CC BY
46УДК 619:616.98:578.842.1:577.2
ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ МЕТОД ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К БЕЛКУ р30 ВИРУСА АЧС
1О.А.Верховский - доктор биологических наук, профессор; 1В.В.Цибезов - кандидат биологических наук, вед.н.с.; 1К.П.Алексеев - кандидат биологических наук, вед.н.с.; 1А.Ю.Козлов - кандидат биологических наук, вед.н.с.; Л.В.Костина - кандидат биологических наук, ст.н.с.; 2Н.Н.Власова - доктор биологических наук, гл.н.с.; 3О.Ю.Черных - доктор ветеринарных наук,
директор; 1Т.И.Алипер - доктор биологических наук, профессор.
1АНО «Научно-исследовательский институт диагностики и профилактики болезней человека и животных», г.Москва, (123098, г.Москва, ул. Гамалеи, 16, e-mail: [email protected]). 2ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), г.Владимир (600901, г.Владимир, мкр. Юрьевец, ул.Институтскийгородок, 33, e-mail: vlasova_nn@ arriah.ru).
3гБу кК «Кропоткинская краевая ветеринарная лаборатория», г. Кропоткин (352380, Краснодарский край, г.Кропоткин, ул. Красноармейская, 303, e-mail: [email protected]).
Синтезированрекомбинантный белокр30 вируса АЧС и получены специфические моноклональные антитела к данному белку. Разработана тест-система в формате конкурентного ИФА для выявления антител к вирусу АЧС. Диагностическая чувствительность и специфичность разработанной тест-системы составляют 97,5 и 100% соответственно. Установлено, что с помощью ИФА антитела квирусуАЧСвыявляют на 9-11 сутки после заражения. Показана высокая практическая эффективность тест-системы при выявлении вирусспецифических антител у инфицированных АЧС животных. Обсужден алгоритм диагностических исследований на аЧс на фоне появления умеренно вирулентных изолятов вируса.
КЛюЧЕВЫЕ СЛОВА: африканская чума свиней, вирус АЧС, рекомбинантный белок р30 вируса АЧС, моноклональные антитела, вирусспецифические антитела, иммуноферментный анализ.
Африканская чума свиней (АЧС) - болезнь диких и домашних свиней, возбудителем которой является ДНК-содержащий вирус семейства Asfarviridae, штаммы и изоляты которого характеризуются значительным генетическим (24 генотипа) и иммунологическим (9 серотипов) разнообразием, обуславливающим различия их биологических свойств [3, 18]. С момента заноса вируса АЧС II генотипа 8 серотипа на территорию Российской Федерации (2007 г.), данная проблема стала самой серьезной для отечественного свиноводства. В 2014 г. вирус впервые вызвал вспышки болезни у диких кабанов и домашних свиней в сопредельных с РФ европейских странах (Литва, Латвия, Эстония, Польша, Украина), тем самым существенно расширив ареал своего обитания [5, 10]. Это свидетельствует о том, что, несмотря на принимаемые меры по нераспространению и искоренению болезни, АЧС в ближайшие годы будет продолжать наносить значительный экономический ущерб всей отрасли в целом и представлять большую угрозу продовольственной безопасности нашей страны. В связи с сохраняющейся сложной эпидемиологической ситуацией по АЧС, активному продолжению распространения болезни и отсутствием средств специфической профилактики, в настоящее время на первый план по-прежнему выдвигаются меры борьбы, включающие постоянный мониторинг инфекции и постановку точного диагноза.
По имеющимся данным, выделенные на территории РФ изоляты вируса АЧС обладают высокой вирулентностью и вызывают острую форму болезни со
100% летальностью [1, 2]. Поэтому основным диаг ностическим подходом является использование методов, направленных на выделение и идентификацию вируса в культуре клеток, обнаружение ДНК вируса с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), антигенов вируса иммуноферментным методом (ИФА).
Вместе с тем, установленная высокая изменчивость вируса АЧС, яв-ляющаяся причиной различий биологических свойств его штаммов, предопределяет необходимость проведения разноплановых исследований полевых изолятов вируса с целью своевременного обнаружения изменений степени их вирулентности. Так, в предшествующие эпизоотии АЧС (Испания, Португалия, Италия, Бразилия), когда не удавалось немедленно локализовать вспышку, а вирус АЧС циркулировал в дикой природе, регистрировали изменения его вирулентности и антигенных свойств, сопровождающееся гетерогенностью состава вновь сформировавшейся популяции вируса [11]. В результате исследований, проводимых в последнее время в неблагополучных по АЧС странах восточной Европы, отмечают увеличение случаев выявления сероположи-тельных проб от кабанов и снижение вирулентности циркулирующего вируса. Так, в странах Балтии, при исследовании сывороток крови диких кабанов в 2014 году у 25,7% из них выявляли одновременно ДНК вируса и вирус-специфические антитела. У 53,8% обнаруживали только ДНК вируса, а антитела - у 20,5% [9]. В 2015 году отмечен существенный рост выявления серопозитивных проб от диких кабанов - 49,3% (более
чем в 2 раза). Одновременно обнаруживали ДНК и антитела в 17,5 % случаев. А вот число проб, где выявлялась только ДНК вируса АЧС, снизилось до 33,2% (в 1,6 раза меньше, чем в предшествующем году). Результаты исследований изолятов вируса АЧС, выделенных от диких кабанов, проведенные в ФГБУ «ВНИИЗЖ», свидетельствуют о том, что в нашей стране также удалось обнаружить варианты вируса АЧС со сниженной вирулентностью [4]. Генетический анализ этих изо-лятов позволил установить изменения в структуре их генов и соответствующих биологических свойств, заключающихся в различии характера гемадсорбции в первичной культуре клеток альвеолярных макрофагов свиньи, сроках виремии, наличии вирусспецифиче-ских антител в сыворотке крови и продолжительности жизни поросят после экспериментального заражения. Таким образом, появление в популяции свиней умеренно вирулентных изолятов вируса АЧС, вызывающих невысокий уровень смертности, но высокий уровень заболеваемости, предопределяет масштабное использование методов, основанных на обнаружении вирус-специфических антител.
Известно, что одними из основных иммуногенных и диагностически значимых белков вируса АЧС являются белки р72, р30, р54 [7, 15]. Антитела к р72 ингибируют первый этап вирусного репликативного цикла, связанного с прикреплением вируса, в то время как антитела к р30 и р54 ингибируют интернализацию вируса в клетку [6, 7, 14]. В настоящее время в большинстве тест-систем для выявления антител к вирусу АЧС в формате ИФА в качестве антигена используется рекомбинант-ный белок р72. Однако, согласно литературным данным, после заражения вирусом АЧС антитела к белку р72 могут быть обнаружены на более поздних стадиях заболеваниях, чем антитела к белку р30 [8, 12, 19]. Таким образом, использование белка р30 в качестве антигена теоретически может быть более эффективным средством ранней серологической диагностики АЧС.
Целью настоящей работ разработка тест-системы для выявления антител к вирусу АЧС методом конкурентного ИФА с использованием рекомбинантного белка р30 и специфических моноклональных антител (МКА) к этому белку.
Материалы и методы. Получение рекомбинантного белка р30. Для получения рекомбинант-ного белка использована прокариотическая система экспрессии в E.coli pET (Novagen, США). Экспрессиру-ющий вектор, содержащий в своем составе целлюло-зо-связывающий домен [20] был выбран для получения химерной конструкции CBD-SG-p30t, в которой N-кон-цевая часть представлена целлюлозо-связывающим доменом, который через серин-глициновый спейсер соединен с фрагментом гена р30. Фрагмент гена p30 размером 354 п.о., кодирующий 118 аминокислот, был амплифицирован с ДНК вируса АЧС, выделенной из патматериала. Полученный фрагмент был лигирован с линеизированной плазмидой pET37b, содержащей
целлюлозосвязывающий домен. Экспрессию рекомбинантного химерного белка проводили в клетках E.coli штамма BL21(DE3) pLysS (Novagen, США). Белок очищали из микробной массы методом хроматографии на целлюлозе Avicel PH-101 (Sigma) с элюцией фор-мамидом (Acros Organics, США) и диализовали против ФСБТ. Идентификацию и степень чистоты полученного препарата определяли методами электрофореза в 12% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия [17], иммуноблоттинга [21] и непрямго ИФА с использованием МКА и референтных положительных и отрицательных сывороток крови свиней.
Получение МКА к рекомбинантному белку р30. Для получения МКА мышей линии BALB/c 4 раза иммунизировали рекомбинантным белком р30 (200 мкг/ мышь) с двухнедельным интервалом между иммуниза-циями. Бустерную дозу (200 мкг/мышь) вводили за 3 дня до выделения селезенки.
Гибридомные клеточные линии получали путем слияния спленоцитов с перевиваемой клеточной линией миеломы Sp2/0.
Скрининг и оценку иммунологической активности МКА в сыворотке крови мышей или культуральной жидкости проводили методом непрямого ИФА. Позитивные гибридомы реклонировали и наращивали в культуральных флаконах, увеличивая объем. Асцити-ческие жидкости, содержащие МКА, получали после введения гибридомных клеток в брюшную полость праймированных пристаном мышей линии BALB/c. Очистку МКА из асцитических жидкостей осуществляли методом аффинной хроматографии с использованием Белок-А-агарозы (Sigma, США).
Конъюгаты МКА с пероксидазой хрена получали периодатным методом.
Иммуноферментный метод выявления антител к антигену вируса АЧС в формате непрямого ИФА.
Очищенный рекомбинантный белок р30 сорбировали в лунках микропланшета в 0,1 М карбонатном буфере, рН=9,5 (концентрация 5 мкг/мл) по 100 мкл в лунку в течение ночи при 40С. После 4-кратной отмывки планшета в лунки вносили по 100 мкл исследуемой сыворотки крови мыши, асцитной жидкости, очищенных МКА или сыворотки крови свиньи. Инкубировали планшет 1 час при +370С. После отмывки планшета в лунки вносили по 100 мкл пероксидазного конъюгата антител к иммуноглобулинам мыши или свиньи. Инкубировали планшет 1 час при +370С. После промывания планшета вносили по 0,1 мл субстратного раствора с тетраметил-бензидином (Хема, Россия). Инкубировали 15 мин при комнатной температуре в темноте и добавляли 0,1 мл 1 М H2SO4 для остановки реакции. Оптическую плотность 2при4450 нм (А450) измеряли на спектрофотометре с вертикальным лучом Multiscan ЕХ (Thermo, США).
Иммуноферментный метод выявления антител к антигену вируса АЧС в формате конкурентного ИФА.
Очищенный рекомбинантный белок р30 сорбирова-
НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННЫЙ ЖУРНАЛ
№ 5/2018
10
1 ЕТЕРННАРНЫЙ
ли в лунках микропланшета в 0,1 М карбонатном буфере, рН=9,5 (концентрация 5 мкг/мл) по 100 мкл в лунку в течение ночи при 40С. После 4-кратной отмывки планшета в лунки вносили по 100 мкл исследуемой сыворотки крови свиньи. Инкубировали планшет 1 час при +370С. После отмывки планшета в лунки вносили по 100 мкл пе-роксидазного конъюгата МКА к белку р30. Инкубировали планшет 1 час при +370С. После промывания планшета вносили по 0,1 мл субстратного раствора с тетраметил-бензидином (Хема, Россия). Инкубировали 15 мин при комнатной температуре в темноте и добавляли 0,1 мл 1 М H2SO4 для остановки реакции. Оптическую плотность при 450 нм (А450) измеряли на спектрофотометре с вертикальным лучом Multiscan ЕХ (Thermo, США).
Результаты анализа выражали в виде коэффициента ингибирования (Кинг), расчитываемого по формуле:
К = (А450К- - А450 ИС) / (А450К- - А450К+) х 100,
инг v 450 450 ' ' v 450 450 ' 1
где: А450К- - оптическая плотность для отрицательного контроля,
А450 ИС - оптическая плотность для исследуемой сыворотки,
А А450К+ - оптическая плотность для положительного контроля.
Величина Кинг отражала количество специфичных антител, связанных с иммобилизованным на поверхности лунок рекомбинантным белком р30 и прямо пропорциональна их уровню в исследуемой сыворотке.
В качестве положительного (К+) и отрицательного (К-) контролей использовали предварительно по-
добранные сыворотки свиней с высоким содержанием антител к вирусу АЧС и сыворотки, не содержащие антител, соответственно.
Сыворотки крови. Использовали сыворотки крови свиней от заведомо неиммунных и экспериментально зараженных животных. Все сыворотки были охарактеризованы на наличие или отсутствие антител к вирусу АЧС иммуноферментным методом с применением коммерческого набора для выявления антител к вирусу АЧС производства компании ID-Vet (Франция) в соответствии с инструкцией изготовителя.
Результаты и исследований. Особенности иммунного ответа на белок р30 вируса АЧС делает его одним из перспективных антигенов для серологических исследований при АЧС. С применением этого белка разработана эффективная система детекции антител к вирусу АЧС методом иммуноблотинга [16]. Методом непрямого ИФА показано, что антитела к белку р30 можно определять не только в сыворотке крови, но и в слюне зараженных животных [13].
В настоящей работе представлены результаты по созданию тест-системы выявления антител к белку р30 вируса АЧС в формате конкурентного ИФА.
Очищенный рекомбинантный белок р30 (рек-р30) вируса АЧС был охарактеризован биохимическими и иммунохимическими методами (электрофорез, иммуноблоттинг, ИФА). Показано, что полученный продукт обладает электрофорети-ческой гомогенностью (рис.1 А) и детектируется АЧС-специфическими сыворотками в ИФА и имму-ноблотинге (рис.1В). 3 4
А В
Рис.1. Характеристика чистоты и иммуноспецифичности рекомбинантного р30 вируса АЧС. А - электрофорез в 12% ПААГ в присутствии ДСН- Ыа с окраской суммарного белка Кумасси 0-250 исходного клеточного лизата (1) и очищенного белка р30 (2); В - иммуноблот очищенного белка р30 после обработки положительной (3) и отрицательной (4) сыворотками крови свиньи.
Полученный рекомбинантный белок р30 вируса АЧС был использован в качестве антигена для получения МкА. В ходе проведенной гибридизации было получено 739 гибридных клеточных линий, устойчивых к селективной среде НАТ. Начиная с 9-х сут, проводили скрининг гибридомных культур на продукцию специфических антител к белку р30 вируса АЧС методом непрямого ИФА. После первичного тестирования культуральных жидкостей было отобрано позитивных 11 гибридомных клонов. Далее было
проведено трехкратное клонирование гибридом методом предельных разведений, после чего было отобрано 2 гибридных клона продуцирующих МКА к белку р30 вируса АЧС: 5B7 и ^9. МКА были очищены аффинной хроматографией из асцитических жидкостей мышей и конъюгированы пероксидазой хрена. Полученные конъюгаты МКА специфически связывались с белком р30 в прямом ИФА (рис.1А), однако в конкурентном ИФА только МКА ^9 сохраняли свою активность (рис.1В).
А
3 -| 2,5 -
2 - \\
J 1.51 " 0,5 - -♦— 5В7-ПХ —пх
О 1/15000 1/45000 1/135000 1/405000 1/1215000 1/3645000 Разведение конъюгата
3 -| ___В
2,5 -
2 -
1 1,5 -<
1 - \ —*-5В7-ПХ
0,5 - ■- —^lG9-nX
0 - 1/15000 1/45000 1/135000 1/405000 1/12150001/3645000 Разведение конъюгата
Рис. 2. Эффективность пероксидазных конъюгатов МКА 5B7 и МКА 1G9 в прямом (А) и конкурентном (В) форматах ИФА.
Таким образом, с применением рекомбинантного белка р30 и МКА ^9 возможно выявление антител к вирусу АЧС в формате конкурентного ИФА.
Диагностическую чувствительность и специфичность метода определяли на панели сывороток крови от заведомо неиммунных и экспериментально зараженных животных.
Показано, что для всех предварительно отобранных негативных сывороток (146 образцов) величина Кинг не превышала 40%, т.е. значение Кинг, позволяющее дискриминировать отрицательные сыворотки данным
методом, составляло 40%. Таким образом, тест-система демонстрирует 100%-ную специфичность.
У заведомо положительных сывороток Кинг превышал 40%. Диагностическая чувствительность разработанной тест-системы по отношению к набору ID-Vet (Франция) составила 97,5%.
Исследована динамика формирования иммунного ответа у экспериментально зараженных животных. Установлено, что с помощью разработанной тест-системы антитела к вирусу АЧС выявляются на 9-11 сут после заражения (рис. 2).
6 10 13 17 20 25 28 32 35
Сутки после заражения
Рис. 3. Результаты определения уровня антител к вирусу АЧС иммуноферментным методом после экспериментального заражения животных вирусом АЧС.
Таблица 1
Обобщенные результаты исследований на АЧС с использованием разноплановых методов
Результат исследований ПЦР/ИФА Количество животных Возможный титр вируса в сыворотке крови(ГАдЕ 50/мл)а Относительный уровень антител в сыворотке кровиь Предполагаемый срок после инфицирования свиней (сут.)с
сомнительный ПЦР/ отрицательный ИФА 4 < 10 - 1 - 9
положительный ПЦР/ отрицательный ИФА 60 107 - 3 - 9
положительный ПЦР/ положительный ИФА 13 103-105 средний или высокий 9 - 20
сомнительный ПЦР/ положительный ИФА 23 <10 высокий > 20
Примечание: а - исходя из чувствительности ПЦР-РВ и величины Ct; b - в зависимости от абсолютной величины коэффициента ингибирования в разработанной тест-системе или положительного значения в наборе ID-Vet; c - с учетом обобщения имеющейся информации и сопоставления полученных результатов.
Эти результаты хорошо согласуются с ранее опубликованными данными о том, что антитела к белку р30 выявляются раньше, чем к белку р72 [8, 12, 19].
Практическую эффективность тест-системы оценивали на базе референтной лаборатории по АЧС ФГБУ «ВНИИЗЖ» при исследовании 100 проб сыворотки крови, полученных от инфицированных животных свинокомплекса после официально зарегистрированной вспышки АЧС (Краснодарский край). Исследования были проведены комплексно с использованием ПЦР в режиме «реального времени» (ПЦР-РВ) для определения ДНК вируса АЧС, разра-
ботанной тест-системы и французского набора для выявления вирус-специфических антител, выделения вируса АЧС в культуре клеток. Было установлено, что 73 исследуемые пробы (73%) содержали ДНК вируса АЧС, 27 исследуемых проб (27%) показали сомнительный результат в ПЦР-РВ. При этом 36 исследуемых проб (36%) содержали антитела к вирусу АЧС, из них 34 (34%) пробы были положительными в двух тестах ИФА, 2 пробы были положительны во французском наборе и показали сомнительный результат в разработанной тест-системе. Вирус АЧС был выделен в культуре клеток из всех исследованных проб
(п=40). При этом из ПЦР-РВ положительных проб он выделялся после первого пассажа и после второго пассажа - из проб, показавших сомнительный результат в ПЦР-Рв. По результатам секвенирования генов выделенный изолят относится ко II генотипу вируса АЧС, однако анализ полученных результатов свидетельствовал об изменении формы течения болезни и динамики развития инфекционного процесса при данной вспышке болезни (табл. 1).
Таким образом, на фоне нехарактерных для острой формы АЧС клинических признаков болезни и большого количества выживших серопозитивных свиней, можно предположить, что данную вспышку вызвал умеренно вирулентный вирус. Это подтверждают полученные ранее результаты отечественных и зарубежных исследователей о появлении в попу-
ляции свиней умеренно вирулентных изолятов вируса АЧС, свидетельствующих о его гетерогенности в пределах II генотипа.
Заключение. Разработанная тест-система в формате конкурентного ИФА на основе рекомбинантного белка р30 вируса АЧС и специфических МКА является эффективным методом выявления антител к вирусу АЧС в практических условиях. Ее можно использовать на базе ветеринарных лабораторий для обследования популяции домашних и диких свиней в диагностических и мониторинговых целях. Показана необходимость использования ИФА в комплексе современных методов лабораторной диагностики АЧС, что позволит более эффективно осуществлять контроль за распространением вируса на территории нашей страны и оперативно принимать меры по ликвидации очагов инфекции.
Литература
1. Биологические свойства вируса африканской чумы свиней, выделенного в Российской Федерации / В.М. Балышев, В.В.Куриннов, С.Ж.Цыбанов [и др.] // Ветеринария. - 2010. - № 7. - С. 25-27.
2. Вирулентность изолятов вируса АЧС / С.А.Белянин [и др.] // Ветеринария Кубани. - 2011. - № 5. - С. 9-10.
3. Середа, А.Д. Антигенное разнообразие вирусов африканской чумы свиней / А.Д.Середа, В.М.Балышев // Вопросы вирусологии. - 2011. - Tom. 56. - № 4. - С. 38-42.
4. Шевченко, И.В. Биологические свойства и анализ полных геномов российских изолятов вируса африканской чумы свиней, выделенных в 2013-2014 гг: дис. ... канд. биол. наук / И.В.Шевченко. - Владимир, 2017.
5. Эпизоотическая ситуация по АЧС в РФ и странах восточной Европы (по данным МЭБ на 27.10.2017 г.) [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://www.fsvps.ru/fsvps-docs/ru/iac/asf/2017/10-27/05.pdf (проверено 30.10.2017).
6. Serodiagnosis of african swine fever using the recombinant protein p30 expressed in insect larvae / M.G.Barderas, A.Wigdorovitz, F.Merelo [et al.] // J. Virol. Methods. - 2000. - Vol. 89. - Р. 129-136.
7. Genotyping field strains of African swine fever virus by partial p72 gene characterization / A.D.Bastos [et al.] // Archives of Virology. - 2003. - Vol. 148. - P. 693-706.
8. African swine fever virus serodiagnosis: a general review with a focus on the analyses of African serum samples / C.Cubillos [et al.] // Virus Res. - 2013. - Vol. 173 (1). - P. 159-67.
9. Current of ASF situation in Latvia / S.Cvetkova [et al.] // Workshop on Laboratory Diagnosis and Control of CSF and ASF. - Hannover, Germany, 2016. - P. 11.
10. Epidemiological analyses of African swine fever in the Baltic States and Poland: (Update September 2016-September 2017) / K.Depner [et al.] // EFSA Journal November 2017. - 15(11), D0I:10.2903/j.efsa.2017.5068.
11. Freitas T.R.P. African swine fever virus low and moderate virulence strains infections in Brazilian outbreaks / T.R.P.Freitas, T.M.de Paula Lyra - New York, 1978 / https://www.researchgate.net/publication/259570847.
12. Assessment of African Swine Fever Diagnostic Techniques as a Response to the Epidemic Outbreaks in Eastern European Union Countries: How To Improve Surveillance and Control Programs / C.Gallardo [et al.] // Journal of Clinical Microbiology. - 2015. - Vol. 53(8). - P.2555-2565.
13. Detection of African Swine Fever Virus Antibodies in Serum and Oral Fluid Specimens Using a Recombinant Protein 30 (p30) Dual Matrix Indirect ELISA. PLOS ONE / L.G.Gimenez-Lirola [et al.] | D0I:10.1371/journal.pone.0161230 September 9, 2016.
14. Neutralizing antibodies to different proteins of African swine fever virus inhibit both virus attachment and internalization / P.Gomez-Puertas [et al.] // J.Virol. - 1996. - Vol. 70. - P. 5689-5694.
15. The African Swine Fever Virus Proteins p54 and p30 Are Involved in Two Distinct Steps of Virus Attachment and Both Contribute to the Antibody-Mediated Protective Immune Response / P.Gomez-Puertas [et al.] // Virology. - 1998. - Vol. 243. - P.461-471.
16. Recombinant Protein p30 for Serological Diagnosis of African Swine Fever by Immunoblotting Assay / A.S.Kazakova [et al.] // Transbound Emerg Dis. - 2017. - Oct. - № 64 (5). - P. 1479-1492. doi: 10.1111/tbed.12539. Epub 2016 Jul 8.
17. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assambly of the head of bacteriophage T4 / U.K.Laemmli // Nature, London. - 1970. - Vol. 227. - P. 680-685.
18. Genetic characterization of African swine fever virus isolates from soft ticks at the wildlife/domestic interface in Mozambique and identification of a novel genotype / C.J. [et al.] // Transbound Emerg Dis. - 2017. - P. 1-12. DOI: 10.1111/tbed.12700.
19. Systematic analysis of longitudinal serological responses of pigs infected experimentally with African swine fever virus / A.L.Reis [et al.] // Journal of General Virology. - 2007. - Vol. 88. - P. 2426 - 2434.
20. Expression, purification and applications of staphylococcal protein A fused to cellulose-binding domain / E.Shpigel [et al.] // Biotechnol. Appl. Biochem. - 2000. - Vol. 31 - P. 197-203.
21. Towbin, H. Electrophoretic transfer of proteins from polyacacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications / H.Towbin, T.Staehilin, J.Gordon // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1979. - Vol. 76. - P. 4350-4354.
ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY FOR IDENTIFICATING ANTIBODIES TO THE PROTEIN р30 OF THE AFRICAN SWINE FEVER VIRUS
1Verkhovsky O.A. - Doctor of Biological Sciences, professor; 1Tsibezov V.V. - Candidate of Biological Sciences; 1Alekseev K.P. - Candidate of Biological Sciences; 1KozlovA.Yu. - Candidate of Biological
Sciences; 1Kostina L.V. - Candidate of Biological Sciences; 2Vlasova N.N. - Doctor of Biological Sciences;
3Chernykh O.Yu. - Doctor of Veterinary Sciences; 1Aliper T.I. - Doctor of Biological Sciences, professor.
diagnostic and Prevention Research Institute for Human and Animal Diseases, Moscow
(e-mail: [email protected]).
2Federal Centre for Animal Health (ARRIAH), Vladimir (e-mail: vlasova_nn @ arriah.ru).
3Kropotkin Regional Veterinary Laboratory, Kropotkin (e-mail: [email protected]).
The recombinant protein p30 (rec-p30) of African swine fever virus (ASFV) has been synthesized and specific monoclonal antibodies (Mabs) to this protein have been obtained. The test-system in the format of solid-phase competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has been developed to identify ASFV-antibodies. The ELISA has demonstrated 97,5 % sensitivity and 100% specificity. Using ELISA the ASFV- antibodies are found to be detected on 9 - 11 days post infection. The high efficiency of practical application of ELISA to identify virus-specific antibodies in ASFV animals has been demonstrated. The algorithm of diagnostic studies for ASFV in the background of occurrence of moderate virulent isolates of ASFV has been discussed.
KEYWORDS: African swine fever, ASF virus, recombinant protein p30 ASFV, monoclonal antibodies, virus-specific antibodies, enzyme-linked immunosorbent assay.
References
1. Biologicheskie svoystva virusa afrikanskoy chumy sviney, vydelennogo v Rossiyskoy Federatsii [Biological properties of African swine fever virus isolated in Russian Federation] / V.M.Balyshev, V.V.Kurinnov, S. Zh. Tsybanov [et al.] // Veterinariya. - 2010. - № 7. - P.25-27.
2. Virulentnost izolyatov virusa ACHS [Virulence of isolates of African swine fever virus] / S.A.Belyanin [et al.] // Veterinariya Kubani. - 2011. - № 5. - P. 9-10.
3. Sereda, A.D. Antigennoe raznoobrazie virusov afrikanskoy chumy sviney [Antigenic diversity of African swine fever viruses] / A.D.Sereda, V.M.Balyshev // Voprosy virusologii. - 2011. - Tom. 56, № 4. - P. 38-42.
4. Shevchenko, I.V. Biologicheskie svoystva i analiz polnykh genomov rossiyskikh izolyatov virusa afrikanskoy chumy sviney, vydelennykh v 2013-2014 gg: dis. ... cand biol. nauk. [Biological properties and analysis of full genoms of Russian isolates of African swine fever viruse, isolated in 2013-2014: dissertation for Candidate of Biological Sciences] / I.V.Shevchenko. - Vladimir, 2017.
5. Epizooticheskaya situatsiya po ACHS v RF i stranakh vostochnoy Evropy (po dannym MEB na 27.10.2017 g.) [Elektronny resurs] [Epizootic situation for African swine fever in Russian Federation and countries of Southern Europe (according to OIE for 27.10.2017]. - Rezhim dostupa: http://www.fsvps.ru/fsvps-docs/ru/iac/asf/2017/10-27/05.pdf (30.10.2017).
6. Serodiagnosis of african swine fever using the recombinant protein p30 expressed in insect larvae / M.G.Barderas, A.Wigdorovitz, F.Merelo [et al.] // J. Virol. Methods. - 2000. - Vol. 89. - P. 129-136.
7. Genotyping field strains of African swine fever virus by partial p72 gene characterization / A.D.Bastos [et al.] // Archives of Virology. - 2003. - Vol. 148. - P. 693-706.
8. African swine fever virus serodiagnosis: a general review with a focus on the analyses of African serum samples / C.Cubillos [et al.] // Virus Res. - 2013. - Vol. 173 (1). - P. 159-67.
