CC BY
98
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ♦ Эпизоотология ♦
УДК: 619:616.98:578.842.1:616-078
Выявление клинико-анатомических, гистологических изменений при АЧС и локализации вируса в органах инфицированных животных
И.Ю. Жуков1, аспирант, И.В. Шевченко1, аспирант, А.С. Иголкин1, кандидат ветеринарных наук, А.В. Борисова1, А.А. Егоров1, В.В. Цибезов2, кандидат биологических наук, О.А. Верховский2, доктор биологических наук, Н.Н. Власова1, доктор биологических наук, (vlasova_nn@arriah.ru).
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ ВНИИЗЖ) (Владимир).
2 Автономная некоммерческая организация «Научно-исследовательский институт диагностики и профилактики болезней человека и животных (АНО ДПБ) (Москва).
В статье представлены результаты исследований клинических и патолого-анатомических признаков у животных, экспериментально зараженных изолятами вируса АЧС «Одинцово 02/14» и «Лазаревское 01/14», а также исследований иммунопероксидазным и иммунофлуоресцентным методами срезов органов клинически здоровых и экспериментально зараженных вирусом АЧС свиней. Проведен сравнительный анализ результатов изучения локализации вируса АЧС в лимфатических узлах, селезенке и почках инфицированных животных методами иммунофлуоресцентного и иммунопероксидазного анализа с применением моноклональных антител к белку р72 вируса АЧС.
Ключевые слова: африканская чума свиней, белокр72, инкубационный период; иммуногистохимия, иммуноперок-сидазный метод, иммунофлуоресцентный метод, срезы тканей животных, экспериментальное заражение Сокращения: АЧС — африканская чума свиней, ВАЧС — вирус африканской чумы свиней, ГАдЕ — гемаадсор-бирующие единицы, ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота, ИГХ — иммуногистохимия, ИФА — иммуно-ферментный анализ, КЛС—клетки лейкоцитов свиньи, КЧС — классическая чума свиней, ПЦР—полимеразная цепная реакция, РГАд—реакция гемадсорбции, ФИТЦ— флуоресцеинизотиоцианат, PBS — рЪозрЪаге buffered saline (фосфатно-солевой буферный раствор)
Введение
Возбудитель АЧС — ДНК-содержащий вирус семейства Asfarviridae, штаммы которого различаются по вирулентности, контагиозности, способности размножаться в клещах [7]; обладает высокой вирулентностью и вызывает у свиней, как правило, острую форму болезни, которая проявляется геморрагическим синдромом с характерными мультисистемными поражениями органов, виремией, отсутствием специфических антител в сыворотке крови и 100%-й летальностью [2].
АЧС является эндемичным заболеванием для многих стран Африки [8], однако, в последние годы с этой проблемой столкнулись и европейские страны: Россия, Украина, Р. Беларусь, Р. Литва, Р. Латвия, Эстония и Польша. С 2007 г на территории РФ регистрируются новые случаи АЧС как среди диких кабанов, так и среди домашних свиней, наносящие значительный экономический ущерб свиноводству и сельскому хозяйству в целом [1, 4].
К особенности АЧС в России следует отнести то, что возбудителем болезни является вирус, принадлежащий ко II генотипу 8 серотипу [1], который ранее циркулировал только на территории африканского континента и о. Мадагаскар. Его биологические свойства до настоящего времени мало изучены.
Установить этиологический агент (причину болезни) и принадлежность возбудителя болезни к определенному семейству по проявлению клинических признаков не всегда представляется возможным. Поэтому в таких ситуациях для дифференциальной диагностики применяют высокочувствительные и специфичные методы исследования — ПЦР и иммуногистохимический анализ с использованием моноклональных антител [5].
ИГХ служит высокотехнологичным методическим дополнением к традиционным гистологическим методам исследования в клинической диагностике, но имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционными фермент-опосредованными методами (ИФА): обеспечивает высокую чувствительность и специфичность иммуногистохимических исследований; позволяет выявлять антигены со слабой экспрессией и, благодаря системе двойного окрашивания, — одновременно выявлять два и более различных антигенов на одном препарате [4].
ИГХ с использованием моноклональных антител к вирусспецифическому белку р72 при изучении АЧС имеет большое прикладное значение: посредством данной методики удается быстро и с высокой точностью установить локализацию возбудителя в гистосрезе органа, особенности его репродукции, уникальные свойства отдельных изолятов. Белок р72 является высококонсервативным мажорным антигеном, антитела к которому взаимодействуют практически со всеми известными изолятами и штаммами вируса АЧС. На долю белка р72 приходится 35 % общей массы белков вириона, поэтому моноклональные антитела к белку р72 используют в диагностических целях [11].
Особую актуальность приобретает ИГХ при виру-соносительстве и стертых формах течения АЧС. Поскольку некоторые патологические состояния трудно определимы и тяжело дифференцируемы, их можно выявить не только посредством традиционной ПЦР, но и с помощью ИГХ [7].
Цель исследования
Учитывая возможность изменения вирулентности вируса АЧС в процессе длительной циркуляции на территории РФ, целью наших исследований являлось изучение клинико-анатомических и гистологических изменений при АЧС, а также определение локализации вируса в органах инфицированных животных.
Материалы и методы
В эксперименте использовали изоляты ВАЧС: «Лазаревское 01/14», выделенный от павшей домашней свиньи в Тульской области и «Одинцово 02/14», выделенный из селезенки павшего дикого кабана в Московской области. Титрование и определение инфекционной активности проводили в РГАд. Для заражения готовили 10%-ю суспензию селезенки. Опыты проводили в специально оборудованном виварном помещении (ФГБУ ВНИИЗЖ) в изолированном боксе II класса биобезопасности.
В качестве экспериментальных животных использовали домашних свиней крупной белой породы возрастом 3 месяца, полученных из хозяйств, благополучных по АЧС и КЧС. Исследования поступивших животных включали в себя клинический осмотр, термометрию тела, отбор проб крови для определения наличия ВАЧС [3]. До начала опыта животных выдерживали в карантине в течение 7 суток.
В работе использовали пробы органов животных, содержащие ВАЧС после заражения, у которых в ходе эксперимента наблюдали характерную для АЧС клиническую картину: двух животных, зараженных 10%-й суспензией селезенки, содержащей ВАЧС, изолят «Одинцово 02/14» в дозе 5000 ГАдЕ и одного зараженного изолятом «Лазаревское 01/14» в дозе 50 ГАдЕ. Для контроля использовали материалы от неинфицированного животного.
В ходе опыта вели наблюдение за животными с отбором проб в разные сроки после заражения и анализом таких показателей, как температура, наличие вируса в крови и длительность болезни до гибели. В течение опыта уровень накопления вируса в крови определяли согласно «Методическим рекомендациям по выделению и титрованию вируса африканской чумы свиней в культуре клеток лейкоцитов свиней» [3].
Павших животных вскрывали, составляли протокол патолого-анатомического исследования и отбирали пробы органов для гистологического и иммуногистохими-ческого исследования (лимфоузлы, селезенка и почки).
Ткани лимфатических узлов, селезенки и почек фиксировали 4%-м формальдегидом, затем обезвоживали, пропитывали парафином и заливали блоки тканей в парафин, готовили гистологические срезы толщиной 5 мкм, которые исследовали методом иммунофлуоресценции с применением конъюгированных с ФИТЦ моноклональ-ных антител к белку p72 вируса АЧС [8], полученных из АНО «НИИ ДПБ».
Конъюгат моноклональных антител с ФИТЦ получали согласно методу, предложенному Johnson, G.D. et al [10]. Схема исследования иммунофлуоресцентным методом: гистологические срезы, полученные из парафиновых блоков, депарафинизировали двукратно ксилолом по 3 мин, затем 96%-м этанолом двукратно по 2 мин, 70%-м этанолом 2 мин, переводили в PBS — 0,15 NaCl, 0,02 M фосфат натрия, pH 7,6. Срезы инкубировали с конъю-гатом моноклональных антител с ФИТЦ в концентрации 5 мкг/мл в PBS в течение 2 ч при температуре около 20 оС и после 5-кратного промывания PBS по 2 мин исследовали методом флуоресцентной микроскопии.
Для исследования иммунопероксидазным методом гистологические срезы, начиная с фиксирования формалином и заканчивая депарафинизацией гистологических срезов, подготавливали так же, как для исследования им-мунофлуоресцентным методом. Схема исследования иммунопероксидазным методом: инкубация с моноклональ-ными антителами к p72 вируса АЧС, затем инкубация с антивидовыми антителами к иммуноглобулину мыши, конъюгированными с пероксидазой («SIGMA», США). Для окрашивания использовали хромогенный субстрат — диаминобензидин [5].
Схема операций при исследовании иммунопероксидазным методом опубликована в статьях Jeffrey M. et al [9] и Wells G.A. [12].
Результаты
Клинические признаки и патолого-анатомические изменения. Детальное изучение биологических свойств изолятов 2014 г.: «Лазаревское 01/14» и «Одинцово 02/14» основывалось на анализе клинических признаков. Результаты наблюдения позволили выявить различия в течении АЧС у животных, зараженных изучаемыми изо-лятами. Данные представлены в таблице 1.
Как видно из данных, приведенных в таблице 1, у подсвинков, зараженных вирусом изолята «Одинцово 02/14»,
«Одинцово 02/17» Животное 1
«Одинцово 02/17» Животное 2
«Лазаревское 01/14» Животное 3
1 4 7 10 13 16 19 Сутки после заражения
б
1 3 Б 7 9 И 13 Сутки после заражения
в
1 3 5 7 9 11 13 15 Сутки после заражения
-титр -температура -титр -температура -титр -температура
Рис. 1. Графики термометрии и накопления вируса у подопытных животных. а, б — уровень накопления вируса в крови и температура тела у подсвинков, зараженных вирусом изолята «Одинцово 02/14» (животные 1 и 2); в — уровень накопления вируса в крови и температура тела у подсвинка, зараженного вирусом изолята «Лазаревское 01/14» (животное 3)
37
И.Ю. Жуков, И.В. Шевченко, А.С. Иголкин, А.В. Борисова, А.А. Егоров, В.В. Цибезов, О.А. Верховский, Н.Н. Власова
а
б
д ■ е
Рис. 2. Исследование гистологических срезов тканей животных методом иммунофлуоресценции (участки, содержащие белок р72 вируса АЧС, имеют характерное светло-зеленое свечение): а, б — лимфатический узел, об. 20, ок.10; в, г — селезенка, об. 40, ок.10; д, е — почка, об. 40, ок.10. Слева (а, в, д) — препараты от неинфицированных животных, справа (б, г, е) — экспериментально зараженных изолятом «Лазаревское 01/14» вируса АЧС. В РГАд был установлен уровень накопления вируса в крови 6,5 ^ ГАдЕ50/мл на момент гибели животного
наблюдали выраженные клинические признаки, в то время как у животного, зараженного вирусом изоля-та «Лазаревское 01/14», регистрировали только конъюнктивит и отказ от корма.
В ходе экспериментов брали пробы крови, в которых анализировали содержание вируса. У животного 3 максимальный титр накопления вируса в крови был отмечен на 15-е сутки после заражения и составил 7,0 ^ ГАдЕ5о/мл (см. рис. 1 в). У поросят, зараженных вирусом изолята «Одинцово 02/14», максимум накопления вируса в крови наблюдали на 9-е сутки после заражения (до 7,5 и 7 ^ ГАдЕ50/мл — у первого и второго животного, соответственно) (см. рис. 1 а, б). В конце опыта содержание вируса в крови снизилось у первого подсвинка до 5,5 ^ ГАдЕ50/мл, у второго — до 6 ^ ГАдЕ50/мл. Следует отметить, что пики виремии (7,5 ^ ГАдЕ50/мл), в основном, совпадают с пиками подъема температуры (до 41°С).
Животное, зараженное вирусом изолята «Лазаревское 01/14» в дозе 50 ГАдЕ50, пало на 16-е сутки.
Смерть первого подсвинка, зараженного вирусом изо-лята «Одинцово 02/14» в дозе 5000 ГАдЕ50, наступила на 13-е сутки, смерть второго — на 22-е сутки после заражения. Результаты патолого-анатомического вскрытия представлены в таблице 2.
Несмотря на различия во внешнем проявлении клинических признаков, патолого-анатомическая картина у подсвинков, зараженных изолятами «Одинцово 02/14» и «Лазаревское 01/14», различалась незначительно.
Рис. 3. Результаты исследования гистологических срезов тканей животных иммунопероксидазным методом, изолят «Одинцово 02/14» (участки, содержащие белок р72 вируса АЧС, окрашены в коричневый цвет): а — селезенка неинфицированного животного, об. 40, ок.10; скопления антигена вируса АЧС («Одинцово 02/14») в органах животного 2 — селезенке (б), об. 40, ок.10; подколенном (в) и подглоточном (г) лимфатических узлах, об. 20, ок.10; д — скопление макрофагов, содержащих антиген вируса АЧС, и эритроцитов в подглоточном лимфатическом узле животного 1, об. 20, ок.10.; е — участок ткани подглоточного лимфатического узла животного 1, содержащий незначительное количество антигена вируса АЧС, об. 20, ок.10. В РГАд был установлен уровень накопления вируса в крови 6,0 ^ ГАдЕ50/мл на момент гибели животного 1 и 7,0 ^ ГАдЕ50/мл у животного 2
1. Оценка клинических признаков, выявленных у экспериментально зараженных животных
Признаки, Изолят Изолят Изолят
обнаруженные «Одинцово 02/14» «Одинцово 02/14» "Лазаревское 01/14»
у подопытного животного Животное 1 Животное 2 Животное 3
Цианоз + - -
Истощение - + -
Коньюктивит - + +
Кровавый понос +++ + -
Отказ от корма + + +
Начало гипертермии, сутки после заражения 11 7 11
Гибель животного, сутки после заражения 22 13 16
Примечание. Интенсивность наблюдаемых признаков оценивали в «крестах»: «+» — слабо выраженный признак; «++» — четко выраженный признак; «+++» — сильно выраженный признак.
2. Оценка результатов патолого-анатомического исследования
Патологические изменения Изолят «Одинцово» (5000 ГАдЕ5о) Животное 1 Изолят «Одинцово» (5000 ГАдЕ50) Животное 2 Изолят «Лазаревское» (50 ГАдЕ50) Животное 3
Состояние лимфоузлов: гиперплазия гиперемия + + ++ ++ + +
Кровоизлияния Почки, селезенка Сердце, почки Сердце, почки
Спленомегалия ++ +++ ++
Мультифокальный некроз селезенки + + +
Дилатация желчного пузыря + - -
Жидкость в полостях Перикард, брюшная и грудная Перикард, брюшная полость -
Гастрит + + +
Энтерит + + +
Колит + + +
Примечание. Интенсивность наблюдаемых признаков оценивали в «крестах»: «+» — слабо выраженный признак; «++» — четко выраженный признак; «+++» — сильно выраженный признак.
Результаты исследования иммунофлуоресцентным и иммунопероксидазным методами. Наличие антигена вируса АЧС в органах и тканях экспериментально зараженных животных было установлено посредством РГАд в культуре КЛС [3]. В результате исследования тканей животных иммунофлуоресцентным и иммунопероксидаз-ным методами установлено, что максимальное количество клеток, содержащих белок р72 вируса АЧС, характерно для лимфатических узлов и, в меньшей степени, селезенки. В тканях лимфатических узлов и селезенки участки, включающие большое количество антиген-со-держащих клеток, расположены среди участков, не содержащих антиген ВАЧС (рис. 2 и 3).
От животного 3, зараженного изолятом «Лазаревское 01/14» вируса АЧС, были взяты образцы органов, из которых получены гистологические срезы для исследования методом иммунофлюоресценции. Гистологические срезы от животных 1 и 2, зараженных изолятом «Одинцо-во 02/14», исследовали иммунопероксидазным методом.
На рисунке 3 б представлены участки с относительно большим количеством флуоресцирующих в зеленой области спектра антиген-содержащих клеток. Среди исследованных гистологических срезов были выявлены участки с многократно (в 5.. .20 раз) меньшим количеством таких клеток.
Специфичная для АЧС гранулярная цитоплазматичес-кая флуоресценция отмечена в паракортикальной ткани лимфоидных органов, в паренхиме селезенки и почках. Однако существенной разницы в локализации вируса в органах животных, различающихся по продолжительности клинических проявлений (13.22 суток) в зависимости от дозы заражения, по распределению антиген-со-держащих клеток не выявлены. Тем не менее, с помощью иммунопероксидазного исследования удалось установить локализацию вируса АЧС в лимфоузлах, селезенке и, в существенно меньшем количестве — в почках.
Было выявлено большое количество клеток в лимфатических узлах и селезенке, содержащих белок р72 вируса АЧС, окрашенных в коричневый цвет. Однако распределение таких клеток крайне неравномерно (см. рис. 4 б и д).
Обсуждение
Для анализа биологических свойств выделяемых изо-лятов вируса АЧС существует комплекс методов, посредством которого удается определять и дифференцировать признаки, присущие каждому изоляту (начиная от клинических исследований до молекулярно-биологи-ческих тестов) [4, 7]. В результате исследования клини-ко-анатомических признаков и гистологических изменений при АЧС были обнаружены значительные изменения в лимфатических узлах и селезенке животных.
Исследование гистологических срезов этих органов позволило определить в них локализацию вируса (белка р72) АЧС. В ходе работы не удалось выявить существенных различий в уровнях накопления (количество флюоресцирующих клеток в гистосрезе) вирусного антигена в органах и тканях зараженных животных в зависимости от используемого изолята вируса АЧС.
Тем не менее, ИГХ с использованием моноклональ-ных антител к р72 вируса АЧС позволила с высокой точностью установить локализацию возбудителя в органах инфицированных животных. Кроме того, в отдельных срезах удалось выявить участки с единичными инфи-
цированными клетками, что говорит о высокой чувствительности испытанного метода. Вероятно, дальнейшее применение этого метода в лабораторной диагностике наряду с другими методами позволит с высокой точностью выявлять наличие вируса АЧС.
Выводы
В ходе работы по изучению клинико-анатомических признаков после заражения подопытных животных изолятами вируса АЧС «Одинцово 02/14» и «Лазаревское 01/14» были отмечены следующие клинические проявления: цианоз, истощение, коньюктивит, кровавый понос и отказ от корма. По результатам патолого-анатомического исследования отмечены: гиперплазия и гиперемия лимфатических узлов; кровоизлияния на почках, сердце и селезенке; спленомегалия; мультифокальный некроз селезенки; ди-латация желчного пузыря; скопление жидкости в перикарде и брюшной полости; гастрит, энтерит и колит.
По результатам гистохимического исследования с использованием моноклональных антител к р72 вируса АЧС была выявлена локализация вируса тканях селезенки и лимфатических узлов.
Таким образом, использование гистохимического метода исследования проб, наряду с иммунолюоресце-нтным и ПЦР является существенным дополнением при точной постановке диагноза в сложных случаях благодаря высокой чувствительности анализа.
Библиография
1. Балышев, В.М. Сероиммунологическая принадлежность вируса африканской чумы свиней, выделенного в Российской Федерации / В.М. Балышев, Ю.Ф. Калантаенко, М.В. Болгова, Е.Ю. Прудникова // Доклады РАСХН. — 2011. — № 5. — С. 52-53.
2. Макаров, В.В. Африканская чума свиней: монография / В.В. Макаров. — М.: РУДН, 2011. — 268 с.
3. Методические рекомендации по выделению и титрованию вируса африканской чумы свиней в культуре клеток лейкоцитов свиней / А.А. Варенцова, И.Ю. Жуков, В.Л. Гаврилова [и др.]. — Владимир: ФГБУ ВНИИЗЖ, 2014. — 21 с.
4. Методические указания по выявлению патогенной изоформы прионного белка в ткани головного и спинного мозга крупного рогатого скота иммуногистохимическим методом / С.С. Рыбаков, А.А. Егоров, Рябоконь АА. [и др.].—Утв. Департаментом ветеринарии МСХ РФ 07.06.2001, № 13-5-02/0089.
5. Рыжова, Е.В. Патоморфологические изменения у домашних свиней при остром и подостром течении африканской чумы свиней / Е.В. Рыжова и др. // РВЖ.СХЖ. — 2012. — № 1. — С. 10-13.
6. African Swine Fever (ASF) recent developments - timely updates. Worrisome dynamics: Steady spread towards unaffected areas could have disastrous impact. Klaas Dietze, Daniel Beltran-Alcrudo, Sergei Khomenko, Boubacar Seck, Julio Pintoa, Adama Diallo, Charles Lamien, Juan Lubroth, Vincent Martina and Andriy Rozstalnyy. FAO. Empress. Vol. 6 - September 2012. — P. 1-6. //www.fao.org/docrep/016/ap372e/ap372e.pdf
7. Galindo-Cardiel, I. Standardization of pathological investigations in the framework of experimental ASFV infections / I. Galin-do-Cardiel, M. Ballester, D. Solanes, et al. // Virus Research. — 2013. — No. 173. — P. 180-190.
8. Heuschele, W.P. Diagnosis of African swine fever by immunofluorescence / W.P. Heuschele, W.R. Hess // Trop. Anim. Health Prod. — 1973Aug. — No. 5(3). — P. 181-186.
9. Jeffrey, M. A morphometric and immunohistochemical study of the vestibular nuclear complex in bovine spongiform encephalopathy / M. Jeffrey, W.G. Halliday, C.M. Goodsir // Acta Neuropathol. — 1992. — Vol. 84(6). — P. 651-657.
10. Johnson, G.D. Immunofluorescence and immunoenzyme techniques. In Handbook of Experimental Immunology / G.D. Johnson, E.L. Holborow, and J. Dorling. — London: Blackwell Scientific Publications Ltd., 1978. pp. 15.1-15.30.
11. Yu, M. Strong sequence conservation of african swine fever virus p72 protein provides the molecular basis for its antigenic stability/ M. Yu, C.J. Morrissy, H.A. Westbury // Arch. Virol. — 1996. — Vol.141. — Р. 1795-1802.
12. Wells, G.A. Configurations and topographic distribution of PrP in the central nervous system in bovine spongiform encephalopathy: an immunohistochemical study / G.A. Wells, Y.I. Spencer, M. Haritani // Ann N Y Acad Sci. — 1994. — Vol. 6 (724). — P. 350-352.
SUMMARY
I.Yu. Zhukov1, I.V. Shevchenko1, A.S. Igolkin1, A.V. Borisova1, A.A. Egorov1, V.V. Tsibezov2, O.A. Verhovsky2, N.N. Vlasova1
1 Federal Center for Animal Health (Vladimir).
2 Diagnostic and Prevention Research Institute for Human and Animal Diseases (Moscow).
Identification of Clinical, Anatomical and Histological changes in the ASF and Localization of the Virus in Organs of Infected Animals. The article presents the results of studies of clinical and pathological signs in animals, experimentally infected with isolates of the African swine fever virus «Odintsovo 02/14» and «01/14 Lazarevskoye», and also immunoperoxidase and immunofluorescence research of staining sections of clinically healthy and experimentally infected with ASF pigs. A comparative analysis of the results of the study of the localization of ASF virus in the lymph nodes, spleen and kidneys of infected animals was performed with immunofluorescence and immunoperoxidase methods of analysis using a monoclonal antibody to the protein p72 ASF virus. Key words: African swine fever, experimental challenge, protein p72, incubation period, immunohistochemistry, immunofluorescence method, immunoperoxidase method, tissue sections of animals.
