CC BY
13УДК 547.262615.9
Характеристика функции П1-и П2- лимфоцитов и цитокинового профиля при подострой и хронической интоксикации этиловым спиртом
Забродский П.Ф., Свистунов А.А., Лим В.Г., Гришин В.А., Кузьмин А.В., Смуров А.В.
Саратовский государственный медицинский университет
В экспериментах на аутбредных белых крысах установлено, что подострая интоксикация этанолом (7 сут, суммарная доза -1,4 БЬ50) существенно снижает концентрацию в крови цитокинов ИФН-у, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10, увеличивает содержание в крови ИЛ-6, супрес-сирует иммунные реакции, снижает функции 1Ь1- ТИ2-клеток в равной степени. Хроническая интоксикация этанолом (30 сут, суммарная доза
- 6,0 ОЬ50) вызывает более выраженную редукцию иммунных реакций и цитокинов ИФН-у, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10 и вызывает поражение ТИ1-клеток в большей степени по сравнению с ТИ2-лимфоцитами. При этом концентрация в крови ИЛ-6 существенно возрастает.
Ключевые слова: этанол, иммунотоксич-ность, цитокины, ТН1, ТН2-лимфоциты.
Введение. Этиловый спирт (Э, этанол) используется как антиобледенитель в авиации, растворитель для морилок, политур, клея и т.п., в медицинской практике применяется как антисептик и консервант, употребляется при приготовлении настоек и экстрактов в фармацевтической промышленности и в быту [1]. К числу ведущих факторов, обусловливающих демографический кризис в России, относится рост потребления алкоголя. Алкогольные отравления в течение многих лет занимают ведущее место среди бытовых отравлений по абсолютному числу смертельных исходов (в России более 60% всех смертельных отравлений обусловлены этанолом) [1,3]. В последние годы число больных с диагнозом острого отравления алкоголем составляет в среднем 20% и более от общего числа госпитализаций [1,2]. За последние 5 лет данная ситуация практически не изменилась, более того, поступление в медицинские учреждения лиц с интоксикацией этанолом имеет тенденцию к увеличению. Следует учитывать, что острое отравление алкоголем происходит, как правило, на фоне его употребления в течение нескольких суток или при сформировавшемся хроническом алкоголизме.
Смертность после острых, подострых и хронических интоксикаций Э может быть связана с инфекционными осложнениями и заболеваниями, обусловленными снижением показателей иммунного статуса [1]. Знание иммунопатогенеза действия Э при подостром и хроническом отравлениях необходимо для обоснования фармакологической коррекции постинтоксикационного нарушения иммунного статуса с целью профилактики различных инфекционных осложнений и заболеваний [1].
От особенностей поражения анти-генпредставляющих клеток, популяций Т-лимфоцитов, В-клеток Э зависит характер формирования вторичного иммунодефи-цитного состояния, и, следовательно, способы коррекции нарушений иммунного статуса [1,4]. Известно, что Т-лимфоциты хелперы неоднородны и состоят из лимфоцитов ТИ0, ТИ1-, ТИ2-, ТИ3-типа [6]. Лимфоциты ТИ0-типа синтезируют ИЛ-2, который стимулируют пролиферацию В-клеток. Кроме того, они выделяют многочисленные цитокины, продуцируемые ТИ1-, ТИ2-клетками (и другими клетками), за исключением ИЛ-12, который выделяют только ТИ2-лимфоциты [4]. ТИ1-клетки продуцируют у-интерферон (ИФН-у), участвуя в реализации клеточных иммунных реакций [4,6,10], кроме того, они обеспечивают синтез В-лимфоцитами (плазмоцитами) и 1^02а [10]. ТИ2-лимфоциты, синтезируя ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-13, способствуют активации, пролиферации и дифференциров-ке В-клеток, синтезу плазмоцитами основных классов и подклассов иммуноглобулинов (^1-4, ^А1, ^А2 ^Е и ^Б). Кроме того, ИЛ-4 и ИЛ-13 ингибируют продукцию провос-палительных цитокинов макрофагами, а ИЛ-10, продуцируемый ТИ0-и ТИ2- клетками и макрофагами, снижает синтез цитокинов ТИ1-лимфоцитами [4,6,10].
В формировании аллергических и анафилактических реакций также участвуют лимфоциты ТИ1-и ТИ2-типа. Контактые (кожные) аллергические реакции связаны с функцией ТИ1-лимфоцитов, а респираторные аллергические реакции - с активностью ТИ2-лимфоцитов (синтез 1^Е) [1,4,10]. От соотно-
шения активности лимфоцитов ТМ-, ТИ2-типа (парадигма двух видов хелперов - ТМ/ТИ2 [13]) может зависеть вероятность возникновения соответственно вирусных или микробных инфекций [7], также формирование контактной или респираторной гиперчувствительности [9,11].
Целью исследования являлась оценка иммунных реакций, отражающих функцию ТМи ТИ2-лимфоцитов, и цитокинового профиля (содержание в крови ИФН-у, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6 и ИЛ-10) при подострой и хронической интоксикации этанолом.
Материал и методы исследования. Опыты проводили на аутбредных белых крысах обоего пола массой 180-240 г («Правила лабораторной практики» Приказ Минздравсоц-развития России от 23 августа 2010г. № 708н). Этанол вводили ежедневно, однократно вну-трижелудочно в 40% водном растворе в дозе 0,2 ВЬ50 в течение 7 и 30 сут (подострая и хроническая интоксикация соответственно) ОЬ50 этанола составляла 12,3+1,3 г/кг. Контрольная группа животных получала внутрижелудочно соответствующий объем воды. Показатели системы иммунитета оценивали общепринятыми методами в экспериментальной иммуно-токсикологии и иммунологии [1,4]. Гуморальную иммунную реакцию к тимусзависимому антигену (эритроцитам барана - ЭБ), характеризующую способность ТМ-лимфоцитов участвовать в продукции плазматическими клетками ^М, определяли по числу антите-лообразующих клеток (АОК) в селезенке через 4 сут после иммунизации (пик продукции ^М), которую проводили внутрибрюшин-но в дозе 2-108 на 3 и 26 сут после первого введения Э соответственно при подострой и хронической интоксикации. Функцию ТМ-лимфоцитов оценивали по реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ). Формирование ГЗТ, исследовали у животных по приросту массы стопы задней лапы в %. Разрешающую дозу ЭБ (5-108) вводили под апоневроз стопы задней лапы через 4 сут после внутрибрюшинной иммунизации на 3 и 26 сут после первого введения Э соответственно при подострой и хронической интоксикации. Реакцию ГЗТ оценивали через 24 ч. Функцию ТИ2-лимфоцитов исследовали по числу АОК, синтезирующие ^О к ЭБ, в селезенке через 7 сут после иммунизации методом непрямого локального гемолиза в геле [4]. При этом крыс иммунизировали внутрибрюшинно ЭБ в дозе 2-108 клеток одновременно с первым введением Э и на 23 сут соответственно при по-дострой и хронической интоксикации. Таким образом, при оценке всех иммунных реакций животные получали суммарную эквилеталь-ную дозу Э, составляющую при подострой
и хронической интоксикации соответственно 1,4 и 6,0 DL50.
Концентрацию цитокинов ИФН-у, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6 и ИЛ-10 исследовали в плазме крови крыс через 7 и 30 сут после первой инъекции Э методом ферментного иммуносор-бентного анализа (ELISA), используя наборы (ELISA Kits) фирмы BioSource Int. Полученные данные обрабатывали статистически с использованием t-критерия достоверности Стьюдента.
Результаты и обсуждение. При воздействии Э в течение 7 и 30 сут (табл. 1) отмечалось уменьшение гуморального иммунного ответа к Т-зависимому антигену (по числу АОК в селезенке), характеризующему синтез IgM В-клетками и функцию TM-лимфоцитов, по сравнению с контрольным уровнем соответственно в 1,41 и 3,3l раза (p<0,05). При подо-строй и хронической интоксикации Э отмечалась существенная супрессия реакции ГЗТ (функция TM-клеток) соответственно в 1,49 и 2,98 раза (p<0,05), а функция ^2-лимфоцитов (оцениваемая по числу АОК, синтезирующих IgG к ЭБ) - в 1,40 и 2,21 раза соответственно (p<0,05).
При подострой и хронической интоксикации Э характеризующие иммунные реакции и связанную с ними функцию TM-лимфоцитов параметры в среднем снижались соответственно в 1,45 и 3,15 раза, а показатели, связанные с функцией ^2-клеток, - в 1,40 и 2,21 раза соответственно. Полученные данные свидетельствуют о том, что функция Th1- и ^2-лимфоцитов под влиянием подострой интоксикации Э снижается в равной степени. Хроническая интоксикация Э вызывает супрессию активности TM-лимфоцитов в большей степени по сравнению с редукцией функции ^2-клеток.
Более выраженное снижение активности TM-клеток при хронической интоксикации Э по сравнению с подострым отравлением может быть обусловлено длительным увеличением в крови концентрации кортикосте-рона [1], к которому при действии Э в течение 30 сут в большей степени чувствительны лимфоциты TM-типа по сравнению с Th2-лимфоцитами [4]. Поражение Т-лимфоцитов и других клеток этанолом, видимо, происходит в результате нарушения их функции вследствие взаимодействия с сульфгидриль-ными и аминогруппами ферментов высокотоксичного продукта биотрансформации этанола ацетальдегида, мембранотоксиче-ского действия этилового спирта и его метаболита, инициацией перекисного окисления липидов, ингибированием тканевого дыхания и окислительного фосфорилирования [1].
Таблица 1
Влияние подострой и хронической интоксикации этанолом на функцию ^1- и ^2- лимфоцитов у крыс (М+m, п = 9-12)
Серия опытов Функция ^1-лимфоцитов Функция ^2-лимфоцитов
АОК к ЭБ (IgM), 103 ГЗТ, % АОК к ЭБ (IgG), 103
Контроль 47,4+4,8 39,0+3,6 20,3+2,0
Этанол (1) 33,5+3,2* 26,1+2,5* 14,5+1,5*
Этанол (2) 14,3+1,5* 13,1+1,4* 9,2+1,1*
Примечание: 1, 2- подострая и хроническая интоксикация соответственно; * - p<0,05 по сравнению с контролем.
Таблица 2
Влияние подострой и хронической интоксикации этанолом на содержание цитокинов
в плазме крови крыс, пг/мл (М+m, n = 7)
Цитокины Контроль Этанол (1) Этанол (2)
ИФН-у 1032±98 750±73* 270±25*
ИЛ-4 137±14 98±9* 48±5*
ИФН^ /ИЛ-4 7,5±0,7 7,7±0,7 5,6±0,6*
ИЛ-2 1369+101 998+97* 442+32*
ИЛ-6 58±5 78±7* 89±8*
ИЛ-10 383±39 275±26* 205±19*
Примечание: 1, 2- подострая и хроническая интоксикация соответственно; * -p<0,05 по сравнению с контролем.
Установлено уменьшение содержания ИФН-у и ИЛ-4 в плазме крови крыс через 7 сут при действии Э соответственно в 1,38 и 1,40 раза (р<0,05), а через 30 сут - в 3,82 и 2,85 раза соответственно (р<0,05) (табл. 2). Соотношения ИФН-у/ИЛ-4 при подострой интоксикации Э практически не изменялось по сравнению с контрольным значением. Это характеризует поражение ТИ1- и ТИ1-лимфоцитов в равной степени. Снижение соотношения ИФН-у/ИЛ-4 при хронической интоксикации Э (5,6) по сравнению с контролем (7,5) свидетельствует о большей супрессии активности ТИ1- лимфоцитов по сравнению с функцией ТИ2-клеток (р<0,05) [5].
Содержание в плазме крови ИЛ-2 и ИЛ-10 при подострой интоксикации Э снижались соответственно в 1,37 и 1,45 раза (р<0,05), а при хронической - в 3,10 и 2,05 соответственно (р<0,05). Концентрация ИЛ-6 при подостром и хроническом воздействии Э увеличивалась в 1,34 и 1,53 раза (р<0,05) соответственно.
Редукция в плазме крови под влиянием этанола ИЛ-2 свидетельствует о супрессии его продукции Т-лимфоцитами (ТИ0- типа, цито-токсическими Т-клетками), редукции пролиферации Т- и В-клеток, активности естественных клеток-киллеров [4,6].
Увеличение в крови ИЛ-6 (провоспали-тельного цитокина), вероятно, характеризует увеличение его продукции макрофагами, моноцитами и лимфоидными дендритными клетками в печени вследствие ее поражения алкоголем (реализация воспалительного процесса) [1,4,6,10].
Уменьшение в плазме крови концентрации ИЛ-10 (антивоспалительного цитокина) свидетельствует о редукции этанолом функции ТИ0-, ТИ2-лимфоцитов, моноцитов, макрофагов и В-клеток. Этот цитокин способен уменьшать секрецию ИФН-у ТМ-лимфоцитами [10,12]. Этот эффект характерен для тяжелых металлов [8], динитрохлорбензола, формальдегида и других токсикантов [14]. Снижение
синтеза ИЛ-10 при хронической интоксикации Э в меньшей степени, чем ИФН-у, подтверждает установленный нами больший поражающий эффект этанола при его действии в течение 30 сут в отношении ТМ-лимфоцитов. Относительно небольшая редукция ИЛ-10 при хронической интоксикации Э, вероятно, обусловлена значительным снижением синтеза ИФН-у этанолом, что, вероятно, исключает регулирующее повышение ТИ0-, ТИ2-лимфоцитами, моноцитами, макрофагами и В-клетками продукции ИЛ-10, который способен усилить супрессию функции ТИ1-лимфоцитов в еще большей степени.
Выводы. 1. Подострая интоксикация этанолом (0,2 ВЬ50, однократно, ежедневно в
течение 7 сут) вызывает поражение функции ТИ1- и ТИ2-лимфоцитов в равной степени. Хроническая интоксикация этанолом (0,2 БЬ50, однократно, ежедневно в течение 30 сут) вызывает супрессию активности ТИ1-лимфоцитов в большей степени по сравнению с редукцией функции ТИ2-клеток.
2. Под влиянием подострой интоксикации этанолом существенно снижается концентрация в крови цитокинов ИФН-у, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10, а содержание ИЛ-6 увеличивается. При хронической интоксикации этиловым спиртом снижение ИФН-у, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10 и увеличение ИЛ-6 более выражено, при этом редукция в крови содержания ИФН-у, отмечается в большей степени, чем ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10.
Р СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Забродский П.Ф., Мандыч В.Г. Иммунотоксикология ксенобиотиков: Монография. - Саратов: СВИБХБ, 2007. - 420 с.
2. Бонитенко Ю.Ю., Куценко С.А. // Токсиколог. вестник - 2004. -№4. -С. 2-11.
3. Лужников Е.А., Костомарова Л.Г. Острые отравления: Руководство для врачей. 2-е изд., перераб и доп. - М.:Медицина, 2000. - 434 с.
4. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. Пер. с англ. -М.: Мир, 2000. - 582 с.
5. Сухих Г.Т., Касабулатов Н.М., Ванько Л.В. и др. // Бюл. экспе-рим. биол. и мед.-2005. -Т. 140, № 12. -С. 622 -624.
6. Хаитов Р.М., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология. -2-е изд., перераб. и доп. -М.: Медицина, 2002. - 536 с.
7. Asquith B., Zhang Y., Mosley A.J., de Lara C.M. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2007. - Vol. 104. - № 19. - P. 8035-8040.
8. Chen J.Y., Yu W., Liu W.W., Luo Y. // Zhonghua Lao Doyg Wei Sheng Zhi Ye Bing Za Zhi. - 2007. -Vol. 52. -№ 3.- P. 1319-1326.
- P. 279-281.
9. Corsini E., Kimber I. // Toxicol. Lett. -2007. - Vol.168. -№3. -P.255-299.
10. Georgiev V.St., Albright J.E. // Immunomodulation drugs / Ann. of the N.-Y. Acad. Sci. - 1993. - Vol. 685. - P.284 -602.
11. Hsu H.Y., Lin B.F., Lin J.Y. et al. // J. Agric. Food. Chem. -2003.
- Vol. 51. -№ 13. - P.3763-3769.
12. Kim H.S. Eom J.H., Cho H.Y. et al. // J. Toxicol. Environ. Health.-2007. - Vol. 70. -№15-16. - P. 1278-1287.
13. Romagnani S. // Immunol. Today. -1997. - Vol. 18. - №6. -P. 263 -266.
14. Urlich P., Grenet O., Bluemel J. et al. // Arch. Toxicol. - 2001. -Vol. 75. - № 8.- P. 470-479.
Zabrodskiy P.F., Svistunov A.A., Lim V.G., Grishin V.A., Kuzmin A.V., Smurov A.V.
Characterization of TH1- and TH2- lymphocytes function and cytokine profile at sub-acute
and chronic intoxication by ethyl alcohol
Saratov State Medical University
It was established in experiments on non-inbred rats that sub-acute intoxication by ethanol ( 7 days, total dose 1.4 LD50 ) significantly reduces the concentration of IFN- y, IL-2, IL-4, IL-10 cytokines in blood, increases the concentration of IL-6 in blood, suppresses immune responses, reduces functions of Th1-and Th2- cells at an equal rate. A chronic intoxication by ethanol (30 days, total dose 6.0 LD50) invokes a more expressed reduction of immune responses and IFN- y, IL-2, IL-4, IL-10 cytokines and causes a lesion of Th1- cells to a greater extent as compared to Th2- lymphocytes. And with it all, the concentration of IL-6 in blood significantly increases.
Материал поступил в редакцию 19.04.2010 г.
