CC BY
22УДК: 619:616.98:578.833.31
МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ИЗОЛЯТА ТИМАШЕВСК 01/18
'О.Ю.Черных - доктор ветеринарных наук, профессор, директор; 2Р.А.Кривонос - кандидат ветеринарных наук; 3О.А.Верховский - доктор биологических наук, профессор; 4Т.И.Алипер - доктор биологических наук, профессор, завлабораторией; 5А.С.Першин - кандидат ветеринарных наук, вед.н.с.; 5И.Ю.Жуков - ведущий биолог; 5Н.Н.Власова - доктор биологических
наук, гл.н.с.; 5А.С.Иголкин - зав. референтной лабораторией по АЧС.
'ФГОУ ВПО«Кубанский государственный аграрный университет», г.Краснодар (350004, г.Краснодар, ул.Калинина, '3, e-mail: mail@kubsau.ru). 2Департаментветеринарии Краснодарского края, г.Краснодар (г.Краснодар, ул. Рашпилевская, 36, e-mail: sinkubani@mail.ru) 3АНО «Научно-исследовательский институт диагностики и профилактики болезней человека и животных», г.Москва ('23098, г. Москва, ул.Гамалеи, '6, e-mail: info@dpri.ru).
4ФГБУ «НИИ вирусологии им.Д.И.Ивановского» Минздрава России, г.Москва ('23098, г.Москва, ул.Гамалеи, '6, e-mail:aliper@narvac.com). 5ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», г.Владимир (60090', Владимирская область, мкр. Юрьевец, ул.Институтскийгородок, 33, e-mail: Zhukov@arriah.ru).
В статье раскрыты ключевые результаты молекулярно-биологических исследований изолята вируса АЧС «Тимашевск 01/18», выделенного от вынужденно убитых домашних свиней при ликвидации вспышки в ООО «Свинокомплекс «Развильненский» (г.Тимашевск). В ходе экспериментов были проведены исследования по определению способности вирусного изолята вызывать инфекционный процесс; исследован анализ изменчивости генома изолята; проведено определение возможных изменений характеристик возбудителя. Результаты эпизоотологического расследования и исследования биологических свойств изолята показали наличие на территории Российской Федерации естественно аттенуированных вирусов АЧС, а также подтвердили наличие генетических изменений у данного варианта вируса АЧС в области гена, ответственного за вирулентность MGF 505-2R. Полученные данные в перспективе позволят подробнее изучить изменения состава вирусной популяции и выявить ослабленные варианты вируса на территории неблагополучных по АЧС субъектов РФ.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: африканская чума свиней (АЧС), молекулярно-биологические свойства, изолят.
001: 10.33632/1998-698Х.2019-2-15-22
Африканская чума свиней (АЧС) - болезнь диких и домашних свиней, вызываемая ДНК-содер-жащим вирусом семейства Д$1агу1гйае.
Начиная с 2007 г., АЧС наносит существенный ущерб свиноводству Российской Федерации [1], а с 2014 года систематически регистрируется наличие вируса АЧС 11-го генотипа 8 серотипа в популяциях диких кабанов и домашних свиней стран Восточной Европы. В свою очередь, персистенция вируса у диких животных приводит к возникновению вспышек АЧС в свиноводческих хозяйствах, что подтверждается постоянно увеличивающимся ареалом распространения АЧС в Центральных областях России, а также в странах Балтии, Украине, Польше, Чехии и Румынии [2].
Необходимость изучения мирового опыта и выработки новой стратегии борьбы с АЧС вызвана тем фактом, что входе предшествующих эпизоотий АЧС (Испания, Португалия, Бразилия, Италия) не удавалось достаточно быстро локализовать вспышки, а бесконтрольная циркуляция вируса АЧС в дикой природе приводила к изменению фенотипических признаков болезни вследствие снижения его вирулентности и появления животных-вирусоносителей [3, 4].
Проведенный ряд исследований изолятов, выделенных в 2014-2017 гг., позволили установить наличие в дикой природе вариантов вируса АЧС со сниженной вирулентностью, а их геномный анализ выявил изменения в генах, ответственных за вирулентность [5, 6].
Первым экспериментом, подтвердившим снижение вирулентности у варианта, вызвавшего вспышку АЧС у домашних свиней в Невельском районе Псковской области в 2014 г., явилась биопроба с изолятом Антоново 07/14. Вирус был выделен из селезенки павшей от АЧС домашней свиньи, летальность в опыте не превышала 91,7% [7, 8]. Однако до настоящего времени в открытых литературных источниках отсутствовали данные о снижении вирулентности вируса, вызывающего болезнь не в условиях эксперимента, а в ЛПХ, на частных свинофермах, или в промышленных свиноводческих предприятиях в РФ.
Вспышка АЧС в ООО «Свинокомплекс «Развильненский» Краснодарского края (декабрь 2017 - январь 2018 гг.) имела ряд отличий от предыдущих вспышек в Краснодарском крае. Так, при данной вспышке долгое время не наблюдали характерных для острой формы АЧС клинических признаков болезни и массового па-
дежа свинеи, регистрировали только кратковременный подъем температуры до 40,5-41,00С и незначительный падеж животных на уровне технического.
В этой связи актуальным является вопрос о проведении молекулярно-биологических исследований изолята вируса АЧС, выделенного от вынужденно убитых домашних свиней при ликвидации вспышки в ООО «Свинокомплекс «Развильненский».
Материалы и методы. Использованные в эксперименте образцы вируса АЧС были выделены из проб сыворотки домашних свиней, принадлежащих ООО «Свинокомплекс «Развильненский» (г.Тимашевск, Краснодарский край).
Выделение возбудителя АЧС проводили в культуре клеток селезенки свиньи (СС) в лабораторных помещениях ФГБУ «ВНИИЗЖ», предназначенных для работ с возбудителями 11-1У группы патогенности.
Первичную культуру клеток СС выращивали в питательной среде Игла с добавлением 20% бычьей фе-тальной сыворотки.
Для изучения биологических свойств выделенного изолята вируса АЧС Тимашевск 01/18 (определения его способности вызывать инфекционный процесс и обнаружения возможных изменений характеристик возбудителя) проводили постановку биопробы путем заражения 2-3 месячных домашних поросят (масса 18-22 кг) породы «Ландрас» изучаемым материалом в дозе 10 ГАдЕ50/см3 на голову.
Одноврем50енно проводили анализ контагиозности изучаемого вируса. Для этого использовали интактных поросят, содержавшихся в прямом контакте с зараженными животными.
Наблюдение за животными осуществляли ежедневно, проводя термометрию и осуществляя визуальный контроль клинических признаков у каждого животного. Для определения наличия вируса у инфицированных и контактных животных с периодичностью 1 раз в трое суток у всех животных отбирали пробы крови [9].
Для выявления наличия вируса в испытуемых образцах и уровня виремии в крови использовали методы его детекции по наличию гемадсорбции в культуре клеток СС, а также по выявлению его генома на основе использования ПЦР-анализа и антигена в реакции прямой иммунофлуоресценции (РПИФ) [10].
В ходе проведения ПЦР анализа выделение вирусной ДНК вируса АЧС осуществляли с помощью набора «ДНК сорб-Б» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) в соответствии с инструкцией производителя.
Для постановки ПЦР использовали «Тест-систему для диагностики африканской чумы свиней методом полимеразной цепной реакции с гибридизацион-но-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени»» (ФГБУ «ВНИИЗЖ», Россия).
Для анализа изменчивости генома изолята Тима-шевск 01/18 вируса АЧС в период вспышки инфекции
использовали рассчитанные с применением программы Oligo 7.1 праймеры. Оптимальные условия реакции подбирали экспериментально на амплифи-каторе «Mastercycler-nexus» (Eppendorf, Германия) c использованием программы градиента температур (от 500С до 600С).
Учет результатов ПЦР проводили методом электрофоретического разделения в 1,0%-ном ага-розном геле с детектированием в УФ-свете после окраски бромистым этидием. Для определения размера фрагментов использовали 100 п.о. маркер (Thermo Fisher, США) с линейкой фрагментов от 100 п.о. до 3000 п.о.
Для проведения секвенирования ПЦР-продукт выделяли из агарозного геля с помощью набора реагентов для элюции ДНК из агарозных гелей (Qiagen, Швейцария) согласно инструкции производителя.
Полученные ампликоны секвенировали с использованием набора Big Dye Terminator Cycle Sequencingkit на капиллярном ДнК-секвенаторе ABI Prism 3100 (Applied Biosystems, США).
Сравнительный анализ гомологии нуклеотидных последовательностей генов проводили с помощью программ Bio Edit 7.2.5 и Benchling.
При проведении иммуноферментного анализа использовали диагностические тест-системы: АНО «НИИ ДПБ», (Россия), Ю^(Франция) согласно инструкции производителя.
Результаты исследований. ООО «Свинокомплекс «Развильненский», расположен в Тимашевском районе Краснодарского края. На 6 января 2018 года на ферме содержалось 10950 голов свиней.
В течение 2017 года среднемесячный отход не превышал 90-120 животных. За исключением периода с июня по сентябрь. Динамика падежа в 2017 году в ООО «Свинокомплекс «Развильненский» приведена на рисунке 1.
5 января 2018 года при комиссионном обследовании свинопоголовья специалистами ГБУ «Вету-правление Тимашевского района» установлено, что у некоторых свиней наблюдали угнетенное состояние и повышение температуры тела до 40,5-40,6°С. При вскрытии трупов свиней отмечено трупное окоченение, из носовой полости пенистое кровянистое истечение, в заглоточных и паховых лимфатических узлах геморрагическое воспаление, селезенка увеличена, кровенаполнена и размягчена, печень кровенапол-нена, границы между корковым и мозговым слоем почек стерты, легкие отекшие. Признаки заболевания наблюдали среди животных группы (180-190 дней) и среди поросят группы откорма (120 дней).
Исходя из анализа представленных документов о падеже животных видно, что в ООО «Свинокомплекс «Развильненский» в декабре 2017 - январе 2018 гг. был зарегистрирован падеж свиней в следующей динамике (рис. 2).
Рис. 2. Падеж свиней в ООО «Свинокомплекс «Развильненский» в декабре 2017 - январе 2018 гг.
При проведении 6 января 2018 года в ГБУ «Кропоткинская краевая ветеринарная лаборатория» исследований патологического материала от свиней методом ПЦР, был выявлен генетический материал вируса АЧС, а методом РПИФ обнаружен антиген вируса АЧС. Также в соответствии с протоколом от 7 января 2018 года в ФГБУ «ВНИИЗЖ» при исследовании проб от павших 6 января 2018 года свиней, в реакции прямой иммунофлюоресценции и полиме-разной цепной реакции обнаружены антиген и геном вируса африканской чумы свиней, соответственно.
После постановки диагноза на АЧС на ООО «Свинокомплекс «Развильненский» были проведены ве-теринарно-санитарные мероприятия, в том числе: изъятие и эвтаназия более 10000 содержащихся там свиней, а также около 100 трупов павших свиней, с последующим уничтожением путем сжигания.
Тем не менее, остался ряд вопросов, которые не удалось выяснить при проведении эпизоотологиче-ского расследования.
При исследовании в референтной лаборатории по АЧС ФгБУ «ВНИИЗЖ» методом ПЦР в реальном времени 100 сывороток крови от домашних свиней, принадлежащих ООО «Свинокомплекс «Развильненский», 73 образца показали положительный результат, а 27 образцов показали сомнительный результат. Также в данных пробах выявляли наличие вирусспецифиче-ских антител методом ИФА.
При дальнейшем исследовании методом вирусо-выделения на культуре клеток СС 27-ми «сомнительных в ПЦР» и 17-ти «положительных в ПЦР» образцов был выделен вирус АЧС, который использовали для проведения генетического анализа и изучения биологических свойств возбудителя.
В результате исследований установлено, что в 36% исследуемых образцах обнаруживались антитела к вирусу АЧС. Из них 34 образца показали положительный результат в двух используемых тестах, а 2 образца (№90 и №92) были положительны только при использовании тест-системы ИФА производства ID-vet и сомнительны в ИФА АНО «НИИ ДПБ».
При проведении серии последовательных пассажей в культуре клеток СС вирус АЧС был выделен после 1-2 пассажей из 44 исследованных проб (100% исследованных данным методом образцов), в т.ч. давших сомнительный результат в ПЦР-РВ.
Анализ характера гемадсорбции показал, что данный вирус, в основном, индуцирует появление «полуплотной» гемадсорбции, характеризующейся прикреплением менее 50 эритроцитов к инфицированной клетке, что, согласно литературным данным, может свидетельствовать об ослаблении вирулентных свойств исследуемого изолята вируса АЧС.
С учетом полученных результатов лабораторных исследований образцов сыворотки крови при использовании трех диагностических методов (ПЦР, ИФА, ви-
русовыделение), сделано предположение о возможном сроке массового (23%) инфицирования свиней в ООО «Свинокомплекс «Развильненский», который составлял более 20 сут (поскольку титр вируса в крови не превышал 1,5 ГАдЕ50/см3 при достаточно высоком уровне антител в этих же образцах).
Следовательно, умерщвленные в процессе ликвидации очага животные, вероятно, могли либо остаться хронически инфицированными вирусоно-
Основные культуральные свойства
сителями, либо выжить после инфицирования вирусом АЧС.
Выделенному в ходе экспериментов изоляту было присвоено название Тимашевск 01/18 и он был охарактеризован по основным биологическим свойствам в культуре клеток селезенки свиньи (CC). Результаты представлены в таблице 1, для сравнения в этой же таблице приведены данные высоковирулентного изолята Краснодар 07/15.
Таблица 1
изолята Тимашевск 01/18 (n=3)
Изолят № пассажа Гемадсорбция (кол-во эритроцитов на клетку) Титры накопления (1дГАдЕ 50/см3) Сроки накопления (сут)
1 <50 5,54 ± 0,11 6-7
Тимашевск 01/18 3 <50 6,09 ± 0,31 6
5 <50 7,23± 0,81 4-5
1 >50 6,57 ± 0,18 5-6
Краснодар 07/15 3 >50 7,02 ± 0,51 4-5
5 >50 7,56 ± 0,41 4
Как видно из данных таблицы, по своим культу-ральным свойствам изолят Тимашевск 01/18 отличается от высоковирулентного изолята Краснодар 07/15.
Однако для получения дополнительных данных о возможном изменении вирулентности варианта вируса АЧС, вызвавшего вспышку в ООО «Свинокомплекс «Развильненский», необходимо было провести биопробу на естественно восприимчивых животных и генетический анализ изолята Тимашевск 01/18.
Постановку биопробы с заражением естественно восприимчивых животных проводили с целью изучения биологических свойств изолята Тимашевск 01/18. В качестве экспериментальных животных использовали 10 поросят, разделённых на две группы. Животных первой группы (8 голов), заражали внутримышечно в верхнюю треть шеи в дозе 10 гемадсорбирующих единиц (ГАдЕ) на голову. Поросят второй группы (2 головы) не заражали и оставляли в прямом контакте с поросятами первой группы. Ежедневно проводили осмотр и термометрию, каждые 3 дня от всех животных отбирали пробы крови для исследования (ПЦР и ИФА) на АЧС.
Первый случай гипертермии был отмечен у зараженного поросенка уже на 3 сут после введения вируса. К четвертым суткам гипертермию обнаруживали у 5 из 8 зараженных животных. В контактной группе гипертермию свыше 40,50С регистрировали на 8 и 17 сут для первого и второго поросенка, соответственно.
На 7-е сут после начала эксперимента пал первый зараженный поросенок, к 12-е сут пало 7 из 8 животных первой группы. Контактные поросята пали на 20-е и 27-е сут, соответственно. При вскрытии трупов павших поросят обнаруживали поражения, характерные для острой формы АЧС: лимфадениты висцеральных и соматических лимфатических узлов
сопровождающиеся различной степенью гиперемии и гипертрофии, сплениты, геморрагические диатезы почек и поражения легких.
Один из зараженных поросят (№3) после 5-ти суточного повышения температуры и проявления клинических признаков (с 5-11 сут после введения вируса) выжил и оставался жив до окончания срока наблюдения (55 суток).
Таким образом, в ходе изучения биологических свойств изолята Тимашевск 01/18 отмечено быстрое развитие болезни у зараженных животных (на 3-4 сут) в острой форме, с ярким проявлением клинических признаков, что сходно с клинической картиной, характерной для изолятов вируса АЧС, выделенных на территории России в 2007-2013 гг., обладавших 100% летальностью для свиней. Однако в рамках проведенного эксперимента для изолята Тимашевск 01/18 летальность в опыте составила 90%.
Пробы крови, отобранные у животных, исследовали на наличие специфических антител к вирусу АЧС в иммуноферментном анализе. Наиболее ранний срок обнаружения антител к вирусу АЧС составил 11 сут после заражения. На данный срок антитела обнаружены в сыворотках только двух животных. Однако, титр антител в данных пробах был ниже, чем в образцах, полученных из ООО «Свинокомплекс «Развильненский».
Следовательно, сопоставление экспериментальных данных ПЦР и ИФА и результатов со вспышки позволяет с высокой степенью достоверности сделать предположение о сроках, прошедших после интродукции возбудителя АЧС в восприимчивую популяцию.
Согласно литературным данным, в первые 7-10 сут после и инфицирования возможно выявлять, либо только геном, либо антиген вируса АЧС. В последую-
щем, помимо прямого обнаружения вируса/генома, становится возможным и выявление антител к нему. Более стабильное обнаружение антител, начинается лишь с 13-14 сут после попадания вируса в организм животных. В дальнейшем происходит увеличение титра антител в крови инфицированных животных. Одновременно с нарастанием титра антител начинается постепенное снижение титра вируса в крови.
Отмечено, что большинство животных, инфицированных высоковирулентными вариантами вируса АЧС, не доживают до времени появления антител в крови.
Таким образом, учитывая высокий титр вирус-специфических антител и высокие значения 01 в пЦр-РВ, можно сделать вывод, что часть животных, принадлежащих ООО «Свинокомплекс «Развильненский» были инфицированы не менее 20-30 сут до вынужденного убоя. Проведение экстренных мероприятий по локализации очага АЧС не позволило получить более полные данные о продолжительности болезни и дальнейшем статусе свиней, от которых были отобраны пробы сывороток крови.
Другая группа животных, имеющих высокий показатель 01 и не имеющих антител, была инфицирована не более, чем за 14 дней до момента отбора проб. Наличие большого количества животных проживших более 20-30 дней после заражения говорит о заносе и циркуляции в ООО «Свинокомплекс «Развиль-ненский» вируса АЧС умеренной вирулентности. Эти выводы коррелируют с результатами наблюдений
ветеринарного врача, обслуживающего хозяйство, который отмечал только кратковременный подъем температуры у животных.
В проведенном в ФГБУ «ВНИИЗЖ» эксперименте наличие антител не повлияло на выживаемость животных, поскольку погибли животные, у которых уже регистрировали наличие антител в крови. У выжившего поросенка (№3) на 15-е сут после заражения обнаружили наличие антител, но в низком титре. В последующем антитела стабильно детектировали на всем протяжении жизни животного, однако, нарастание их содержания в крови происходило очень медленно.
Такое различие в биологических свойствах вируса, вызвавшего вспышку в ООО «Свинокомплекс «Развильненский», и изолята Тимашевск 01/18 может быть объяснено гетерогенностью состава популяции инфицировавшего свиней вируса, поскольку полученный из сывороток крови свиней из свинокомплекса вирус прошел селективный отбор в организме свиньи.
В ходе проведения генетического анализа на первом этапе проанализирована (в сравнении с изо-лятами вируса АЧС Грузия 2007/1 и Краснодар 07/15, выделенными на территории Грузии в 2007 г. и территории Краснодарского края в 2015 г., соответственно) структура генов изолята Тимашевск 01/18, отвечающих за генотиповую принадлежность вируса, наличие гемадсорбирующих свойств, а также группы генов, отвечающих за прикрепление и проникновение вируса АЧС в клетки хозяина (табл.2).
Таблица 2
Результаты сравнительного генетического анализа изолята Тимашевск 01/18
Исследуемые гены Грузия 2007/1 Краснодар 07/15 Тимашевск 01/18
061Я - - -
СР2041_ - - -
Е1831_ - - -
В6461_ - - -
ЕР402Ы - - -
ЕР4021_ -2 - - -
В6021_ - - -
Е248Я - - -
А1791_ - - -
ЭР96Я - - -
ТЯБ:9Я/Ш МОР 505 - - -
ТЯБ:ГШ/!3291_ - ОААТАТАТАО ОААТАТАТАО
Примечание: «-» нет различий с изолятом Грузия 2007/1;
Как видно из результатов, приведенных в таблице 2, изолят Тимашевск 01/18 по структуре 12 генов отличался от исходного для РФ изолята Грузия 2007/1 только наличием 10 нуклеотидной встройки в интергенном регионе 173Я/!329Ь, которая также выявлена и у изолята
ТЯБ - тандемный повтор.
вируса АЧС, выделенного из патматериала от домашней свиньи из Краснодарского края в 2015 году.
Дальнейший генетический анализ последовательности гена МОР 505-2Я, который по данным Ь.01хопе1а! (2013) отвечает за вирулентность вируса АЧС, выявил
существенные различия изучаемого изолята с изоля-том Грузия 2007/1 и рядом других, ранее исследованных изолятов [12]. Результаты сравнительного анали-
за региона MGF 505-2R изолята Тимашевск 01/18 в программе MEGA6.0 с российскими изолятами 20132018 гг. представлены на рисунке 3.
Рис.3. Филогенетическое дерево, построенное на основе анализа структуры гена MGF 505-2R по методу «максимального правдоподобия» (Maximum Likelihood).
Как видно из рисунка 3, гомология гена MGF 505-2R изолята Тимашевск 01/18 относительно аналогичного гена изолятов Грузия 2007/1 и Армения 07 составляет не более 87,45%. Основные изменения в изоляте Тимашевск 01/18 проявились в виде множественных делеций различных нуклеотидов:1 делеция в 4 нуклеотида, 1 делеция в 3 нуклеотида, 2 делеции по 2 нуклеотида и 5 делеций одиночных нуклеотидов.
Очевидно, что данные изменения могли оказать влияние на функцию гена MGF 505-2R, что, вероятно, отразилось на свойствах вируса, в частности, на вирулентности, поскольку данное мультигенное семейство отвечает за указанное свойство [12].
Заключение. Изоляты вируса АЧС со сниженной вирулентностью время от времени обнаруживаются на территории России, начиная с 2014 г. [5, 8], что позволяет говорить о процессе естественной аттенуации вируса в ходе его циркуляции в популяции восприимчивых животных.
Как показали исследования вспышка АЧС, произошедшая в декабре 2017-январе 2018 гг. в ООО «Свино-
Литература
комплекс «Развильненский» Краснодарского края была вызвана вариантом вируса АЧС, имеющим при экспериментальном заражении летальность на уровне 90%.
Следует отметить тот факт, что во время вспышки заболевания на свиноводческом предприятии, кроме атипичного течения АЧС у 36%, инфицированных свиней наблюдали наличие вирус специфических антител в высоких титрах.
Анализ молекулярно-биологических свойств изо-лята Тимашевск 01/18 подтвердил предположение о наличии генетических изменений у данного варианта вируса АЧС в области гена, ответственного за вирулентность MGF 505-2R. Однако, для более обоснованного вывода, необходимо дальнейшее изучение попу-ляционного состава изолята Тимашевск 01/18 и его полный геномный анализ.
Для изучения изменений состава вирусной популяции и выявления ослабленных вариантов вируса на территории неблагополучных по АЧС субъектов РФ целесообразно проведение исследований на наличие антител к вирусу АЧС.
1. Гулёнкин, В.М. Оценка экономического ущерба от африканской чумы свиней / В.М.Гулёнкин, Н.С.Бардина, А.А.Шевцов // Ветеринария. - 2011. - №10. - С. 10-12.
2. Эпизоотическая ситуация по АЧС в популяции диких кабанов на территории Российской Федерации в 2007-2018 гг. [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://www.fsvps.ru/fsvps-docs/ru/iac/asf/2016/05-27/03.pdf.
3. Characterization of pathogenic and non-pathogenic African swine fever virus isolates from Ornithodoroserraticus inhabiting pig premises in Portugal / F.S.Bolinas[et al.] // Journal of general virology. - 2004. - Vol. 85, №. 8. - P. 21772187.
4. Biological properties of African swine fever virus Odintsovo 02/14 isolate and its genome analysis / A.A.Elsukova, I.V.Shevchenko, A.A.Varentsova [et al.] // International Journal of Environmental & Agriculture Research. - 2017. - Vol.2. - P. 26-37.
5. Шевченко, И.В. Биологические свойства и анализ полных геномов российских изолятов вируса африканской чумы свиней, выделенных в 2013-2014 гг.: дис.... канд. биол. наук / И.В.Шевченко. - Владимир, 2017.
6. Репродукция изолята Антоново 07/14 вируса африканской чумы свиней in vivo и in vitro / О.С.Пузанкова [и др.] // Ветеринария. - 2016. - №. 5. - С. 18-24.
7. Жуков, И.Ю. Биологические свойства изолятов вируса африканской чумы свиней и особенности течения болезни при экспериментальном заражении: дис.. канд. биол. наук / И.Ю.Жуков. - Владимир, 2018.
8. ГОСТ 28573 - 90. Свиньи. Методы лабораторной диагностики африканской чумы свиней. - М.: Стандар-тинформ, 2005. - 10 с.
9. Laboratory methods to study African swine fever virus / P. de 1_еуп [et al.] // Virus Research. - 2013. - № 4 (April). - P. 168-179.
10. Биологические свойства вируса африканской чумы свиней, выделенного в Российской Федерации / В.М.Балышев, В.В.Куриннов, С.Ж.Цыбанов [и др.] // Ветеринария. - 2010. - № 7. - С.25-27.
11. African swine fever virus replication and genomics / L.K.Dixon [et al.] // Virus Research. - 2013. - Vol. 173, № 1. - P. 3-14.
MOLECULAR AND BIOLOGICAL PROPERTIES OF THE ISOLATE TIMASHEVSK 01/18
1Chernykh O.Yu. - Doctor of Veterinary Sciences, professor; 2Krivonos R.A. - Candidate of Veterinary Sciences; 3Verhovsky O.A. - Doctor of Biological Sciences, professor; 4Aliper T.I. - Doctor of Biological Sciences, professor; 5Pershin A.S. - Candidate of Veterinary Sciences; 5Zhukov I.Yu. - leading biologist;
5Vlasova N.N. - Doctor of Biological Sciences; 5Igolkin A.S. - Head of the ASF Reference Laboratory.
1Kuban State Agrarian University, Krasnodar (e-mail: mail@kubsau.ru).
2Veterinary Department of Krasnodar Region, Krasnodar (e-mail: sinkubani@mail.ru).
3Research Institute for Diagnostics and Prevention of Human and Animal Diseases, Moscow
(e-mail: info@dpri.ru).
4Virology Research Institute named after D.I. Ivanovsky, Ministry of Health of Russia, Moscow
(e-mail: aliper@narvac.com).
5FGBI «ARRIAH», Federal Governmental Budgetary Institution (FGBI) Federal Centre for Animal Health,
Vladimir (e-mail: Zhukov@arriah.ru).
The article contains the main results of molecular and biological studies of the ASF virus isolate Timashevsk 01/18 detected from forcedly slaughtered domestic swines when eliminating of the ASF outbreak in LLC "Svinokompleks "Razvilnenskiy" (Timashevsk town). In the course of experiments the research to determine for the viral isolate property to cause infectious process was conducted; the isolate genome changeability analysis was examined; the determination of possible changes in the properties of pathogen was conducted. The results of epizootological investigation and studies of biological isolate properties showed the presence in the territory of Russian Federation of naturally attenuated ASF viruses as well as confirmed the presence of genetic changes in such version of ASF virus in the region of gene responsible for virulence of MGF505-2R. The obtained data will further enable to study in detail changes of viral population structure and to reveal attenuated virus versions in the territory of infected with ASF subjects of Russian Federation.
KEY WORDS: ASF, molecular and biological properties, isolate.
References
1. Gulyonkin, V.M. Ocenka ekonomicheskogo ushcherba ot afrikanskoy chumy sviney [Evaluation of economical damage from ASF] / V.M.Gulyonkin, N.S.Bardina, A.A.Shevtsov // Veterinariya. - 2011. - № 10. - P. 10-12.
2. Epizooticheskaya situaciya po ACS v populyacii dikikh kabanov na territorii Rossiyskoy Federacii v 2007-2018 gg. [Epizootic situation for ASF in population of wild boars in Russian Federation] [Elektronny resurs]. - Rezhim dostupa: http://www.fsvps.ru/fsvps-docs/ru/iac/asf/2016/05-27/03.pdf.
3. Characterization of pathogenic and non-pathogenic African swine fever virus isolates from Ornithodoroserraticus inhabiting pig premises in Portugal / F.S.Bolinas [et al.] // Journal of general virology. - 2004. - Vol. 85, №. 8. - P. 2177-2187.
4. Biological properties of African swine fever virus Odintsovo 02/14 isolate and its genome analysis / A.A.Elsukova, I.V.Shevchenko, A.A.Varentsova [et al.] // International Journal of Environmental & Agriculture Research. - 2017. - Vol. 2. -P. 26-37.
5. Shevchenko, I.V. Biologicheskie svoystva I analiz polnykh genomov rossiyskikh izolyatov virusa afrikanskoy chumy sviney, vydelennykh v 2013-2014 gg: dis. ... kand. biol. nauk [Biological properties and analysis of full genomes of Russian isolates of ASF, detected in 2013-2014: dis. ... cand. of biol. sci. / I.V.Shevchenko. - Vladimir, 2017.
6. Reprodukciya izolyata Antonovo 07/14 virusa afrikanskoy chumy sviney in vivo i in vitro [Reproduction of isolate Antonovo 07/14 of ASF virus in vivo and in vitro] / O.S.Puzankova [et al.] // Veterinariya. - 2016. - № 5. - P. 18-24.
7. Zhukov, I.Yu. Biologicheskie svoystva izolyatov virusa afrikanskoy chumy sviney I osobennosti techeniya bolezni pri eksperimentalnom zarazhenii: dis. ... kand. biol. nauk [Biological properties of isolates of ASF virus and features of pathogenesis in experimental infection: dis. ... cand. of biol. sciences] / I.Yu. Zhukov. - Vladimir, 2018.
8. GOST 28573 - 90. Svinyi. Metody laboratornoy diagnostiki afrikanskoy chumy sviney [Pigs. Methods of laboratory diagnostics of ASF]. - M.: Standartinform, 2005. - 10 p.
9. Laboratory methods to study African swine fever virus / P. de Leyn [et al.] // Virus Research. - 2013. - № 4 (April).
- P. 168-179.
10. Biologicheskie svoystva virusa afrikanskoy chumy sviney, vydelennogo v Rossiyskoy Federacii [Biological properties of ASF virus, detected in Russian Federation] / V.M.Balyshev, V.V.Kurinnov, S.Zh.Cybanov [et al.] // Veterinariya.
- 2010. - № 7. - P. 25-27.
11. African swine fever virus replication and genomics / L.K.Dixon [et al.] // Virus Research. - 2013. - Vol. 173, № 1. - P. 3-14.
УДК: 619:616.98:579.852.11
ПОЛУЧЕНИЕ ЭРИТРОЦИТАРНОГО СИБИРЕЯЗВЕННОГО АНТИГЕНА
С.В.Иванова - кандидат биологических наук, зав.лаб.; Л.А.Мельникова - кандидат ветеринарных наук, вед.н.с.; Х.Н.Макаев - доктор ветеринарных наук, профессор; А.П.Родионов - аспирант.
ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», г.Казань (420075, г.Казань, Научный городок-2, е-таИ: vnivi@mail.ru).
Сибирская язва особо опасное инфекционное заболевание, относится к группе зооантропонозов, проявляется массово или спорадически в различных регионах Российской Федерации. Одной из причин возникновения случаев заболевания сибирской язвой людей и животных является деятельность человека при проведении земельных работ, строительстве жилых объектов, дорог, прокладке трубопроводов и других работ, пастьба животных и сельскохозяйственная деятельность вблизи сибиреязвенных захоронений без учета эпизоотической обстановки и несогласованности с ветеринарными-санитарными службами регионов. В настоящее время для обеспечения благополучия по данному заболеванию животных поголовно вакцинируют, что снижает риск возникновения заболевания, но и не устраняет угрозу появления новых вспышек сибирской язвы. Дополнительным источником заболевания могут служить пропущенные при вакцинации животные, недостаточная напряженность индуцируемого противосибиреязвенного иммунитета при нарушении хранения и транспортирования вакцины. Поэтому важным звеном в недопущении заболевания и распространения сибирской язвы среди животных является контроль напряженности поствакцинального иммунитета. Получение эритроцитарного сибиреязвенного антигена включает три этапа: 1 - получение крови, формалинизация эритроцитов, определение сухого вещества и приготовление 3%-ной взвеси; 2 - танизация 3%-ной взвеси формалинизированных эритроцитов; 3 - сенсибилизация 3%-ной взвеси формалинизированных эритроцитов полисахаридным комплексом штамма 55 возбудителя сибирской язвы. Полученный эритроцитарный сибиреязвенный антиген активен, специфичен, не дает самоагглютинацию.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: сибирская язва, антиген, формалинизация, танизация, сенсибилизация, эритроциты.
001: 10.33632/1998-698Х.2019-2-22-25
В последние годы в связи с развитием промышленного животноводства и созданием крупных агропромышленных комплексов возросла потребность в иммунологических, лечебных и диагностических препаратах, позволяющих систематически контролировать благополучие страны по инфекционным заболеваниям [2], одним из которых является сибирская язва - особо опасное остропротекающее инфекционное заболевание, представляющее серьезную угрозу для здоровья человека и животных.
Возбудитель сибирской язвы существует в двух формах: вегетативной - в организме больного животного и споровой - в местах захоронения павших животных.
Возникновение очагов и спорадических случаев сибирской язвы обусловлено народно-хозяйственной деятельностью при проведении широкомасштабных
строительных и мелиоративных работ. Все это должно строго осуществляться и согласовываться с ветеринарной службой муниципальных образований, которые владеют информацией о наличии на той или иной территории отдельных захоронений больного скота и скотомогильников, являющихся потенциальными рассадниками возбудителя сибирской язвы. С целью профилактики заражения животных данным заболеванием на территории России проводится вакцинация животных с охватом всего восприимчивого поголовья [4, 5, 7].
Несмотря на то, что сибирская язва тщательно изучена и подробно описана в специальной литературе, она продолжает оставаться наиболее опасной болезнью и малейшее пренебрежение профилактическими мероприятиями против данного заболевания может нанести огромный экономический ущерб и принести большую
