CC BY
11УДК 547-3 : 615.917
Изменения активности
^1-, TH2-лимфоцитов и содержания цитокинов в крови при хронической интоксикации фосфорорганическими веществами
Забродский П.Ф. 2, Стрельцова Е.В. 2, Гришин В.А. 1
'Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского
2 Саратовский военный институт биологической и химической безопасности
В экспериментах на неинбредных белых крысах установлено, что хроническая интоксикация фосфорорганическими веществами - ФОВ (российским УХ и зарином) (60 сут, суммарная доза - 0,6 БЬ50) в равной степени снижает иммунные реакции, связанные с функцией ТИ1- и ТИ2-лимфоцитов, концентрацию в крови у- интерферона, ИЛ-4, ИЛ-2,
Введение. В настоящее время химическое оружие (ХО) на основе фосфорорганических веществ - ФОВ (российского УХ, зарина, зома-на) уничтожаются согласно Конвенции о запрещении разработки, производства, накопления и применения ХО и его уничтожении [1,3]. При этом не исключена возможность возникновения аварийных ситуаций в процессе уничтожения ХО, в частности, ФОВ, которые могут приводить к заражению почвы, воздуха, воды к_поражению персонала химических объектов и населения прилегающих территорий. Существует вероятность использования ФОВ в террористических и криминальных целях [3,11]. Широкое использование фосфорорганических соединений (ФОС) в сельском хозяйстве и быту может способствовать загрязнению окружающей среды и вызывать хронические интоксикации [1,2,13]. Отравления могут вызывать также различные антихолинэстеразные соединения, используемые в медицине, токсикокинетика и токсикодинамика которых сходна с боевыми ФОВ и другими ФОС.
За рубежом продолжаются разработки высокоэффективных антидотных средств при поражении ФОВ [6,10,12], анализируются их отдаленные эффекты [11].
Известно, что Т-лимфоциты хелперы неоднородны и состоят из лимфоцитов ТИ0-, ТИ1-, ТИ2-, ТИ3-типа [1,4]. Лимфоциты ТИ0-типа синтезируют ИЛ-2, который стимулируют пролиферацию В-клеток. ТИ1-клетки продуцируют у-интерферон (ИФН-у), участвуя в реализации клеточных иммунных реакций [4], кроме того, они обеспечивают синтез В-лимфоцитами (плазмоцитами) и 1^02а [8]. ТИ2-лимфоциты, синтезируя ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-13, способствуют активации, пролиферации и дифференцировке В-клеток, синте-
ИЛ-6 и не влияет на содержание в крови концентрации ИЛ-10. При воздействии ФОВ доз 30 сут концентрация в крови кортикостерона увеличивается, а через 60 сут существенно уменьшается.
Ключевые слова: фосфорорганические вещества, иммунотоксичность, цитокины, ТМ-, П2-лимфоциты.
зу плазмоцитами основных классов и подклассов иммуноглобулинов (1^01, 1&А1, 1^А2 и 1^0). Кроме того, ИЛ-4 и ИЛ-13 ингибиру-ют продукцию провоспалительных цитокинов макрофагами, а ИЛ-10, продуцируемый ТИ0-, ТИ2- клетками и макрофагами, снижает синтез цитокинов ТМ-лимфоцитами [4,8].
Нарушения функции иммунной системы, в частности, ТИ1- и ТИ2-лимфоцитов и синтеза Т-клетками и другими клетками крови цитоки-нов при хроническом отравлении ФОВ практически не исследованы. Существует необходимость оценки влияния ФОВ на иммунные реакции и продукцию ТИ1- и ТИ2-лимфоцитами цитокинов с целью обоснования необходимости фармакологической коррекции постинтоксикационных нарушений иммунного гомеостаза [1,2] .
Целью исследования являлась оценка хронического действия ФОВ (российского УХ и зарина) на иммунные реакции, связанные с функцией ТИ1- и ТИ2-лимфоцитов, а также на синтез продуцируемых лимфоцитами и другими клетками крови цитокинов.
Материал и методы исследования. Опыты проводили на нелинейных белых крысах обоего пола массой 180-240 г. в соответствии с «Правилами лабораторной практики» (Приказ Минздравсоцразвития России от 23 августа 2010г. № 708н). ФОВ - российский УХ и зарин - вводили подкожно ежедневно в течение 60 сут в дозе 0,01 БЬ50 (БЬ50 УХ и зарина при подкожном введении составляли соответственно 0,24+0,02 и 0,018+0,004 мг/кг). Показатели системы иммунитета оценивали общепринятыми методами в экспериментальной иммуно-токсикологии и иммунологии [1,4] после хронической интоксикации ФОВ через 60 сут после первой инъекции антихолинэстеразных
веществ. Гуморальную иммунную реакцию к тимусзависимому антигену (эритроцитам барана - ЭБ), характеризующую способность ТИ1-лимфоцитов участвовать в продукции плазматическими клетками 1^М, определяли по числу антителообразующих клеток (АОК) в селезенке через 4 сут после иммунизации (пик продукции 1&М), которую проводили внутрибрюшин-но в дозе 2-108 на 56 сут после первого введения ФОВ. Функцию ТИ1-лимфоцитов оценивали по реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ). Формирование ГЗТ, исследовали у животных по приросту массы стопы задней лапы в %. Разрешающую дозу ЭБ (5-108) вводили под апоневроз стопы задней лапы через 4 сут после иммунизации, которую проводили внутрибрюшинно на 56 сут после первого введения ФОВ. Реакцию ГЗТ оценивали через 24 ч. Функцию ТИ2-лимфоцитов исследовали по числу АОК, синтезирующие 1^0 к ЭБ, в селезенке на пике продукции данного иммуноглобулина (на 14 сут после иммунизации) методом непрямого локального гемолиза в геле [4]. При этом крыс иммунизировали внутрибрюшинно ЭБ в дозе 2-108 клеток на 48 сут после первого
введения ФОВ. Таким образом, при оценке всех иммунных реакций животные получали суммарную дозу ФОВ, составляющую 0,6 DL50.
Содержание кортикостерона в крови определяли после первой инъекции ФОВ через 15, 20, 30, 40 и 60 сут общепринятым методом [1]. Концентрацию цитокинов ИФН-у, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6 и ИЛ-10 исследовали в плазме крови крыс через 30 сут после первой инъекции ФОВ методом ферментного иммуносорбентного анализа (ELISA), используя наборы (ELISA Kits) фирмы BioSource Int. При этом ИФН-у, ИЛ-2, ИЛ-6 и ИЛ-10 определяли через 4 сут после иммунизации ЭБ, а ИЛ-4 - на 14 сут. Полученные данные обрабатывали статистически с использованием t-критерия достоверности Стьюдента.
Результаты и обсуждение. Под влиянием хронической интоксикации VX и зарина (табл. 1) происходило снижение гуморального иммунного ответа к Т-зависимому антигену (по числу АОК к ЭБ в селезенке), характеризующему функцию ТЪ1-лимфоцитов и синтез IgM, через 4 сут после иммунизации по сравнению с контрольным уровнем соответственно в 1,66 и 1,56 раза (p<0,05).
Таблица 1
Влияние хронической интоксикации ФОВ (суммарная доза 0,6 РЬ, 60 сут) на функцию ТМ1- и ТМ2- лимфоцитов у белых крыс (М+т, п = 99-12)
Вещества Функция Hil-лимфоцитов Функция И2-лимфоцитов
АОК к ЭБ (IgM), 103 ГЗТ % АОК к ЭБ (IgG), 103
Контроль 42,0+4,1 37,5+3,5 57,2+5,5
VX 25,3+2,6* 24,5+2,4* 35,7+3,5*
Зарин 27,0+3,0* 27,0+2,6* 40,6+3,9*
Примечание: * -р<0,05 по сравнению с контролем.
После интоксикации веществом УХ и зарином отмечалась также существенная редукция активности ТИ1-лимфоцитов, оцениваемая по реакции ГЗТ, соответственно в 1,53 и 1,39 раза (р<0,05). На 14 сут после иммунизации ЭБ отмечалась супрессия продукции 1^0 (по числу АОК в селезенке), отражающая преимущественно функцию ТИ2-лимфоцитов, после интоксикации Ух и зарином, соответственно в 1,60 и 1,41 раза (р<0,05).
Параметры, характеризующие клеточную и гуморальную иммунные реакции и связанную с ними функцию ТИ1- и ТИ2-лимфоцитов, при действии ФОВ в среднем снижались соответственно в 1,54 и 1,51 раза. Это свидетельствует о том, что под влиянием антихолинэстеразных ядов функция ТИ1- и ТИ2- лимфоцитов поражается в равной степени.
Полученные данные в отношении одинаковой редукции активности ТИ1- и ТИ2- лимфоцитов при хронической интоксикации ФОВ подтверждаются оценкой концентрации цитокинов в крови крыс (табл. 2). После хронической интоксикации УХ и зарином через 30 сут выявлено уменьшение концентрации ИФН-у на 5 сут после иммунизации ЭБ в 1,92 и 1,82 раза (р<0,05), а ИЛ-4 на 14 сут после иммунизации ЭБ - в 1,78 и 1,89 раза (р<0,05) соответственно. Это свидетельствуют о том, что концентрации ИФН-у и ИЛ-4 в крови под влиянием ФОВ снижается в равной степени.
Приблизительно равное соотношения ИФН-у /ИЛ-4 в контроле и при действии ФОВ характеризует одинаковое снижение функциональной активности лимфоцитов ТМ-типа и функции ТИ2-клеток [4,5].
Таблица 2
Влияние хронической интоксикации ФОС (суммарная доза 0,6 РЬБО, 60 сут) на содержание цитокинов в плазме крови крыс, пг/мл (М+т, п =7)
Серии опытов ИФН-У ИЛ-4 ифнУ/ИЛ-4
Контроль 1023+75 91+9 11,2
УХ 532+70* 51+6* 10,5
Зарин 563 +63* 48+5* 11,7
Примечание: * -р<0,05 по сравнению с контролем.
Данный эффект, вероятно, обусловлен снижением активности концентрации в крови кор-тикостероидов через 60 сут после воздействия ФОВ (стадия истощения общего адаптационного синдрома и снижение способности ФОВ активировать гипоталамо-гипофизарно-адреналовую систему) [1]. Так, через 15, 20 и 30 сут концентрация кортикостерона в крови при воздействии вещества УХ (п=7) увеличивалась по сравнению с контролем (20,1+2,1 нг/мл) соответственно до 35,3+3,5, 44,8+4,6 и 30,0+3,2 (р<0,05), а через 60 сут уменьшалась до 13,2+1,4 нг/мл (р<0,05).
Известно, что данный гормон в большей степени снижает функцию лимфоцитов ТИ1-типа по сравнению с ТИ2-лимфоцитами [4] и при снижении его содержания до контрольного уровня отмечается приблизительно равная супрессия функции ТИ1- и ТИ2-клеток.
Полученные данные позволяют полагать, что при одинаковом снижении двух основных типов ТИ-лимфоцитов равновероятно развитие, как микробной (основная защитная роль выполняется ТИ2-лимфоцитами и связанными с ними клетками и иммуноглобулинами), так и вирусной инфекции (основная защитная роль наряду с другими Т-клетками и естественными клетками киллерами принадлежит ТИ2-лимфоцитам)
[7].
При исследовании концентрации в плазме крови крыс цитокинов ИЛ-2, ИЛ-6 (табл. 2) установлено уменьшение их содержания через 30 сут после хронического действия УХ соответственно в 1,42 и 1,39 раза (р<0,05), а при действии зарина - в 1,53 и 1,37 раза (р<0,05). Содержание в крови ИЛ-10 уменьшалось несущественно.
Таблица3
Влияние хронической интоксикации ФОВ (суммарная доза 0,6 ОЦ0, 60 сут) на содержание цитокинов в плазме крови крыс, пг/мл (М+т, п = 7)
Цитокины Контроль УХ Зарин
ИЛ-2 1198+107 846+89* 820+90*
ИЛ-6 92±8 60±5* 67±6*
ИЛ-10 987±85 851±86 807±77
Примечание: * -р<0,05 по сравнению с контролем.
Снижение в плазме крови под влиянием ФОВ ИЛ-2 свидетельствует о супрессии его продукции Т-лимфоцитами (как СБ4+, относящимися к ТИ0-клеткам, так, и по ряду данных литературы, к ТИ1-лимфоцитам [1], а также к Т-клеткам с маркером СБ8+), угнетении пролиферации Т- и В-клеток (синтеза Д-цепи молекулы иммуноглобулина), активности естественных клеток-киллеров [4,8].
Уменьшение в крови ИЛ-6 (провоспалительно-го цитокина) характеризует редукцию его синтеза макрофагами и лимфоидными дендритными клетками в печени вследствие ее поражения ФОВ [4,8].
Концентрация ИЛ-10 (антивоспалительный ци-токин), продуцируемого ТИ0-, ТЬ2-лимфоцитами, моноцитами, макрофагами и В-клетками и снижающего секрецию ИФН-у ТИ1-лимфоцитами [8,9] практически не изменялось при хронической интоксикации ФОВ. Вероятно это связано со значительным снижением ФОВ синтеза ИФН-у. При этом не реализуется эффект ИЛ-10, который продуцируется ТИ0-, ТИ2-лимфоцитами, моноцитами, макрофагами и В-клетками, и способен усилить супрессию функции ТИ1-лимфоцитов и синтез ими ЙФН-у в еще большей степени (проявление реакции, регулирующей функцию ТИ-
лимфоцитов первого типа [8]
Выводы. 1. Хроническое действие ФОВ (российского УХ и зарина) в течение 60 сут в суммарной в дозе, составляющей 0,6 БЬ50 (по 0,01 БЬ50 ежесуточно), в равной степени снижает иммунные реакции, связанные с функцией ТИ1- и ТЙ2-лимфоцитов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Забродский П.Ф., Мандыч В.Г Иммунотоксикология ксенобиотиков.- Саратов, 2007. - 420 с.
2. Общая токсикология / Под ред. Б.А. Курляндского, В.А. Филова. - М.: Медицина, 2002. - 608 с.
3. Петров А.Н., Софронов ГА., Нечипоренко С.П., Сомин И.Н. // Рос. хим. ж. (Ж. Рос. Хим. об-ва им Д.И. Менделева).- 2004. - Т XLVIII. - № 2. -С.110-116.
4. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. Пер. с англ. - М.: Мир, 2000. - 582 с.
5. Сухих ГТ, Касабулатов Н.М., Ванько Л.В. и др. // Бюл. эксперим. биол. и мед.- 2005. -Т 140. - № 12.-С. 622-624.
6. 6. Amitai G., Adani R., Fishbein E. et al. // J.Appl.Toxicol.-2006 - V 26. - № 1. -P.81-87.
7. Asquith B., Zhang Y., Mosley A.J., de Lara C.M. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2007. - V 104. - № 19. - P. 8035-8040.
8. Georgiev VSt., Albright J.E. // Immunomodulation drugs. Ann. of the N.-Y. Acad. Sci. - 1993. - V 685. - P.284-602.
9. Kim H.S., Eom J.H., Cho H.Y. // J. Toxicol. Environ. Health.- 2007.- V 70. № 15-16.- P. 1278-1287.
10. Lenz D.E., Maxwell D.M., Korlovich I. et al. // Chem. Biol. Interact.- 2005.- V 157-158. - P.205-210.
2. Хроническая интоксикация ФОВ снижает концентрацию в крови ИФН-у, ИЛ-4, ИЛ-2, ИЛ-6 и не влияет на содержание в крови концентрации ИЛ-10.
3. При воздействии ФОВ доз 30 сут концентрация в крови кортикостерона увеличивается, а через 60 сут существенно уменьшается.
11. Sharp D. Long-term effects of sarin // Lancet. - 2006. - V 14. - № 367 (9505). P.-95-97.
12. Shin T.M., Kan R.K., McDonough J.H. // Chem. Biol. Interact.- 2005. - V 157-158. - P.293-303.
13. Tremolada P., Finizio A., Villa S. et al. // Aqat. Toxicol.- 2004. - V 67. - № 1. - P. 87-103.
14. Zabrodskiy P.F., Streltsova Ye.V , Grishin VA.
Zabrodskiy P.F.2, Streltsova Ye.V. 2, Grishin V.A. 1
Changes in activity of Th1 and Th2 lymphocytes and maintenance of cytokines in blood at chronic
intoxication by organophosphorus compounds
VI. Razumovskiy Saratov Medical University Saratov Military Institute of Biological and Chemical Safety
It was established in experiments in noninbred white mice that the chronic intoxication by organophos-phorus compounds and Russian VX and Sarin (total dose of 0.6 LD50, 60 days) equally reduces immune responses bound to Th1- and Th2 lymphocytes functions and concentration of cytokines IFNy, IL-2, IL-4, IL-6; it does not affect the maintenance of IL-10 concentration in blood. At an organophosphorus exposure over 30 days the concentration of corticosteronum in blood increases and after 60 days substantially decreases.
Материал поступил в редакцию 06.05. 2011 r.
УДК 576.08 : 615.9
Симметрия и размеры ядер двуядерных лимфоцитов как показатели генотоксической активности веществ: тестовое исследование N-метил-N-нитро-N-нитрозогуанидина
Мошков Н.Е.
ФГБУ «НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина» Минздравсоцразвития России, г. Москва
В статье описан авторский метод морфо-метрии ядер лимфоцитов крови человека, подготовленных для анализа в микроядерном тесте. Исследование включает оценку генотоксической активности 5.1 - 40.8 мкмоль/ мл стандартного мутагена К-метил-К-нитро-К-нитрозогуанидина в микроядерном тесте на культуре крови человека, и параллельное определение ряда морфометрических показателей ядер двуядерных лимфоцитов. Показано, что
цитогенетические показатели нестабильности генома коррелируют с изменением размеров и степени асимметрии ядер, продемонстрирована пригодность разработанного морфометриче-ского анализа для быстрого прогноза геноток-сических эффектов.
Ключевые слова: Морфометрический анализ, генотоксичность, микроядерный тест с цитохалазином B
