CC BY
452019 т 9 № 1 крымскии журнал экспериментальной и клиническои медицины
УДК 616.62-006.6-073
МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АКТИВНОСТИ КАСПАЗЫ-9 И КАСПАЗЫ-3 ПРИ РАКЕ МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ
Демяшкин Г. А.12, Тамгин А. А.2, Ночной М. С.2, Лашков В.С.2, Богомолов С. Н.2
1ФГБУ «9 Лечебно-диагностический центр» Минобороны России, г. Москва, Россия, 119146, ул. Комсомольский проспект, д. 13а.
2Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова (Сеченовский Университет), 119434, ул. Трубецкая, д. 8, г. Москва, РФ.
Для корреспонденции: Григорий Александрович Демяшкин, 119048, г. Москва, ул. Трубецкая, д. 8; dr.dga@ mail.ru
For correspondence: Gregory Alex Demyashkin; 119048 Moscow, Trubetskaya street, 8; E-mail: dr.dga@mail.ru Information about authors:
Demyashkin G. A., http://orcid.org/0000-0001-8447-2600 Tamgin A. A., https://orcid.org/0000-0002-6030-8355 Nochnoy M. S., https://orcid.org/0000-0003-0057-9561 Lashkov V. S., https://orcid.org/0000-0002-6015-2140 Bogomolov S. N., https://orcid.org/0000-0002-8663-8229
РЕЗЮМЕ
Рак мочевого пузыря превалирует среди злокачественных новообразований органов мочевыделительной системы и составляет 70% от их числа. Доказано, что ключевым механизмом опухолевой трансформации и бесконтрольного роста клеток является нарушение баланса между пролиферацией и апоптозом. Исследование особенностей нарушений каспазного каскада при различных видах рака мочевого пузыря играет важную роль в прогнозировании и облегчении ранней диагностики злокачественного процесса и его терапии. Цель: оценка молекулярно-биологической активности каспазы-9 и каспазы-3 при уротелиальном раке, плоскоклеточном раке, а также аденокарциноме мочевого пузыря. Материал и методы: исследование основано на морфологическом анализе 50 образцов рака мочевого пузыря: плоскоклеточного рака (n=5), аденокарциномы (n=5), мышечно-инвазивного (n=20) и мышечно-неинвазивного (n=20) уротелиального рака с помощью световой микроскопии и иммуногистохимических реакций. В качестве первичных использовали антитела к каспазе-9 и каспазе-3. Результаты: максимальный уровень экспрессии каспаз при иммуногистохимическом анализе выявили в контрольной группе (79.2±0.02%, p<0,05 для каспазы-9; 92.1±0.1%, p<0,05 для каспазы-3). Снижение интенсивности реакции на каспазу-9 обнаружили во всех образцах: плоскоклеточном раке мочевого пузыря (25.1±0.2%, p<0,05), аденокарциноме (68.2±0.03%, p<0,05), мышечно-инвазивной (17.4±0.2%, p<0,05) и мышечно-неинвазивной (64.2±0.5%, p<0,05) уротелиальных карциномах. Отмечено понижение доли положительно окрашенных клеток на каспазу-3 в образцах плоскоклеточного РМП (75.2±0.1%, p<0,05), аденокарциномы (18.3±0.3%, p<0,05), мышечно-инвазивной (54.2±0.3%, p<0,05) и мышечно-неинвазивной (89.1±0.2, p<0,05) уротелиальных карциномах. Заключение: изменения активности каспазы-3 и каспазы-9 в раковых клетках мочевого пузыря свидетельствуют о дисфункции в них процессов апоптоза. Для раковых клеток из уротелия и плоского эпителия характерен высокий уровень терминации апоптоза на фоне сниженной инициации внутреннего пути. Аденокарцинома обладает повышенной агрессивностью из-за угнетения терминального этапа апоптоза.
Ключевые слова: рак мочевого пузыря, каспаза-3, каспаза-9, иммуногистохимическое исследование.
MOLECULAR BIOLOGICAL CHARACTERISTICS OF CASPASE-9 AND CASPASE-3 ACTIVITY IN URINARY BLADDER CANCER
Demyashkin G. A.1,2, Tamgin A. A.2, Nochnoy M. S.2, Lashkov V. S.2, Bogomolov S. N.2
'FSBI 9 Medical Diagnostic Center of the Ministry of Defense of the Russian Federation 119146, 13a Komsomolsky Prospekt, Moscow, Russia
2Sechenov University. 119048, Trubetskaya st., 8, Moscow, Russia.
SUMMURY
Urinary bladder cancer prevails among all malignant neoplasms of urinary system, reaching 70% of their number. It is proved, that imbalance between proliferation and apoptosis is a key factor in tumor transformation and uncontrolled cell growth mechanisms. Caspase cascade disturbances research in various forms of urinary bladder carcinoma plays considerable role in malignant process prognosis, it's early diagnosis assessment and therapy. Aim: evaluation of caspase-9 and caspase-3 molecular biological activity in urothelial carcinoma, squamous cell carcinoma and adenocarcinoma. Material and methods: we used 50 samples of urinary bladder carcinoma for morphological analysis in this research: squamous cell carcinoma (n=5), adenocarcinoma (n=5), muscle-invasive (n=20) and non-muscle-invasive (n=20) urothelial carcinoma. The assay was implemented by using light microscopy and immunohistochemical reac-
tions with primary monoclonal antibodies to caspase-9 and caspase-3. Results: strong expression levels of caspases were observed in control group (79.2±0.02%, p<0,05 for caspase-9; 92.1±0.1%, p<0,05 for caspase-3). Caspase-9 reaction decreasing was found in all carcinoma samples: squamous cell carcinoma (25.1±0.2%, p<0,05), adenocarcinoma (68.2±0.03%, p<0,05), muscle-invasive (17.4±0.2%, p<0,05) and non-muscle-invasive (64.2±0.5%, p<0,05) urothelial carcinoma. We also observed positive immunostaining decrease for caspase-3 in these samples: squamous cell carcinoma (75.2±0.1%, p<0,05), adenocarcinoma (18.3±0.3%, p<0,05), muscle-invasive (54.2±0.3%, p<0,05) and non-muscle-invasive (89.1±0.2, p<0,05) urothelial carcinoma. Conclusion: changes of caspase-9 and caspase-3 activity in cancer cells of urinary bladder indicate the disfunction of apoptosis in them. High level of apoptosis termination along with intrinsic pathway reduced initiation characterizes urothelial and squamous cell carcinomas. Adenocarci-noma shows increased aggressiveness due to depression of the apoptosis terminal phase.
Key words: urinary bladder cancer, caspase-3, caspase-9, immunohistochemical research.
В России в структуре онкологической заболеваемости на долю рака мочевого пузыря (РМП) приходится 4,5%, частота которого с каждым годом возрастает. Он превалирует среди злокачественных новообразований органов мочевыделительной системы и составляет 70% от их числа [1]. Согласно статистике, РМП у мужчин встречается в 3 - 4 раза чаще, чем у женщин [2]. Уротелиальная карцинома является основным гистологическим типом рака мочевого пузыря. Около 70 - 80% случаев приходится на мышечно-неинвазивную форму (МНИУР) уротелиального рака и 20 - 30% — на мышечно-инвазивную (МИУР) [3; 4]. Плоскоклеточный рак мочевого пузыря (ПКРМП) и аденокарци-нома (АМП) встречаются очень редко [1; 2].
Доказано, что ключевым механизмом опухолевой трансформации и бесконтрольного роста клеток является нарушение баланса между пролиферацией и апоптозом. Существуют три пути запрограммированной гибели клетки: митохондриальный (внутренний), рецепторно-опосредованный (внешний) и внутренний ЭПР-зависимый [5].
Апоптоз регулируется системой специфических положительных и отрицательных сигналов, взаимодействие между которыми определяет активацию запуска клеточной гибели. Эти сигналы обеспечивает семейство цисте-иновых протеаз, расщепляющих белки после аспартата - каспазами [6]. Активация каспаз-ного каскада представлена сложным процессом, упрощенно заключающемся в следующем. Инициаторная каспаза-9 под действием внешних стимулов запускает эффекторную каспазу-3 и фермент ДНК-азу, приводя к разрушению элементов цитоскелета и ядра [7].
Понимание механизмов апоптоза важно для оценки степени дальнейшей злокачественной трансформации опухоли, однако нарушения их регуляции до сих пор малоизучены. Исследование особенностей нарушений ка-спазного каскада при различных видах рака мочевого пузыря играет важную роль в прогнозировании и облегчении ранней диагностики злокачественного процесса и его терапии.
Цель: оценка молекулярно-биологиче-ской активности каспазы-9 и каспазы-3 при уротелиальном раке, плоскоклеточном раке, а также аденокарциноме мочевого пузыря.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Работу проводили на 50 архивных парафиновых блоках биоптатов мочевого пузыря с плоскоклеточным раком (n=5), аденокарциномой (n=5), мышечно-инвазивной (n=20) и мышечно-неин-вазивной (n=20) уротелиальными карциномами пациентов, не получавших неоадъювантной терапии; в период 2014 - 2018 годов (33 мужчины, 17 женщин), возраст - от 36 до 78 лет (в среднем 55±9 лет). В качестве контроля были исследованы 10 аутоптатов стенки мочевого пузыря.
Визуализацию материала производили на светооптическом микроскопе Leica DM 4000 B («Leica», Германия), совмещенном с видеокамерой и программным обеспечением.
Гистологическое исследование выполняли на парафиновых срезах, окрашенных гематоксилином и эозином. Иммуногистохимическое исследование проводили по стандартному протоколу в автоматическом режиме в иммуноги-стостейнере Bond-Max («Leica», Германия). В качестве первичных использовали монокло-нальные антитела (AbcamTM, США) к каспа-зе-9 (Cas-9; Clone EPR18107, 1:300) и каспазе-3 (Cas-3; Clone E87, 1:50), в качестве вторичных применяли универсальные антитела (HiDef Detection™ HRP Polymer system, «Cell Marque», США), позволяющие выявлять мышиные и кроличьи первичные антитела, конъюгированные с ферментным комплексом на основе перокси-дазы хрена. Для каждого маркера выполнялись контрольные исследования с целью исключения псевдопозитивных и псевдонегативных результатов. Ядра клеток докрашивали гематоксилином Майера; срезы промывали под проточной водой; дегидратировали и заключали в бальзам.
Характер иммуногистохимических реакций оценивали, используя полуколичественную шкалу по 3-балльной системе с подсчетом количества иммунопозитивных клеток в 10 случайно отобранных полях зрения при увели-
чении х400 (в %): «-» отсутствие, «+» слабая (5 - 25% клеток), «++» умеренная (25 - 50% клеток), «+++» выраженная (>51% клеток).
Полученные в результате подсчёта данные обрабатывали с использованием компьютерной программы SPSS 7.5 for Windows statistical software package (IBM Analytics, США). Так рассчитывали средние арифметические величины с ее предельными отклонениями и среднеквадратичную ошибку. Соответствие данных нормальному распределению подтвердили с применением критерия Колмогорова - Смирнова. При статистической обработке для оценки достоверности различий средних значений между группами использовались следующие непараметрические критерии: U-критерий Манна-Уитни, Н-критерий Краскалла-Уолле-са. При отсутствии нормального распределения данных использовали непараметрический критерий F. Wilcoxon (Statistical methods for research workers) с уровнем значимости p<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
При ПКРМП (n=5) эпителиальные пласты образовывали листовидные и гроздевидные инфильтраты, местами островки или зоны псевдокератинизации с наличием раковых жемчужин и образованием межклеточных мостиков. Раковые клетки полигональной формы с четко очерченными клеточными границами и эозинофильной цитоплазмой. Их ядра пле-оморфные, с дисперсным хроматином и выраженными ядрышками. Кроме того, обнаружено множество патологических митозов и дегенеративные клетки. В образцах аденокарциномы мочевого пузыря (n=5) преобладал железистый компонент (по типу колонического рака). В некоторых участках определялось скопление му-цинозного секрета, а атипичные гландулоциты глубоко проникали в мышечную пластинку слизистой оболочки. Мышечно-инвазивная уротелиальная карцинома (n=20) занимала большие площади стенки мочевого пузыря с очагами плоскоклеточной дифференцировки, фокусами кератинизации и образованием межклеточных коммуникаций, также встречались синцитиотрофобласто-подобные структуры. Для низкодифференцированной мышечно-не-инвазивной уротелиальной карциномы (n=8) было характерно формирование центрального фиброваскулярного стержня с признаками клеточной и тканевой атипии. При этом, раковые клетки утратили полярность и линейную перпендикулярную ориентацию по отношению к базальной мембране, диффузно распределяясь в уротелиальных пластах. Патологические митозы были редкими. Клетки гомогенные, ядра
их крупные или полиморфные. При высоко-дифференцированном варианте МНИУР (п=12) опухоль была представлена сложной папиллярной гистоархитектоникой с анастомозирующи-ми сосочковыми структурами и признаками клеточной дисхогезии и денудации. Атипичные клетки зонально образовывали кластеры. Ядра плеоморфные / анапластичные, гиперхромные, с нечеткой нуклеолеммой и хорошо определяющимися ядрышками. Фигуры патологического митоза прослеживались на всех уровнях неструктурированного эпителия, включая поверхностный слой зонтичных клеток.
При анализе иммуногистохимического распределения каспаза-9-позитивных клеток наиболее интенсивные реакции были выявлены в эпителии мочевого пузыря контрольной группы (79.2±0.02%, р<0,05). Маркирование на ка-спазу-9 значительно снижено по сравнению с нормой при плоскоклеточной (25.1±0.2%, р<0,05) и мышечно-инвазивной уротелиаль-ной (17.4±0.2%, р<0,05) карциномах мочевого пузыря в 3,1 и 4,5 раза соответственно, а также отмечено понижение доли положительно окрашенных клеток на каспазу-9 при аденокарци-номе (68.2±0.03%, р<0,05) и мышечно-неинва-зивном уротелиальном (64.2±0.5%, р<0,05) раке мочевого пузыря в 1,1 и 1,2 раза соответственно.
В клетках ПКРМП обнаружили уменьшение количества каспаза-3-позитивных клеток в 1,2 раза (75.2±0.1%, р<0,05) по сравнению с клетками переходного эпителия мочевого пузыря в группе контроля (92.1±0.1%, р<0,05). В адено-карциноме мочевого пузыря иммунореактив-ность на каспазу-3 была снижена в 5,0 раз, и составила 18.3±0.3% (р<0,05). В образцах мышеч-но-инвазивного уротелиального рака мочевого пузыря визуализировали понижение доли окрашенных на каспазу-3 клеток в 1,7 раз (54.2±0.3%, р<0,05), в то время как при мышечно-неинва-зивном уротелиальном раке этот показатель соответствовал - 89.1±0.2% (р<0,05) (табл. 1, рис.1)
ОБСУЖДЕНИЕ
Каспазный каскад, играя ключевую роль в апоптозе, тесно связан с этапами злокачественного роста. В раковых клетках зачастую отмечается низкий уровень экспрессии либо инактивации некоторых каспаз, что обусловливает устойчивость таких клеток к различного рода стрессовым воздействиям, в том числе и лечению.
Однако возможно, что каспазы играют и неапоптозную роль в канцерогенезе, а также имеют место в его прогнозировании [6].
В результате проведенного исследования были выявлены особенности инициации (ка-спаза-9) и терминации (каспаза-3) апоптоза
Сравнительная характеристика маркирования на каспазу-9 и каспазу-3 при различных формах рака мочевого пузыря (%).
Таблица 1
Каспаза ПКРМП АМП МИУР МНИУР Норма
9 25.1±0.2 68.2±0.3 17.4±0.2 64.2±0.5 79.2±0.02
3 75.2±0.1 18.3± 0.3 54.2±0.3 89.1±0.2 92.1±0.1
Рисунок 1. Результаты иммуногистохимического исследования плоскоклеточного рака мочевого пузыря, аденокарциномы, мышечно-инвазивного и неинвазивного уротелиальных раков, докрашивание гематоксилином, увелич. х200. ПКРМП - плоскоклеточный рак мочевого пузыря, АМП - аденокарцинома, МИУР - мышечно-инвазивный уротелиальный рак, МНИУР - неинвазив-
ный уротелиальный рак.
Рисунок 1. Результаты иммуногистохимического исследования плоскоклеточного рака мочевого пузыря, аденокарциномы, мышечно-инвазивного и неинвазивного уротелиальных раков, докрашивание гематоксилином, увелич. х200. ПКРМП - плоскоклеточный рак мочевого пузыря, АМП - аденокарцинома, МИУР - мышечно-инвазивный уротелиальный рак, МНИУР - неинвазив-
ный уротелиальный рак.
при аденокарциноме, плоскоклеточном, мы-шечно-инвазивном и мышечно-неинвазив-ном раках мочевого пузыря у 50 пациентов.
Было обнаружено, что вне зависимости от характера злокачественного опухолевого процесса, в клетках сохраняется продукция каспазы-9 и каспазы-3, однако меняется количество и соотношение этих белков.
При плоскоклеточном и уротелиальном раках мочевого пузыря выявлено значительное снижение доли положительно окрашенных клеток на каспазу-9 по сравнению с нормой, что свидетельствует о нарушении инициации митохондриального пути апоптоза. При этом интенсивность маркирования на каспазу-3 при изучаемых формах рака также снижена, что говорит о наличии нарушений и на стадии тер-минации процесса клеточной гибели. На фоне дисфункции инициации гибели трансформированной клетки сохраняется ее терминальный этап. Можно предположить, что активация каспазного каскада при развитии опухолей из покровного эпителия не является основным путем для запуска запрограммированной клеточной гибели и возможно подавляется другими факторами. Одной из причин таких изменений, на наш взгляд, является преобладание при плоскоклеточном и уротелиальных раках мочевого пузыря рецептор-опосредованного или ЭПР-зависимого путей апоптоза с повышенной продукцией других каспаз (каспа-зы-8 и каспазы-12). Однако данная теория нуждается в дальнейшем изучении (рис. 2).
Мышечно-неинвазивную уротелиаль-ную карциному мочевого пузыря часто лечат местно: трансуретральной резекцией опу-
холи, цистоскопией, или же проводят вну-трипузырную терапию митомицином-С [3; 8]. При этом стоит учитывать, что обнаруженное снижение активности каспазы-3 может обуславливать рецидивы и прогресси-рование опухоли после местного лечения.
На фоне опухолей из железистого эпителия аденокарцинома демонстрирует агрессивность и повышенный потенциал роста. Интересным является тот факт, что в большей части клеток инициирован процесс апоптоза, однако терминальной стадии достигают лишь небольшое их количество. На наш взгляд, это связано с возникновением вторичной мутации раковых атипических клеток в генах, кодирующих промежуточные этапы реализации программы апоп-тоза. Известно, что у большинства пациентов с первичной аденокарциномой мочевого пузыря развивается мышечно-инвазивная форма, поэтому прогноз при лечении аденокарциномы является крайне неблагоприятным [2, 6], что также подтверждено настоящим исследованием. Традиционные схемы химиотерапии, эффективные при уротелиальном раке, по-видимому, принесут малую пользу, поэтому предпочтительной является радикальная цистэктомия с диссекцией тазовых лимфатических узлов [2, 9].
На основании выявленных иммунофеноти-пических характеристик каспазы-9 и каспазы-3 последние можно использовать в качестве онко-маркеров у пациентов с раком мочевого пузыря.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Изменения активности каспазы-3 и ка-спазы-9 в раковых клетках мочевого пузыря свидетельствуют о дисфункции в них про-
Рисунок 2. Схематичное изображение трех основных сигнальных путей апоптоза в анапластической клетке: рецептор-зависимого (опосредованного каспазой-8), митохондриального (опосредовано-го каспазой-9) и индуцированного посредством активации прокаспазы-12 в эндоплазматическом ретикулуме. Из межмембранного пространства митохондрии высвобождаются флавопротеин Д1Р и фермент эндонуклеаза С, которые осуществляют апоптоз независимо от активации каспаз. Сурвивин ингибирует активацию каспаз, таким образом приводя к отрицательной регуляции апоптоза.
цессов апоптоза. Для раковых клеток из уротелия и многослойного плоского эпителия характерен высокий уровень термина-ции апоптоза на фоне сниженной инициации внутреннего пути. Аденокарцинома обладает повышенной агрессивностью из-за угнетения терминального этапа апоптоза.
Прозрачность исследования.
Исследование не имело спонсорской поддержки. Авторы несут полную ответственность за предоставление окончательной версии рукописи в печать.
Декларация о финансовых и других взаимоотношениях.
Все авторы принимали участие в разработке концепции статьи и в написании рукописи. Окончательная версия рукописи одобрена всеми авторами. Авторы не получали гонорар за статью.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Conflict of interest. The authors have no conflict of interests to declare.
ЛИТЕРАТУРА
1. Волкова М.И., Матвеев В.Б., Медведев С.В., Носов Д.А., Фигурин К.М., Хмелевский Е.В., Черняев В.А. Клинические рекомендации по диагностике и лечению больных раком мочевого пузыря. Москва; 2014.
2. «Bladder Cancer Treatment». National Cancer Institute. Archived from the original on 14 July 2017. Retrieved 18 July 2017;101(7):286-98.
3. Kassouf W., Traboulsi S.L., Kulkarni G.S., Breau R.H., Zlotta A., Fairey A., So A., Lacombe L., Rendon R., Aprikian A.G., Siemens D.R., Izawa J.I., Black P. CUA guidelines on the management of non-muscle invasive bladder cancer. Can Urol Assoc J 2015; 9 (9-10): E690-704. DOI: http://dx.doi.org/10.5489/cuaj.3320.
4. Türkolmez K., Tokgoz H., Re§orlu B., Kose K., Bdük Y. Muscle-invasive bladder cancer: predictive factors and prognostic difference between primary and progressive tumors. Urology. 2007 Sep; 70(3): 477-81. DOI: https://doi.org/10.1016/j.urology.2007.05.008.
5. Демяшкин Г.А., Заборский И.Н. Новый подход к диагностике, иммунофенотипической верификации и прогнозу почечной ангиомиолипомы. Уроло-
rua. 2018; 1: 35-41. DOI: https://dx.doi.org/10.18565/ urology.2018.1.35-41.
6. Liu P.F., Hu Y.C., Kang B.H., Tseng Y.K., Wu P.C., Liang C.C., et al. (2017) Expression levels of cleaved caspase-3 and caspase-3 in tumorigenesis and prognosis of oral tongue squamous cell carcinoma. PLoS ONE 12(7): e0180620. DOI: https://doi.org/10.1371/journal. pone.0180620.
7. Jaiswal P.K., Goel A., Mittal R.D. Survivin: A molecular biomarker in cancer. Indian J Med Res. 2015; 141(4):389-97. DOI: 10.4103/0971-5916.159250.
8. Alexandroff A.B., Jackson A.M., O'Donnell M.A., James K. (May 1999). «BCG immunotherapy of bladder cancer: 20 years on». Lancet. 353 (9165):1689-94. DOI: 10.1016/S0140-6736(98)07422-4.
9. Bellmunt J., Orsola A., Leow J. J., Wiegel T., De Santis M., Horwich A. Bladder Cancer: ESMO Clinical Practice Guidelines. Ann Oncol (2014) 25 (suppl 3): 40-48. DOI: 10.1093/annonc/mdu223.
REFERENCES
1. Volkova M.I, Matveev V.B., Medvedev S.V., Nosov D.A., Figurin K.M., Khmelevskij E.V., Chernyaev V.A. Clinical guidelines for the diagnosis and treatment of patients with bladder cancer. Moscow; 2014. (In Russian)
2. «Bladder Cancer Treatment». National Cancer Institute. Archived from the original on 14 July 2017. Retrieved 18 July 2017;101(7):286-98.
3. Kassouf W., Traboulsi S.L., Kulkarni G.S., Breau R.H., Zlotta A., Fairey A., So A., Lacombe L., Rendon R., Aprikian A.G., Siemens D.R., Izawa J.I., Black P. CUA
guidelines on the management of non-muscle invasive bladder cancer. Can Urol Assoc J 2015; 9 (9-10): E690-704. DOI: http://dx.doi.org/10.5489/cuaj.3320
4. Türkölmez K., Tokgöz H., Reçorlu B., Köse K., Bdük Y. Muscle-invasive bladder cancer: predictive factors and prognostic difference between primary and progressive tumors. Urology. 2007 Sep; 70(3): 477-81. DOI: https://doi.org/10.1016/j.urology.2007.05.008.
5. Demyashkin G.A., Zaborskii I.N. New approach to diagnosis, immunophenotypic verification and prognostic prediction for renal angiomyolipoma. Urologiia. 2018; 1: 35-41 (in Russian) DOI: https://dx.doi.org/10.18565/ urology.2018.1.35-41.
6. Liu P.F., Hu Y.C., Kang B.H., Tseng Y.K., Wu P.C., Liang C.C., et al. (2017) Expression levels of cleaved caspase-3 and caspase-3 in tumorigenesis and prognosis of oral tongue squamous cell carcinoma. PLoS ONE 12(7): e0180620. DOI: https://doi.org/10.1371/journal. pone.0180620.
7. Jaiswal P.K., Goel A., Mittal R.D. Survivin: A molecular biomarker in cancer. Indian J Med Res. 2015; 141(4):389-97. DOI: 10.4103/0971-5916.159250.
8. Alexandroff A.B., Jackson A.M., O'Donnell M.A., James K. (May 1999). «BCG immunotherapy of bladder cancer: 20 years on». Lancet. 353 (9165): 1689-94. DOI: 10.1016/S0140-6736(98)07422-4.
9. Bellmunt J., Orsola A., Leow J. J., Wiegel T., De Santis M., Horwich A. Bladder Cancer: ESMO Clinical Practice Guidelines. Ann Oncol (2014) 25 (suppl 3): 40-48. DOI: 10.1093/annonc/mdu223.
