подводятся некоторые итоги исследований, основанных на анализе филогенетических построений по последовательностям генов транспортной РНК лейцина и фенилаланина хлоропластной ДНК (trnL-F) и двум внутренним транскрибируемым спейсерам рибосомного оперона ядерной ДНК (П^1-2) (рис. 3).
Рис. 3. Схема филогенетических связей печеночников подпорядков Серка^гтеае (1) и Jungermaniineae (2), реконструированных с помощью байесовского анализа объединенных последовательностей ITS1-2 ядДНК и trnL-F хпДНК. Пунктиром обозначены филумы таксонов, положение которых нестабильно. Указана принадлежность родов семействам. Синим цветом отмечены роды, выделенные на основе морфомолекулярных данных
Итоги изучения подпорядка Cephaloziineae
Систематика подпорядка Cephaloziineae на уровне семейств пока не однозначна: объем семейств и их количество (от 4 до 6) трактуется различно. Наше внимание сосредоточено на изучении филогении и систематике семейств Cephaloziaceae Mig., Scapaniaceae Mig. и Anastrophyllaceae L. Soederstt., De Roo et Hedd. Объем типового семейства подпорядка Cephaloziaceae понимается неодинаково. Так, K. Muller [14], а затем и Р.Н. Шляков [15] выделяли самостоятельное семейство Odontoshismataceae (Grolle) Schljakov. Отдельное семейство Hygrobiellaceae Mull. Frib. приводится в работе S. Arnell [16]. R. Schuster [17] оба эти таксона рассматривает как подсемейства в
семействе Cephaloziaceae. В современной морфомолекулярной системе [10] Cephaloziaceae трактуется в широком смысле. Целенаправленные исследования систематики семейства Cephaloziaceae до начала наших работ не проводились. Нами установлено, что семейство Cephaloziaceae s.l. является не монофилетичным [13]. Семейства Odontoshismataceae и Cephaloziaceae на филогенетических деревьях имеют сестринские связи, в то время как Hygrobiellaceae крайне от них обособленно и имеет нестабильное положение на древе. Очевидно, узкая трактовка Cephaloziaceae с обособлением самостоятельных семейств Odontoshismataceae и Hygrobiellaceae более целесообразна. Распределение таксонов семейств Cephaloziaceae и Odontoshismataceae поддерживается признаками наличия/отсутствия масляных телец в клетках и числом клеточных слоев, формирующих стенку коробочки спорогона. В частности, роды Cephalozia (Dumort.) Dumort., Pleurocladula Grolle, Schofieldia Godfrey и Nowellia Mitt. не имеют масляных телец, стенка коробочки двухслойная. Cladopodiella H. Buch и Odontoshisma (Dumort.) Dumort. характеризуются 2-4-слойной стенкой коробочки (2-слойная у Alobielopsis и Iwatsukia), а также различными по структуре и строению масляными тельцами. Нами выявлено, что роды Cephalozia, Cladopodiella и Odontoshisma не являются монофилетичными. Монотипные роды Pleurocladula, Schofieldia, а также род Nowellia входят в состав клады рода Cephalozia, а виды родов Cladopodiella и Odontoshisma формируют две смешанные клады [19]. Необходима ревизия указанных таксонов и переоценка их основных диагностических признаков.
Изучение внутривидовой вариабельности нуклеотидных последовательностей позволило сделать важные для практической систематики выводы. В частности, мы подтвердили видовую самостоятельность Cephalozia otaruensis Steph. и Cephalozia affinis Lindb. ex Stephani, которые ранее рассматривались как внутривидовые таксоны Cephalozia bicuspidata (L.) Dumort. и Cephalozia lunulifolia (Dumort.) Dumort. соответственно.
Уже в первых работах по молекулярной филогении печеночников [20] было показано, что сем. Scapaniaceae «разбивает» сем. Lophoziaceae на две клады, последнее, таким образом, оказывается парафилетичным, и, как следствие, таксоны сем. Lophoziaceae включаются в сем. Scapaniaceae [12]. Позже была обоснована необходимость выделения из «разросшегося» сем. Scapaniaceae монофилетичной группы таксонов бывшего Lophoziaceae в новое семейство [11], которое описано как Anastrophyllaceae [21]. Одновременно нами было показано, что роды Lophozia (Dumort.) Dumort. s.str., Schistochilopsis (Kitag.) Konstant., Tritomaria Schiffn. ex Loeske, Protolophozia (R.M. Schust.) Schljakov, Orthocaulis H. Buch и Crossogyna (R.M.Schust.) Schljakov являются полифилетичными [11]. На основе молекулярного и морфологического подходов мы выделили 7 новых родов: Pseudotritomaria Konstant. & Vilnet, Heterogemma (Joerg.) Konstant. & Vilnet, Lophoziopsis Konstant. & Vilnet, принадлежащих сем. Scapaniaceae, а также Pseudolophozia (Konstant. & Vilnet), Schljakovianthus Konstant. & Vilnet, Schljakovia Konstant. & Vilnet и Biantheridion (Grolle) Konstant. & Vilnet из сем. Anastrophyllaceae [22].
Результаты анализа локусов ITS1-2 и trnL-F на сравнительно большом числе таксонов подтверждают видовую самостоятельность Scapania tundra fArnell) H. Buch, Scapania paludosa (Muell. Frib.) Muell. Frib., Scapania crassiretis Bryhn [23], а также недавно описанного вида - Lophozia lantratoviae Bakalin [24].
Несмотря на то, что явление гибридизации широко известно у покрытосеменных растений, у печеночников отмечены лишь единичные случаи. Всего в этой группе выявлено чуть меньше десяти видов, имеющих гибридное происхождение [25]. Используя молекулярно-филогенетический подход, мы обнаружили, что относительно редкий арктический приокеанический вид Севера Евразии и Гренландии Barbilophozia rubescens (R.M.Schust. et Damsh.) Kartt. et L.Soederstr. имеет гибридное происхождение от B. hatcheri (A.Evans) Loeske и B. barbata (Schmidel ex Schreb.) Loeske [26].
Один из важных результатов, полученных нами в ходе молекулярных исследований, заключается в том, что географически удаленные популяции некоторых видов (Pseudolopozia debiliformis (R.M. Schust. & Damsh.) Konstant. & Vilnet, P. sudetica (Nees ex Huebener) Konstant. & Vilnet, Lophozia silvicoloides Kitag.) имеют очень незначительные отличия изученных геномных локусов, а вариабельность у таких видов, как Lophoziopsis excisa (Dicks.) Konstant. & Vilnet и Schistochilopsis opacifolia (Culm. ex Meyl.) Konstant., очень велика [27]. Выяснение значимых молекулярно-генетических различий для видов у разных групп печеночников представляется важной задачей.
Итоги изучения подпорядка Jungermanniineae
В настоящее время в составе подпорядка Jungermanniineae выделяется 15 семейств, 4 из которых монотипные, а 3 - содержат по два рода [10]. Нами изучаются таксоны из крупных семейств Gymnomitriaceae H. Klinggr., Jungermanniaceae Rchb. и Solenostomataceae Stotler & Crand.-Stotl., а также олиготипных семейств Delavayellaceae R.M. Schust. и Myliaceae Schljakov.
В последнее время отнесение видов к родам Gymnomitrion Corda или Marsupella Dumort. (сем. Gymnomitriaceae) базировалось на характерном облике, складывающемся из совокупности признаков побега, формы листа и типа его прикрепления к стеблю [17]. Молекулярно-филогенетический анализ показал, что таксоны из родов Gymnomitrion и Marsupella перемешаны в двух кладах, видовой состав которых соответствует распределению признака развития перианция и перигиния - органов защиты молодого спорогона. Таким образом, показана большая важность этого признака в систематике семейства по сравнению с признаками, определяющими общий габитус растения. В результате 3 вида из рода Marsupella (Marsupella alpina (Gottsche ex Husn.) Bernet, M. brevissima (Dumort.) Grolle и M. commutata (Limpr.) Bernet.) с редуцированным перианцием отнесены к роду Gymnomitrion, а Gymnomitrion apiculatum (Schiffn.) Muell. Frib. с развитыми перианцием и перигинием - к роду Marsupella. Степень дивергенции нуклеотидных последовательностей свидетельствует о видовой самостоятельности Marsupella aquatica (Lindenb.) Schiffn., включавшегося многими исследователями в M. emarginata (Ehrh.) Dumort. [28].
Неопределенной остается систематика таксонов бывшего сем. Jungermanniaceae s.str. Вследствие его полифилетичности недавно было описано новое сем. Solenostomataceae Stotler & Crand.-Stotl., включающее, помимо прочих, роды Solenostoma Mitt., Plectocolea (Mitt.) Mitt., Nardia Gray. Однако, по нашим данным, получается, что и это семейство не монофилетично: клада рода Nardia является сестринской кладе сем. Gymnomitriaceae [13]. Учитывая недостаточное количество изученных видов Nardia, мы пока воздерживаемся от выделения рода в монотипное семейство [29]. По молекулярно-филогенетическим данным Nardia следует относить к Gymnomitriaceae. Несколько видов рода Plectocolea, преимущественно с восточно-азиатским распространением, формируют собственную кладу, в то время как более широко распространенные виды входят в состав клады рода Solenostoma. Пересмотр объема и статуса рода Plectocolea требует комплексного подхода. Морфологически обособленный вид Solenostoma caespiticium (Lindenb.) Steph. филогенетически удален от клады Solenostoma. Это явилось основой для выделения нового монотипного рода Endogemma Konstant., Vilnet, Troitsky и нового сем. Endogemmataceae Konstant., Vilnet, Troitsky [29].
На основе анатомо-морфологических и молекулярно-генетических данных описаны два новых для науки вида - Solenostoma pseudopyriflorum Bakalin et Vilnet и Jungermannia konstantinovae Bakalin et Vilnet [30]. Типовой образец Solenostoma pseudopyriflorum описан с Курильских островов, потом этот вид найден в Приморском крае, Сахалине и Бурятии. Вид Jungermannia konstantinovae известен только из типового местонахождения на юге Приморского края. Наличие высокой внутривидовой вариабельности нуклеотидных последовательностей и четких морфологических отличий в некоторых таксонах Jungermannia s.str. и Plectocolea позволит описать еще несколько неизвестных ранее видов.
Использование нового молекулярно-филогенетического подхода в изучении печеночников выводит на качественно новый уровень исследования филогении и систематики этой группы древнейших наземных растений и расширяет представления об их существующем разнообразии. Более того, этот подход позволяет не только приблизиться к созданию естественной системы печеночников, но и помогает в решении многих вопросов практической систематики.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (09-04-00281, 10-04-00050), Программы поддержки фундаментальных исследований Президиума РАН «Биологическое разнообразие» (Подпрограмма «Генофонды и генетическое разнообразие»), гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых (МК-3328.2011.4).
ЛИТЕРАТУРА
1. Wikstroem N., He-Nygren X., Shaw A.J. Liverworts (Marchantiophyta) // The Timetree of life / Eds. S.B. Hedges, S. Kumar. New York: Oxford University Press, 2009. P. 146-152. 2. Krassilov V.A., Schuster R.M. Paleozoic and Mesozoic fossils // New Manual of Bryology / Eds. R.M. Schuster. Tokyo: Kokusaibunken Insatsusha, 1984. Vol. 2. P. 1172-1193. 3. Shaw J., Renzaglia K. Phylogeny and diversification of bryophytes // Amer. J. Bot., 2004. Vol. 91. P. 1557-1581. 4. Renzaglia K.S., Schuette S., Duff R.J., Ligrone R., Shaw A.J., Mishler B.D., Duckett J.G. Bryophyte phylogeny: Advancing the molecular and morphological frontiers // The Bryologist. 2007. Vol. 110. P. 179-213. 5. Троицкий А.В., Игнатов М.С., Боброва В.К., Милютина И.А. Вклад геносистематики в современное представление о филогении и системе моховидных // Биохимия. 2007. Т. 72. С. 1690-1704. 6. The deepest divergences in land plants inferred
from phylogenomic evidence / Y.-L. Qiu, L. Li, B. Wang, Z. Chen, V. Knoop, M. Groth-Malonek, O. Dombrovska, J. Lee, L. Kent, J. Rest, G.F. Estabrook, Hendry T.A., Taylor D.W., Testa C.M., Ambros M., Crandall-Stotler B., Duff R.J., Stech M., Frey W., D. Quandt, C.C. Davis // pNaS, 2006. Vol. 103. P. 15511-15516. 7. Hedges S.B., Kumar S. Discovering the Timetree of life // The Timetree of life / Eds. S.B. Hedges, S. Kumar. New York: Oxford University Press, 2009. P. 3-18. 8. He-Nygren X., Juslen A., Glenny D., Piippo S. Illuminating the evolutionary history of liverworts (Marchantiophyta) -towards a natural classification // Cladistics, 2006. Vol. 22. P. 1-31. 9. Forrest L.L., Davis E.C., Long D.G., Crandall-Stotler B.J., Clark A, Hollingsworth M.L. Unraveling the evolutionary history of the liverworts (Marchantiophyta): multiple taxa, genomes and analyses // The Bryologist, 2006. Vol. 109. P. 303-334. 10. Crandall-Stotler B., Stotler R.E., Long D.G. Phylogeny and classification of the Marchantiophyta // Edinburgh J. Bot., 2009. Vol. 66. P. 155-198. 11. Вильнет
A.А., Константинова Н.А., Троицкий А.В. Геносистематика и новый взгляд на филогению и систему печеночников // Молекулярная биол. 2009. Т. 43, № 5. С. 845-855. 12. Heinrichs J., Gradstein S.R., Wilson R., Schneider H. Towards a natural classification of liverworts (Marchantiophyta) based on the chloroplast gene rbcL // Cryptog. Bryol., 2005. Vol. 26. P. 131-150. 13. Vilnet A.A., Konstantinova N.A., Troitsky A.V. Molecular insight on phylogeny and systematics of the Lophoziaceae, Scapaniaceae, Gymnomitriaceae and Jungermanniaceae // Arctoa, 2010. Vol. 19. P. 31-50. 14. Mueller K. Die lebermoose europas // Rabenhorst's Kryptogamen flora. Leipzig: Verlag von Eduard Kummer, 1951-58. Р. 1-1356. 15. Шляков Р.Н. Печеночники: Гербертовые-Геокаликсовые // Печеночные мхи севера СССР. T. 2. Л: Наука, 1979. C. 1-191. 16. Arnell S. Illustrated moss flora of Fennoscandia. I. Hepatacae. Gleerup: Lund, 1956. 314 P. 17. Schuster R.M. The Hepaticae and Anthocerotae of North America east of the hundredth meridian. New York, London: Columbia University Press, 1974. Vol. III. P. 1-880. 18. Vilnet A.A., Konstantinova N.A., Troitsky A.V. On molecular phylogeny and systematics of suborder Cephaloziineae (Jungermanniales, Marchantiophyta) // Contributions to the 2nd Moscow Intern. Conf. “Molecular Phylogenetics”. M: Torus Press, 2010. P. 180-181. 19. Вильнет А.А., Константинова Н.А., Троицкий А.В. Геносистематика семейства Cephaloziaceae Mig. (Marchantiophyta) // Материалы 6-го совещ. (конф.) «Кариология, кариосистематика и молекулярная систематика растений». СПб.: ПиФ.com, 2009. С. 78-81. 20. Yatsentyuk S.P., Konstantinova N.A., Ignatov M.S., Hyvonen J., Troitsky A.V. On phylogeny of Lophoziaceae and related families (Hepaticae, Jungermanniales) based on trnL-trnF intron-spacer sequences of chloroplast DNA // Molecular Systematics of Bryophytes. Monogr. Syst. Bot. / Eds. Goffinet
B., Hollowell V., Magill R. Missouri Bot. Gard., 2004. Vol. 98. P. 150-167. 21. Soederstroem L., De Roo R., Hedderson T. Taxonomic novelties resulting from recent reclassification of the Lophoziaceae/Scapaniaceae clade // Phytotaxa. 2010. Vol. 3. P. 47-53. 22. Konstantinova N.A., Vilnet A.A. New taxa and new combinations in Jungermanniales (Hepaticae) // Arctoa. 2009. Vol. 18. P. 65-67. 23. Vilnet A.A, Konstantinova N.A., Troitsky A.V. The molecular divergence between some closely allied taxa of genus Scapania (Dumort.) Dumort. // Устойчивость экосистем и проблема сохранения биоразнообразия на Севере: материалы междунар. конф. Кировск; Апатиты: K&M, 2006. С. 49-53. 24. Вильнет А.А., Милютина И.А., Константинова Н.А., Игнатов М.С., Троицкий А.В. Филогения рода Lophozia (Dumort.) Dumort. s. str. на основе анализа ядерных и хлоропластных последовательностей, ITS1-2 и trnL-F // Генетика. 2007. T. 43, № 11. С. 1556-1564. 25. Shaw A.J. Bryophytes species and speciation // Bryophyte biol. / Eds. B. Goffinet, A.J. Shaw. New York: Cambridge University Press., 2009. P. 445-486. 26. Вильнет А.А., Константинова Н.А., Троицкий А.В. Молекулярно-филогенетический подход к ревизии рода Barbilophozia Loeske (Jungermanniales, Marchantiophyta) // Материалы Всеросс. Конф.и с междунар. участием, посвященной памяти Л.В. Бардунова. Иркутск: Изд-во Ин-та географии им. В.Б. Сочавы СО РАН, 2010. С. 230-233. 27. Vilnet A.A, Konstantinova N.A., Troitsky A.V. Phylogeny and systematics of the genus Lophozia s. str. (Dumort.) Dumort. (Hepaticae) and related taxa from nuclear ITS1-2 and chloroplast trnL-F sequences // Molecular Phylogenetics and Evolution, 2008. Vol. 47. P. 403418. 28. Вильнет А.А., Константинова Н.А., Троицкий А.В. К молекулярной филогении семейства Gymnomitriaceae H. Klinggr. (Hepaticae) // Вычислительная филогенетика и геносистематика: материалы междунар. конф. М.: Товарищество научных изданий КМК, 2007. С. 24-29. 29. Vilnet A., Konstantinova N., Troitsky A. Taxonomical rearrangements of Solenostomataceae (Marchantiophyta) with description of a new family Endogemmataceae based on trnL-F cpDNA analysis // Phytotaxa (in press). 30. Bakalin V.A., Vilnet A.A. Two new species of Jungermanniaceae from Asian Russia // Arctoa. 2009. Vol. 18. P. 151-162.
Сведения об авторах
Вильнет Анна Александровна - к.б.н., научный сотрудник лаборатории флоры и растительности; e-mail: anya_v@list.ru Константинова Надежда Алексеевна - д.б.н., профессор, зав. лабораторией флоры и растительности; e-mail: nadya50@list.ru
