Иммунофенотипическая характеристика эмбриональных маркеров Oct4, Nanog и эндоглина в канцерогенезе уротелиального рака почечной лоханки и мочевого пузыря

Османов Ю.И.; Рапопорт Л.М.; Коган Е.А.; Демяшкин Г.А.; Гаибов Ж.А.; Нугуманов Р.Г.

УДК 616.62-006.6-073

ИММУНОФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЭМБРИОНАЛЬНЫХ МАРКЕРОВ OCT4, NANOG И ЭНДОГЛИНА В КАНЦЕРОГЕНЕЗЕ УРОТЕЛИАЛЬНОГО РАКА ПОЧЕЧНОЙ ЛОХАНКИ И МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ

Османов Ю. И.1,3, Рапопорт Л. М.2, Коган Е. А.1, Демяшкин Г. А.1, Гаибов Ж. А.3, Нугуманов Р. Г.1

'ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), Кафедра патологической анатомии им. академика А.И. Струкова г. Москва, Россия;

2НИИ уронефрологии и репродуктивного здоровья человека им. И.М. Сеченова, г. Москва, Россия; 3Научный Клинический Центр ОАО «Российские Железные Дороги», патологоанатомическое отделение, г. Москва, Россия.

Для корреспонденции: Григорий Александрович Демяшкин, 119048, г. Москва, ул. Трубецкая, д. 8; dr.dga@ mail.ru

For correspondence: Gregory Alex Demyashkin; 119048 Moscow, Trubetskaya street, 8; E-mail: dr.dga@mail.ru Information about authors:

Osmanov Y. I., http://orcid.org/ 0000-0002-7269-4190 Kogan E. A., http://orcid.org/ 0000-0002-1107-3753 Demyashkin G. A., http://orcid.org/0000-0001-8447-2600 Gaibov G. A., http://orcid.org/0000-0002-1174-9098

РЕЗЮМЕ

В настоящее время активно обсуждается роль раковых стволовых клеток в патогенезе уротелиальных карцином, изучение эмбриональных маркеров раковых стволовых клеток NANOG, OCT4 и эндоглина представляет большой интерес, так как открывает большие перспективы в разработке новых подходов к противоопухолевой терапии.

Настоящая работа посвящена сравнительной оценке экспрессии стволовых маркеров в молекулярных подтипах уротелиальных карцином и определение их прогностической значимости. Исследование выполнено на операционном материале от 196 пациентов с уротелиальной карциномой почечной лоханки и мочевого пузыря с использованием иммуногистохимического метода (антитела к NANOG, OCT4 и CD105). Установлено, что использованные маркеры стволовых клеток экспрессировали во всех молекулярных подтипах уротелиальной карциномы и по частоте и интенсивности экспрессии не имели характерные особенности в разных фенотипах. Между тем, частота и интенсивность экспрессии маркеров коррелировали с опухолевой стадией и степенью клеточной анаплазии. Сделан вывод о том, что выявленные иммунофенотипические характеристики раковых стволовых клеток позволят разработать новые подходы к терапии уротелиальных карцином.

Ключевые слова: Уротелиальная карцинома, внутриопухолевая гетерогенность, раковые стволовые клетки, NANOG, OCT4, эндоглин.

FEATURES OF EXPRESSION OFOCT4, NANOG AND ENDOGLIN IN UROTHELIAL CARCINOMAS OF THE RENAL PELVIS AND BLADDER

Osmanov Y. I.1,3, Rapoport L. M.2, Kogan E. A.1, Demyashkin G. A.1, Gaibov G. A.3, Nugumanov R. G.1

1I. M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University), Moscow, Russia

2I. M. Sechenov Research Institute of Uronephrology and Human Reproductive Health, Moscow, Russia

3Clinical Research Centre «Russian Railways», Moscow, Russia

SUMMARY

Currently, the role of cancer stem cells in the pathogenesis of urothelial carcinomas is actively discussed, the studyimg of embryonic markers of cancer stem cells NANOG, OCT4 and endoglin is of great interest, since it opens up great prospects in the development of new approaches to antitumor therapy.

This article is devoted to a comparative assessment of the expression of stem markers in the molecular subtypes of urothelial carcinomas and the determination of their prognostic significance. The study was performed on surgical material of 196 patients with urothelial carcinoma of the renal pelvis and bladder using the immunohistochemical method (antibodies to NANOG, OCT4 and CD105). It was found that the stem cell markers used are expressed in all molecular subtypes of urothelial carcinoma and, according to the frequency and intensity of expression, do not have characteristic features in different phenotypes. Meanwhile, the frequency and intensity of expression of the markers correlated with the stage of the tumor and the degree of cellular anaplasia. It has been concluded that the identified immunophenotypic characteristics of cancer stem cells will allow the development of new approaches to the treatment of urothelial cancer.

Key words: Urothelial carcinoma, intratumoral heterogeneity, cancer stem cells NANOG, OCT4, endoglin.

Раковые стволовые клетки (РСК) - небольшая устойчивая субпопуляция клеток, способных к постоянному самообновлению и диффе-ренцировке. Такие стволовые клетки, которые также известны как опухоль-инициирующие клетки, обладают высокой степенью резистентности и часто выживают после химио- и лучевой терапии. В настоящее время активно обсуждается роль РСК в патогенезе уротели-альных карцином (УК). Изучение свойств РСК и механизмов их регуляции открывает большие перспективы в разработке новых подходов к противоопухолевой терапии. [1; 2; 3; 4]. По данным ряда исследователей среди потенциальных диагностических маркеров раковых стволовых клеток УК большой интерес представляют МЛМОС, ОСТ4 и эндоглин [5; 6].

В норме МЛМОС, как регулятор транскрипции, участвует в пролиферации и самообновлении эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), предотвращая их дифференцировку в сторону внезародышевой эндодермы и трофодермы. МЛМОС самостоятельно или в комбинации с другими маркерами выявляется в РСК гермино-генных опухолей яичника и яичка [7; 8; 9; 10; 11].

ОСТ4 - схожий с МЛМОС транскрипционный фактор, отвечающий за контроль пролиферации ЭСК. Позитивная экспрессия ОСТ4 обнаруживается в РСК герминогенных опухолей яичника и яичка, интракраниальных дисгермином, плоскоклеточного рака пищевода, а также мелкоклеточной карциномы лёгкого [12; 13; 14; 15].

Эндоглин (СБ105), являющийся регуля-торным компонентом ТСБ-Р рецепторного комплекса, в норме контролирует клеточный ответ на ТСБ-р1. Мутация этого гена вызывает наследственную геморрагическую телеангиоэктазию I типа. Интенсивность экспрессии этого маркера увеличивается при ряде лимфопролиферативных заболеваний, карциноме молочной железы, яичника, эндометрия, желудка и др. [16; 17; 18; 19; 20].

Цель: сравнительная оценка экспрессии стволовых маркеров МЛМОС, ОСТ4 и СБ105 в молекулярных подтипах УК и определение их прогностической значимости.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Исследование архивного биопсийного материала проводили у пациентов (п=99; мужчины - 62, женщины - 37; средний возраст - 66,9 года), находившихся на хирургическом лечении в НИИ Уронефрологии и репродуктивного здоровья им. И.М. Сеченова и Урологическом центре ЦКБ №1 филиала НКЦ ОАО РЖД по поводу уротелиального рака почечной лоханки в период с 2011 по 2017 гг. В качестве группы сравнения

изучали биоптаты 97 пациентов (65 мужчин и 32 женщины) в возрасте от 33 до 84 лет (средний возраст 65,4 года) с уротелиальным раком мочевого пузыря, проходивших лечение в Урологическом центре НКЦ ОАО РЖД с 2010 по 2017 гг.

Все новообразования распределяли по соответствующим группам на основании гистологической классификации опухолей мочевы-делительной системы (ВОЗ, 2016) [21]. Степень клеточной анаплазии (G) оценивали по шкале от 1 до 4 по L. Cheng и соавт. [22]. Уровень инвазии (рТа - Т4) определяли согласно протоколу 7-го издания TNM-классификации опухолей мочевыделительной системы (МВС) [23].

Морфологическое исследование. Фрагменты тканей фиксировали в формалине по Лилли, заливали в парафин и окрашивали гематоксилином и эозином по стандартной методике.

Иммуногистохимическое исследование (ИГХ). В качестве первичных использовали кроличьи антитела к NANOG (ab80892, Abcam), OCT4 (ab18976, Abcam) и мышиные к CD105 (SN6h, Invitrogen). Долю иммунопозитивных клеток (в %) подсчитывали в 10 полях зрения при увелич. х400: слабая (1 - 10% клеток), умеренная (11 - 50% клеток), выраженная (>51% клеток) реакция (по J. Rajcani и соавт. [3, 13]).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

При ИГХ-исследовании в группе неинвазив-ных поверхностных папиллярных УК (НПУК) была выявлена положительная экспрессия маркеров СК - NANOG и OCT4. Слабая и умеренно-позитивная экспрессия OCT4 в группе НПУК базального фенотипа обнаружили в 19 случаях (10%). Из них в 11 новообразованиях наблюдали слабую, а в 7 - умеренную интенсивность реакции. Лишь в 1 опухоли с базальным фенотипом визуализировали выраженно-пози-тивное декорирование на OCT4. В 8 образцах опухолевые клетки с люминальным фенотипом позитивно реагировали на OCT4 в диапазоне слабой интенсивности. Положительную реакцию на NANOG обнаружили в 17 (9%) и 16 (8%) НПУК базального и люминального фенотипов в слабом и умеренном диапазоне.

Экспрессия OCT4 в мышечно-неинвазив-ных уротелиальных карциномах (МНУК) ба-зального фенотипа обнаружена в 3 случаях (1,5%). Из них только в 1 наблюдении визуализировали умеренно-позитивную интенсивность реакции, а в остальных определена слабая реакция. Из 8 OCT4-положительных люминаль-ных МНУК только в 2 случаях выявлена умеренно-позитивная интенсивность. В остальных 6 опухолях обнаружили слабую реакцию.

Слабую и умеренно-позитивную экспрессию МЛМОС визуализировали в 11 (6%) новообразованиях. Преобладали опухоли с лю-минальным фенотипом (п=8; 4%). Из них в 3 наблюдениях интенсивность реакции соответствовала умеренной. В остальных 3 МНУК с базальным фенотипом так же была выявлена умеренно-позитивная реакция. Интенсивность реакции в остальных опухолях была слабой.

Во всех классических уротелиальных карциномах (КИУК) базального фенотипа обнаружили слабую реакцию на ОСТ4. В 14 КИУК с люминальным фенотипом экспрессия ОСТ4 проходила в сильно-позитивном диапазоне, а в 16 наблюдениях выявлена умеренно-позитивная экспрессия. В 1 случае более 75% клеток положительно реагировали на ОСТ4. В 11 опухолях - отрицательная экспрессия ОСТ4. Все КИУК с базальным фенотипом экспрессировали МЛМОС в сильно-позитивном диапазоне. Среди МЛМОС-положительных люминальных КИУК преобладали опухоли в умеренно-позитивном диапазоне (п=24;12%). В 10 случаях экспрессия МЛМОС соответствовала диапазону выраженной интенсивности. В 3 наблюдениях обнаружили

выраженно-позитивную реакцию, а в 9 наблюдалась слабая экспрессия. Позитивную реакцию на ОСТ4 обнаружили в 23 (12%) неклассических УК (НКИУК) базального фенотипа. Преобладали опухоли в диапазоне умеренно-позитивной интенсивности (п=11; 6%). По 6 случаев выявлена сильно-позитивная и слабая реакции. Из 46 НКИУК с люминальным фенотипом в 11 опухолях реакция на ОСТ4 была негативной. В 21 случае интенсивность экспрессии соответствовала умеренному диапазону, а в 11 новообразованиях отмечалась сильно-позитивная реакция. Слабая реакция на маркер обнаружена в 3 наблюдениях. Все НКИУК базального фенотипа экспрессировали МЛМОС. Преобладали опухоли в выраженном диапазоне (п=19; 10%). В 7 карциномах определялось умеренно-позитивная реакция, а в 2 она была слабой. В 1 случае более 75 % опухолевых клеток экспрессировали МЛМОС. Среди люминальных НКИУК также преобладали опухоли диапазона выраженной интенсивности (п=23;12%). В 15 опухолях отмечали умеренно-позитивную реакцию, а по 2 случая выявлена слабая и выраженно-пози-тивная экспрессия МЛМОС (табл. 1) (рис. 1).

Таблица 1

Интенсивность стволовых маркеров в поверхностных и мышечно-инвазивных УК люминального и

базального фенотипов

Молекулярный профиль

НПУК-Б НПУК-Л МНУК-Б МНУК-Л КИУК-Б КИУК-Л НКИУК-Б НКИУК-Л

0/ 7 0/ 7 0/ 3 0/ 5 0/ 0 0/ 11 0/ 6 0/ 11

1/ 11 1/ 8 1/ 2 1/ 6 1/ 2 1/ 7 1/ 6 1/ 3

OCT4 2/ 7 2/ 8 2/ 1 2/ 2 2/ 0 2/ 16 2/ 11 2/ 21

3/ 1 3/ 0 3/ 0 3/ 0 3/ " 3/ 14 3/ 6 3/ 11

4/ 0 4/ " 4/ " 4/ " 4/ " 4/ 1 4/ 0 4/ 0

0/ 9 0/ 7 0/ 3 0/ 5 0/ 0 0/ 3 0/ 0 0/ 4

1/ 13 1/ 11 1/ 1 1/ 5 1/ " 1/ 9 1/ 2 1/ 2

NANOG 2/ 4 2/ 5 2/ 2 2/ 3 2/ " 2/ 24 2/ 7 2/ 15

3/ 0 3/ 0 3/ 0 3/ 0 3/ 2 3/ 10 3/ 19 3/ 23

4/ " 4/ " 4/ " 4/ " 4/ 0 4/ 3 4/ 1 4/ 2

всего 26 23 6 13 2 49 29 46

Примечание. НПУК-Б и Л - неинвазивная папиллярная УК базального и люминального фенотипов; МНУК-Б и Л - мышечно-неинвазивная УК базального и люминального фенотипов; КИУК-Б и Л - классическая УК базального и люминального фенотипов; НКИУК-Б и Л-неклассическая УК базального и люминального фенотипов.

Полученные результаты показывают, что использованные в исследовании маркеры СК -МЛМОС и ОСТ4 экспрессируют во всех молекулярных подтипах УК и по частоте и интенсивности экспрессии не обладают характерными особенностями в разных фенотипах (рис.1, 2). Между тем, при распределении УК по стадиям и степени клеточной анаплазии выявлено, что

позитивная реакция на ОСТ4 обнаруживается в 35 (18%) опухолях в стадии рТа. УК преобладали на стадии рТ2 (п=49; 25%). В 9 (5%) случаях опухолевая стадия соответствовала рТ4. В 40 (21%) новообразованиях выявлена стадия рТ3, а в 11 (6%) - рТ1. Среди ОСТ4-позитивных карцином в 9 (5%) случаях обнаружены опухоли низкой степени клеточной анаплазии (С1).

В 71 (36%) и 17 (8%) случаях степень анаплазии оценена как С3 и С4 соответственно. В 47 (24%) пациентах опухолевая ткань состояла из клеточной популяции с умеренной анаплазией (С2).

Экспрессия КАМОС в опухолях в стадии рТа наблюдалась в 33 (17%) случаях. Преобладали опухоли в стадии рТ2 (п=58; 30%). В 53 (27%) МЛМОС-позитивных новообразованиях опухоль соответствовала стадии рТ3. В 8 (4%) и 11 (6%) наблюдениях карциномы распределились в стадиях рТ4 и рТ1 соответственно. В опухолях,

экспрессирующих КАМОС, в 11 (6%) случаях степень клеточной анаплазии определена как С1, а в 60 (31%) опухолях как С2. В 76 (39%) УК степень клеточной анаплазии соответствовала С3, а в 16 (8%) наблюдениях - С4 (табл. 2). Интенсивность экспрессии исследуемых маркеров так же имела свои особенности. Так, было определено, что в УК независимо от молекулярного фенотипа имеется тенденция усиления интенсивности экспрессии ОСТ4 и КАМОС по мере увеличения стадии и степени клеточной анаплазии. (рис. 1).

Рисунок 1. Интенсивность экспрессии ЫДЫОС и ОСТ4 в поверхностных и мышечно-инвазивных УК, иммуногистохимические реакции, докрашивание - гематоксилином, увелич. х200.

Таким образом, при интерпретации полученных результатов обнаружена прямая и обратная корреляционные связи между частотой и интенсивностью маркеров СК с опухолевой стадией и степенью клеточной анаплазии.

Сравнительная характеристика экспрессии эндотелиального маркера СБ105, являющегося, в том числе идентификатором гемопоэтических прогениторных клеток по-

казала, что он является наиболее чувствительным белком для определения опухолевого прогресса в УК. В нашем исследовании было выявлено существенное отличие значений микроваскулярной плотности (МВП) в поверхностных УК на СБ105 (в опухолях рТа - 9.7, а для рТ1 - 23.1). Схожая ситуация наблюдалась и в мышечно-инвазивных УК (рТ2 - 37.0; рТ3 - 47.2; рТ4 - 59.4) (рис.2).

Таблица 2

Интенсивность экспрессии маркеров стволовых клеток в уротелиальных карциномах в зависимости от опухолевой стадии и степени клеточной анаплазии

Стадия N % OCT4, NANOG

4 3 2 1 0

pTa (П=49) 0 1,0 2,0 15,9 31,18 19,24 39,49 14,16 28,33

pT1 (П=19) 0 0 3,5 16,26 8,6 42,31 8,8 42,42

pT2 (П=64) 0,3 0,5 6,26 9,41 27,24 42,37 16,5 25,8 15,6 23,9

pT3 (П=53) 1,2 2,4 16,23 30,43 21,20 40,38 2,8 4,15 13,0 24,0

pT4 (П=9) 0,1 0,11 9,5 100,55 0,2 0,22 0 0,1 0,11

Всего 194

Степень анаплазии N % OCT4, NANOG

4 3 2 1 0

G1 (П=20) 0 0 0 7,3 35,15 2,8 10,40 11,9 55,45

G2 (П=68) 0,2 0,3 7,21 10,31 18,21 26,31 22,16 32,23 21,8 31,12

G3 (П=88) 1,1 1,1 13,26 15,29 37,31 42,35 20,18 23,20 17,12 19,14

G4 (П=18) 0,3 0,17 12,7 67,39 4,5 22,28 1,1 5,5 1,2 5,11

Всего 194

рТа

>рТ2

СБ105

Рисунок 2. Интенсивность экспрессии эндотелиального маркера С0105 в поверхностных и мышечно-инвазивных УК, иммуногистохимические реакции, докрашивание - гематоксилином, увелич.х200.

же время, в инвазивных опухолях отмечается тенденция усиления частоты и интенсивности 1. В большинстве случаев в УК обнару- экспрессии ОСТ4 и МЛМОС по мере увеличе-живается коэкспрессия ОСТ4 и МЛМОС. В то ния стадии и степени клеточной анаплазии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

2. CD 105 является наиболее панэндоте-лиальным предиктором опухолевого ангиоге-неза и преметастатической стволовой раковой ниши. Нами было установлено, что по мере увеличения стадии и степени клеточной ана-плазии доля CD105-положительных сосудистых структур пропорционально возрастает.

ЛИТЕРАТУРА

1. Liu P., Liao J., Tang Z., Wu W., Yang J., Zeng Z., Hu Y., Wang P., Ju H., Xu R. Metabolic regulation of cancer cell side population by glucose through activation of the Akt pathway. Cell Death & Differentiation. 2014;21:124-35. doi: 10.1038/cdd.2013.131.

2. Gammon L., Biddle A., Heywood H.K., Johannessen A.C., Mackenzie I.C. Sub-sets of cancer stem cells differ intrinsically in their patterns of oxygen metabolism. PLOS One. 2013;8:e62493. doi.org/10.1371/ journal.pone.0062493

3. Rajcani J., Kajo K., Adamkov M., Moravekova E., Lauko L., Felcanova D., Bencat M. Immunohistochemical characterization of urothelial carcinoma. Bratislava Medical Journal. 2013;114(8):431-438

4. Yamanaka S. A fresh look at iPS cells. Cell. 2009; 137:13-17. doi: 10.1016/j.cell.2009.03.034

5. Asar A., Gabal S., Noha H. Immunohistochemical study of the expression of Oct-4 in bladder urothelial carcinoma. Kasr Al Ainy Medical Journal. 2017;23:141-147. doi: 10.4103/kamj.kamj_29_17

6. Morrison S.J., Spradling A.C. Stem cells and niches: mechanisms that promote stem cell maintenance throughout life. Cell. 2008;132:598-611. doi: 10.1016/j. cell.2008.01.038.

7. Hough S.R., Clements I., Welch P.J., Wiederholt K.A. Differentiation of mouse embryonic stem cells after RNA interference-mediated silencing of OCT4 and Nanog. Stem Cells 2006;24:1467-1475. doi: 10.1634/ stemcells.2005-047

8. Darr H, Mayshar Y, Benvenisty N. Overexpression of NANOG in human ES cells enables feeder-free growth while inducing primitive ectoderm features. Development 2006;133:1193-1201. doi: 10.1242/dev. 02286

9. Chambers I., Colby D., Robertson M., Lee S., Tweedie S., Smith A. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell 2003;113:643-655 PMID: 12787505

10. Inamura K. Bladder Cancer: New Insights into Its Molecular Pathology. Cancers (Basel). 2018 Apr; 10(4):100. doi: 10.3390/cancers10040100.

11. Palorini R., Votta G., Balestrieri C., Monestiroli A., Olivieri S., Vento R., Chiaradonna F. Energy metabolism characterization of a novel cancer stem cell-like line 3AB-OS. Journal of Cellular Biochemistry. 2014;115:368-79. doi: 10.1002/jcb.24671.

12. Gifford C.A., Meissner A. Epigenetic obstacles encountered by transcription factors: reprogramming against all odds. Current Opinion in Genetics &

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Development. 2012;22:409-415. doi: 10.1016/j. gde.2012.08.002.

13. Yasuyoshi M., Yuji S., Shin-ichi W. CD105 is a more appropriate marker for evaluating angiogenesis in urothelial cancer of the upper urinary tract than CD31 or CD34. Virchows Archive. 2013;463(5): 673-679. doi: 10.1007/s00428-013-1463-8.

14. Oh J.H., Do H.J., Yang H.M., Moon S.Y., Cha K.Y., Chung H.M., Kim J.H. Identification of a putative transactivation domain in human Nanog. Exp Cell Res 2005;37:250-254. doi: 10.1038/emm.2005.33

15. Sharma S.V., Lee D.Y., Li B., Quinlan M.P., Takahashi F., Maheswaran S., McDermott U., Azizian N., Zou L., Fischbach M.A., Wong K.K., Brandstetter K., Wittner B., Ramaswamy S., Classon M., Settleman J. A. Chromatin-mediated reversible drug-tolerant state in cancer cell subpopulations. Cell. 2010;141:69-80. doi: 10.1016/j.cell.2010.02.027

16. Gonzalez R., Griparic L., Vargas V., Burgee K., Santacruz P., Anderson R., Schiewe M., Silva F., Patel A. A putative mesenchymal stem cells population isolated from adult human testes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 2009;385:570-575. doi: 10.1016/j.bbrc.2009.05.103.

17. Dominici M., Le Blanc K., Mueller I., Slaper-Cortenbach I., Marini F., Krause D., Deans R., Keating A., Prockop D.J., Horwitz E. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 2006;8:315-317. doi: 10.1080/14653240600855905.

18. Helmy K.Y., Patel S.A., Silverio K., Pliner L., Rameshwar P. Stem cells and regenerative medicine: accomplishments to date and future promise. Therapeutic Delivery. 2010;1:693-705. doi: 10.4155/tde.10.57.

19. Niwa H., Miyazaki J., Smith A.G. Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells. Nature Genetics. 2000;24:372-376. doi: 10.1038/74199

20. Khairul M., Akhir A. Immunohistochemical expression of NANOG in urothelial carcinoma of the bladder. Malaysian Journal of Pathology. 2017; 39(3): 227 - 234.

21. Kundrotas G. Surface markers distinguishing mesenchymal stem cells from fibroblasts. Acta Medica Lituanica. 2012;19:75-79. doi: 10.6001/actamedica. v19i2.2313

22. Cheng L., Lopez-Beltran A., Bostwick D.G. Bladder pathology. Hoboken, N.J.: Wiley-Blackwell; 2012;161-283.

23. Cheng L., Montironi R., Davidson D.D., Lopez-Beltran A. Staging and reporting of urothelial carcinoma of the urinary bladder. Modern Pathology. 2009;22(Suppl.2): S70-S95. https://doi.org/10.1038/modpathol.2009.

24. Inamura K. Bladder Cancer: New Insights into Its Molecular Pathology. Cancers (Basel). 2018 Apr; 10(4):100. doi: 10.3390/cancers10040100.

REFERENCES