CC BY
16УДК 612.112.94.017.1.014.46
П.Ф. Забродский2, В.Ф. Киричук1, В.Г. Лим1, И.Х. Яфарова1
МОДУЛЯЦИЯ АНТИДОТАМИ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ ИММУННЫХ РЕАКЦИЙ И СИНТЕЗА ЦИТОКИНОВ, СВЯЗАННЫХ С
функцией гаь, га2-ЛИМФОЦИТОВ
Саратовский государственный медицинский университет 2Саратовский военный институт химической и биологической безопасности
Минобороны России
В экспериментах на крысах линии Wistar установлено, что при остром отравлении фосфорорганически-ми соединениями в дозе 1,0 DL50 (веществом УХ, метафосом) в продуктивной фазе иммуногенеза супрессия иммунных реакций и снижение концентрации в крови цитокинов (ИФН-у, ИЛ-4) с уменьшением соотношения ИФН-у/ИЛ-4 свидетельствует о том, что редукция функции ТЫ-лимфоцитов по сравнению с ТЪ2-клетками более выражена. Атропина сульфат (однократно, 10 мг/кг) увеличивал снижение активности ТЫ- и ТИ2-лимфоцитов и синтеза ими цитокинов в равной степени, а карбоксим (однократно, 10 мг/кг) частично восстанавливал преимущественно активность ТЫ-клеток и синтез ИФН-у.
Ключевые слова: фосфорорганические соединения, антидоты, иммунотоксичность, ТЫ, П2-лимфоциты, цитокины.
Введение. Широкое использование фосфор-органических соединений (ФОС) в сельском хозяйстве и быту может приводить к загрязнению окружающей среды, вызывать острые, по-дострые и хронические интоксикации [2, 3, 15]. Отравления могут вызывать также ФОС и различные антихолинэстеразные соединения (обладающие практически такой же токсикоди-намикой, как ФОС), используемые в медицине. Кроме того, в настоящее время химическое оружие (ХО) на основе фосфорорганических веществ — ФОВ (российского УХ, зарина, зома-на) уничтожаются согласно Конвенции о запрещении разработки, производства, накопления и применения ХО и его уничтожении [1, 2, 4]. При этом не исключена возможность возникновения аварийных ситуаций в процессе уничтожения ХО, в частности, ФОВ, которые могут приводить к заражению почвы, воздуха, воды, к поражению персонала химических объектов и населения прилегающих территорий. Существует вероятность использования ФОВ в террористических и криминальных целях [4, 12].
В настоящее время за рубежом активно ведутся разработки высокоэффективных антидотных средств при поражении ФОВ [8, 11, 13], анализируются их отдаленные эффекты [12].
Модуляция нарушений функции иммунной системы, в частности, синтеза Т-клетками ци-токинов при отравлении ФОВ их антидотами не исследована. Известно, антидоты при поражении ФОВ могут как уменьшать, так и усиливать их иммунотоксические эффекты [2]. Существует
необходимость оценки комбинированного действия средств специфической терапии при поражении ФОВ на иммунные реакции и продукцию ТЫ- и ТИ2-лимфоцитами цитокинов с целью обоснования необходимости фармакологической коррекции постинтоксикационных нарушений иммунного гомеостаза [2].
Целью исследования являлась оценка острого действия ФОС в условиях применения антидот-ных средств (м-холиноблокатора атропина сульфата и реактиватора холинэстеразы карбоксима) на иммунные реакции, связанные с функцией ТЫ- и ТИ2-лимфоцитов, а также на синтез продуцируемых этими клетками цитокинов (соответственно ИФН-у и ИЛ-4).
Материал и методы исследования. Опыты проводили на крысах линии Wistar обоего пола массой 180—240 г. ФОС (российский УХ и ме-тафос) применяли в дозе 1,0 DL50 через 3-е сут после иммунизации крыс эритроцитами барана — ЭБ (2-108 клеток), то есть в продуктивной фазе иммуногенеза. DL50 УХ и метафоса при подкожном введении составляли соответственно 0,018+0,004 и 25,3±2,6 мг/кг. Атропина сульфат (10 мг/кг), карбоксим (10 мг/кг) вводили однократно через 5—10 мин после введения ФОС. Показатели системы иммунитета оценивали общепринятыми методами в экспериментальной иммунотоксикологии [2, 5]. Функцию ТЫ-лимфоцитов оценивали по гуморальной иммунной реакции к тимусзависимому антигену (числу антителообразующих клеток к ЭБ в селезенке, синтезирующих ^М) через 5 сут по-
сле иммунизации ЭБ [5], а также по реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ). Формирование ГЗТ, исследовали у животных по приросту (в %) массы стопы задней лапы. Разрешающую дозу ЭБ (5-108) вводили под апоневроз стопы задней лапы на 4 сут. Реакцию ГЗТ определяли через 1 сут. Функцию ТИ2-лимфоцитов оценивали на 8 сут по числу АОК к ЭБ в селезенке методом непрямого локального гемолиза в геле, характеризующим синтез IgG [5, 14].
Концентрацию цитокинов ИФН-у и ИЛ-4, которые синтезируют соответственно Th1-и ^2-лимфоцитов [6, 9], определяли в плазме крови крыс на 5 и 8 сут после первой инъекции ФОС методом ферментного иммуносорбентного анализа (ELISA) [5], используя наборы (ELISA Kits) фирмы BioSource Int. Полученные данные обрабатывали статистически с использованием t-критерия достоверности Стьюдента.
Результаты и обсуждение. Под влиянием VX и метафоса (табл. 1) происходило снижение гуморального иммунного ответа к Т-зависимо-му антигену (по числу АОК к ЭБ в селезенке), характеризующему функцию Th1-лимфоцитов и синтез IgM, через 4 сут после иммунизации по сравнению с контрольным уровнем соответственно в 2,24 и 1,88 раза (p < 0,05). При отравлении VX и метафосом отмечали также существенную редукцию активности Th1-лимфоцитов, оцениваемую по реакции ГЗТ, соответственно в 1,78 и 1,54 раза (p < 0,05). На 8-е сут после иммунизации ЭБ отмечалась супрессия продукции IgG (по числу АОК в селезенке), отражающая преимущественно функцию Th2-лимфоцитов, после интоксикации VX и метафосом соответственно в 1,37 и 1,34 раза (p < 0,05). Параметры, характеризующие клеточную гуморальную иммунные реакции и связанную
с ними функцию ТЫ- и ТИ2-лимфоцитов, при действии ФОС в среднем снижались соответственно в 1,86 и 1,35 раза. Это свидетельствует о том, что под влиянием антихолинэстеразных ядов в большей степени поражается функция ТЫ-лимфоцитов.
Применение антидота ФОС атропина сульфата при отравлении "УХ существенно увеличивало супрессирующее действие антихолинэс-теразного токсиканта на функцию ТЫ- и ТИ2-лимфоцитов (р < 0,05). Карбоксим снижал редукцию активности ТЫ-клеток (р < 0,05) и практически полностью восстанавливал активность параметров, связанных с функцией ТИ2-лимфоцитов. Под влиянием карбокси-ма показатели, характеризующие функцию ТЫ-лимфоцитов, оставались статистически значимо меньшими, чем в контроле (р < 0,05).
Следует отметить, что при оценке влияния ФОС на функцию ТЫ- и ТИ2-клеток, мы не принимали во внимание действие ФОС на В-клетки (плазмоциты) при оценке числа АОК к ЭБ на 5 и 8-е сут после иммунизации, так как это практически не повлияло бы на полученные нами данные о сравнительной активности двух типов ТИ-лимфоцитов.
Правомерность нашего подхода, свидетельствующего о существенном различии в редукции активности ТИ1- и ТИ2-лимфоцитов при интоксикации ФОС, подтверждается оценкой концентрации цитокинов в крови крыс (табл. 2). При остром отравлении УХ и мета-фосом в продуктивной фазе иммуногенеза выявлено уменьшение концентрации ИФН-у на 5-е сут после иммунизации ЭБ в 2,23 и 1,95 раза (р < 0,05), а ИЛ-4 - в 1,59 и 1,52 раза (р < 0,05) соответственно. Аналогичные данные получены при исследовании концентрации цито-
Таблица 1
Влияние интоксикации ФОС (1,0 DL50) в продуктивной фазе иммуногенеза
на функцию Th1- и Th2- лимфоцитов ^±m, n = 8-9
Серия опытов Функция 1Ъ1-лимфоцитов Функция 1Ъ2-лимфоцитов
число АОК к ЭБ, 103 прирост массы стопы,% АОК к ЭБ, 103
Контроль 43,1±3,5 39,1±3,2 18,2±1,7
VX 19,2±2,0* 22,0±1,9* 13,3±1,2*
Метафос 22,9±2,4* 25,4±2,3* 13,6±1,3*
VX + атропин 13,5±1,5** 16,2±1,7** 9,3±1,1**
VX + карбоксим 29,8±3,0** 22,4±2,3** 15,0±1,6
Примечание: * — р < 0,05 по сравнению с контролем, ** — р < 0,05 по сравнению с контролем и показателем при интоксикации ФОС
Таблица 2
Влияние интоксикации ФОС (1,0 DL50) в продуктивной фазе иммуногенеза на содержание цитокинов в плазме крови крыс, пг/мл (М±m, п = 6)
Серия опытов ИФН-у ИЛ-4 ИФНу/ИЛ-4
Контроль t 902+82 129+12 6,99+0,64
VX 5 405+49* 81+8* 5,00+0,56*
8 367+45* 78+7* 4,70+0,50*
Метафос 5 463+42* 85+9* 5,44+0,53
8 409+46* 83+7* 4,93+0,48*
VX + атропин 5 236+34** 42+6** 5,62+0,80
8 227+30** 39+5** 5,82+0,75
VX + карбоксим 5 660+60** 95+8* 6,95+0,61*
8 671+62** 97+9* 6,92+0,64*
Примечание: t — 5, 8 — время исследования после иммунизации, сут; * — р < 0,05 по сравнению с контролем, ** — р < 0,05 по сравнению с контролем и параметрами при интоксикации ФОС, # — р < 0,05 по сравнению с параметрами при интоксикации ФОС
кинов в крови на 8-е сут. Это свидетельствуют о том, что по сравнению с ИЛ-4 концентрация ИФН-у в крови под влиянием ФОС снижается в большей степени.
Применение атропина сульфата при отравлении УХ существенно увеличивало редуцирующий эффект ФОВ в равной степени на секрецию ТЫ- и ТИ2-лимфоцитами соответственно ИФН-у и ИЛ-4 (р < 0,05). Назначение реак-тиватора холинэстеразы карбоксима снижало супрессию продукции ИФН-у и ИЛ-4 (р < 0,05), обусловленную действием ФОВ. При этом концентрация ИФН-у увеличивалась по сравнению с показателями после отравления ФОВ (р < 0,05), оставаясь ниже контрольного уровня (р < 0,05), а содержание в крови ИЛ-4 оставалось достоверно сниженным по сравнению с контролем (р < 0,05) и статистически значимо не отличалось от параметров после интоксикации УХ. Использование атропина сульфата не изменяло соотношения ИФН-у/ИЛ-4, а карбоксима — восстанавливало его до контрольного значения.
Уменьшение соотношения ИФН-у/ИЛ-4 характеризует снижение функциональной активности лимфоцитов ТЫ-типа по сравнению с функцией ТИ2-клеток [5,6]. Нами установлено, что при действии УХ и метафоса соотношение ИФН-у/ИЛ-4 было существенно ниже контрольного уровня (р < 0,05) равного 6,99+0,64 и составляло в среднем 5,02+0,26 (при оценке на 5 и 8-е сут). Это свидетельствует о более выра-
женной супрессии под влиянием ФОС функции ТЫ-лимфоцитов по сравнению со снижением активности ТИ2-клеток. Вероятно, данный эффект обусловлен способностью ФОС активировать гипоталамо-гипофизарно-адреналовую систему, увеличивая в крови концентрацию кор-тикостерона [2, 3]. При этом известно, что данный гормон в большей степени снижает функцию лимфоцитов ТЫ-типа по сравнению с ТИ2-лимфоцитами [5]. Возможно также, что ФОС способны ингибировать в большей степени аце-тилхолинэстеразу на клеточной мембране лимфоцитов ТЫ-типа и а-нафтил-А8-ацетатэсте-разу и а-нафтилбутиратэстеразу в цитозоле этих клеток, а также большей ролью эстераз в реализации функций лимфоцитов ТЫ-типа [2]. Последнее предположение в определенной степени подтверждается способностью карбокси-ма в большей степени восстанавливать функцию ТЫ-клеток (по сравнению с активностью ТИ2-лимфоцитов), так как среднее значение соотношения ИФН-у/ИЛ-4 существенно возрастало (р < 0,05) с 5,02+0,26 (действие ФОС) до 6,94+0,44 (комбинированный эффект ФОС и карбоксима).
Увеличение редукции функции Т-кле-ток, участвующих в реализации различных иммунных реакций, атропином после отравления ФОС обусловлено суммацией супрессор-ных эффектов, связанных с ингибированием эс-тераз Т-лимфоцитов и одновременной блокадой м-холинорецепторов ТЫ- и ТИ2-клеток [2].
Карбоксим восстанавливает активность лимфоцитов ТИ1- и ТИ2-типа, вероятно, вследствие реактивации ацетилхолинэстеразы, локализованной на их клеточной мембране [10].
Полученные данные позволяют полагать, что относительное увеличение активности ТИ2-лимфоцитов по сравнению с функцией ТИ1-клеток при отравлении ФОС (а также при лечении отравления ФОС атропином) может приводить к увеличению вероятности вирус-ных инфекций (по сравнению с микробными) [5, 7, 9], а при использовании карбоксима возможность возникновения вирусных и микробных инфекционных заболеваний, по-видимому, одинакова.
Выводы. 1. Острое действие ФОС (УХ и ме-тафоса) в продуктивной фазе иммуногенеза в дозе, составляющей 1,0 DL50, в большей степени снижает иммунные реакции, связанные с функцией ТИ1-лимфоцитов по сравнению с иммунным ответом, обусловленным активацией ТИ2-клеток.
2. Под влиянием ФОС в крови концентрация ИФН-у, продуцируемого ТИ1-лимфоцитами, снижается в большей степени, чем концентрация ИЛ-4, синтезируемого ТИ2-клетками.
3. Применение атропина сульфата (однократно в дозе 10 мг/кг) при острой интоксикации ФОС (1,0 DL50) увеличивало супрессию функции ТИ1- и ТИ2-лимфоцитов и синтеза ими соответственно ИФН-у и ИЛ-4 в равной степени, а использование карбоксима (однократно, 10 мг/кг) частично восстанавливало преимущественно активность ТЫ-клеток и синтез ИФН-у по сравнению с функцией ТИ2-лимфоцитов и продукцией ими ИЛ-4.
Список литературы
1. Жуков В.Е., Клаучек В.В., Шкодич П.Е. // Токсикол. вестник, 2002.- № 5. — С. 31-35.
2. Забродский П.Ф., Мандыч В.Г. Иммуноток-сикология ксенобиотиков. — Саратов: СВИБХБ, 2007. — 420с.
3. Общая токсикология / Под ред. Б.А. Курлянд-ского, В.А. Филова. — М.: Медицина, 2002. — 608 с.
4. Петров А.Н., Софронов Г.А., Нечипорен-ко С.П. и др. //Рос. хим. ж., 2004. — Т. XLVIII. — № 2. — С. 110-116.
5. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология /Пер. с англ. — М.: Мир, 2000. — 582 с.
6. Сухих Г.Т., Касабулатов Н.М., ВанькоЛ.В. и др. //Бюл. эксперим. биол. и мед., 2005. — Т. 140. — № 12. — С. 622-624.
7. Хаитов Р.М., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология. — 2-е изд., перераб. и доп. — М.: Медицина, 2002. — 536 с.
8. Amitai G., Adam R., Fishbein E. et al. // J. Appl. Toxicol., 2006. — V 26. — № 1. — P. 81-87.
9. Asquith B., Zhang Y., Mosley A.J. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2007. — V 104. — № 19. — P. 8035-8040.
10. Kutty K.M., Chandra K., Chandra S. // Expe-rientia, 1976. — V. 32. — № 3. — P. 289.
11. Lenz D.E., Maxwell D.M., Korlovich I. et al. // Chem. Biol. Interact., 2005. — V. 157—158. — P. 205210.
12. Sharp D. Long-term effects of sarin // Lancet, 2006. — V. 14. — № 367 (9505). — P. 95-97.
13. Shin T.M., Kan R.K., McDonough J.H. // Chem. Biol. Interact., 2005. — V. 157—158. — P. 293303.
14. SmialowiczR.J., LuebkeR.W., RiddleM.M.// Toxicoliogy, 1992. — V. 75. — № 5. — P. 235-247.
15. Tremolada P., Finizio A., Villa S. et al. // Aqat. Toxicol., 2004. — V 67. — № 1. — P. 87-103.
Переработанный экземпляр статьи поступил в редакцию 06.03.09.
P.F. Zabrodskii2, V.F. Kirichuk1, V.G. Lim1, I.Kh. Yafarova1
MODULATION OF ORGANOPHOSPHORUS COMPOUNDS BY ANTIDOTES IN IMMUNE RESPONSES AND SYNTHESIS OF CYTOKINS ASSOCIATED WITH FUNCTIONING OF TH1-, TH2-LYMPHOCYTES
1Saratov State Medical University 2Saratov Military Institute of Chemical and Biological Safety
It was established in experiments on Wistar rats that at acute poisoning by a LD50 single dose of organophosphorus compounds (agent VX, metaphos) in the productive phase of immunogenesis, the suppression of immune responses and reduced concentration of cytokins (IFNy, IL-4) in blood together with decreasing correlation of IFN-y, and IL-4 showed that the reduced function of Thl-lymphocytes as compared to Th2-cells was more expressed. Atropine sulfate (single dose 10 mg/kg) promoted the decrease of the activity of both Thl- and Th2-lymphocytes and their synthesizing of cytokins in an equal way; in its turn karboxim (single dose 10 mg/kg,) partly restored in the main the activity of Thl-cells and synthesis of IFN-y.
