CC BY
23УДК 615.91.092
П.Ф.Забродский, В.Г.Мандыч, Е.П.Забродская, А.В.Смуров, И.Х.Яфарова
ОСОБЕННОСТИ ЦИТОКИНОВОГО ПРОФИЛЯ ПРИ ПОДОСТРОМ ОТРАВЛЕНИИ ТОКСИЧНЫМИ ХИМИКАТАМИ
Саратовский военный институт биологической и химической безопасности
В экспериментах на неинбредных белых крысах установлено, что подострая интоксикация токсичными химикатами (российским УХ, ипритом и люизитом) вызывает характерные для каждого токсиканта изменения цитоки-нового профиля. Отравление R-VX вызывает большее поражение ТЫ-клеток по сравнению с ТИ2-лимфоцитами. Везиканты обусловливают редукцию функции ТЫ- и ТИ2-лимфоцитов в равной степени.
Ключевые слова: токсичные химикаты, иммунотоксичностъ, П1-, П2-лимфоциты, цитокины.
Введение. Известно, что в реализации иммунного ответа принимают участие антигенпред-ставляющие клетки (дендритные клетки, моно-нуклеарные фагоциты, клетки кожи Лангерган-са, В-клетки), Т-лимфоциты-хелперы и В-лим-фоциты, которые продуцируют иммуноглобулины различных классов [4]. Токсиканты в зависимости от их физико-химических свойств, особенностей токсикокинетики и токсикодинами-ки поражают иммуноциты, участвующие в формировании иммунного ответа, в разной степени. От характера поражения Т- или В-звена иммунитета (или преимущественно антигенпредстав-ляющих клеток) зависят особенности постинтоксикационного иммунодефицитного состояния, и, следовательно, способы коррекции нарушений иммунного статуса [1]. Известно, что Т-лимфоциты хелперы неоднородны и состоят из лимфоцитов ТЫ-, ТИ2-, ТИ3-типа.
ТЫ -клетки продуцируют цитокины организаторы лимфоцитарного иммунного ответа у-интерферон (ИФН-у) и ИЛ-3, участвуя в реализации клеточного иммунного ответа [4], кроме того, они обеспечивают синтез В-лимфоци-тами ^М и IgG2a [9]. ТИ2-лимфоциты синтезируют ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-9, ИЛ-10, ИЛ-13, которые способствуют формированию гуморальных иммунных реакций. При этом В-лим-фоцитами продуцируют иммуноглобулины основных классов и подклассов (lgGl-4, ^А1, IgA2 ^Е и №) [4].
В формировании аллергических и анафилактических реакций (варианты «неадекватного» иммунного ответа, называемые «гиперчувствительностью», ведущей к серьезным повреждениям тканей организма) также участвуют лимфоциты ТЫ - и ТИ2-типа. Контактые (кожные) аллергические реакции связаны с функцией ТЫ-лим-фоцитов, а респираторные аллергические реакции — с активностью ТИ2-лимфоцитов [1, 4].
Лимфоциты ТИ3-типа и регуляторные Т-клет-ки играют модулирующую роль при реализации иммунных реакций. Снижение функции лимфоцитов ТЫ-, ТИ2-типа вызывает редукцию преимущественно соответственно клеточных или гуморальных реакций, кроме того, от соотношения этих субпопуляций лимфоцитов (их функции) может зависеть вероятность формирования контактной или респираторной гиперчувствительности. Так, с активностью ТИ2-лимфо-цитов связан синтез ^Е, который обеспечивают проявление респираторных аллергических реакций [4, 9].
Цитокиновый профиль при отравлениях токсичными химикатами (ТХ) зависит от особенностей их токсикокинетики и токсикодинами-ки. ТХ могут различаться по особенностям воздействия на функцию ТЫ-, ТИ2-лимфоци-тов. От соотношения активности лимфоцитов ТЫ-, ТИ2-типа (парадигма двух видов хелпе-ров — ТЫ/ТИ2 [13]) может зависеть вероятность возникновения соответственно вирусных или микробных инфекций [5], также формирование кожной или респираторной гиперчувствительности [8, 11]. Так, с активностью ТИ2-лимфоцитов связан синтез ^Е, которые обеспечивают проявление респираторных аллергических реакций [14].
Зная особенности цитокинового профиля, соотношение активностей ТЫДЪ2 лимфоцитов при поражении ТХ, можно не только прогнозировать риск развития поражения клеточного или гуморального звена иммунитета, приводящее к различным инфекционным осложнениям и заболеваниям, а также к реакциям гиперчувствительности, в частности к аллергии, но и осуществлять выбор адекватных характеру нарушения иммунного статуса иммуномодуляторов [1-3].
Целью исследования являлась оценка иммунных реакций и цитокинового профиля (содер-
жание в крови ИФН-у, ИЛ-4, ИЛ-6 и ИЛ-10), отражающего функцию Thl-, Th2-лимфоцитов при остром отравлении различными ТХ.
Материал и методы исследования. Опыты проводили на неинбредных белых крысах обоего пола массой 180—240 г. Антихолинэстераз-ный токсикант (российский VX — R-VX) вводили подкожно в водном растворе, сернистый иприт (СИ) и люизит — подкожно в растворе диме-тилсульфоксида. ТХ применяли в дозе 1/4 DL50 в течение 4-х сут и 1/13 DL50 в течение 13-ти сут для оценки соответственно функции Th1- и ^2-лимфоцитов. (DL50 R-VX, СИ, люизита составляли соответственно 0,018+0,004, 5,5±0,3 и 2,8±0,3 мг/кг). Концентрацию цитокина ИФН-у исследовали в плазме крови крыс на 5-е сут после первой инъекции ТХ, а цитокины ИЛ-4, ИЛ-6 ИЛ-10 — на 14-е сут после введения ТХ методом ферментного иммуносорбентного анализа (ELISA), используя наборы (ELISA Kits) фирмы BioSource Int. Сроки определения цитоки-нов в крови соответствовали особенностям иммуногенеза при иммунизации эритроцитами барана (ЭБ). Показатели системы иммунитета оценивали общепринятыми методами в экспериментальной иммунотоксикологии и иммунологии [1, 4]. Гуморальную иммунную реакцию к тимусзависимому антигену (ЭБ), характеризующую способность ТЫ-лимфоцитов участвовать в продукции В-лимфоцитами (плазматическими клетками) IgM, определяли по числу антителообразующих клеток (АОК) в селезенке, функцию ТЫ-лимфоцитов — по реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ). Формирование ГЗТ исследовали у животных по приросту массы стопы задней лапы в %. Разрешающую дозу ЭБ (5-108) вводили под апоневроз стопы задней лапы на 4-е сут. Реакцию ГЗТ оценивали через 24 ч. Реакции, характеризующие функцию ТЫ-клеток, оценивали на 5-е сут. Функцию ^2-лимфоцитов исследовали по числу АОК, синтезирующих IgG к ЭБ, в селезенке на пике продукции данного иммуноглобулина (14 сут) методом непрямого локального гемолиза в геле [4]. Крыс иммунизировали
внутривенно ЭБ в дозе 2-108 клеток одновременно с первым введением токсиканта. Таким образом, при оценке всех иммунных реакций животные получали эквилетальную дозу ТХ (1,0 DL50). Полученные данные обрабатывали статистически с использованием ^критерия достоверности Стьюдента.
Результаты и обсуждение. При исследовании концентрации цитокинов в плазме крови крыс (табл. 1) установлено уменьшение содержания ИФН-у на 5-е сут и ИЛ-4 на 14-е сут после отравления R-VX соответственно в 2,29 и 1,67 раза (р < 0,05), сернистым ипритом — в 3,13 и 3,00 раза (р < 0,05), а люизитом — в 2,69 и 2,72 раза (р < 0,05) соответственно.
Максимальный редуцирующий эффект ТХ в отношении синтеза ИФН-у и ИЛ-4 выявлен у сернистого иприта, минимальный — у R-VX. Очевидно, что снижение соотношения ИФН-у/ИЛ-4 по сравнению с контролем свидетельствует о большей супрессии активности лимфоцитов ТЫ-типа по сравнению с функцией ТИ2-клеток ^-УХ). При этом соотношение ИФН-у/ИЛ-4 несущественно отличающееся от контрольного значения свидетельствует об одинаковой степени поражения ТЫ - и ТИ2-лимфо-цитов ТХ (СИ, люизит).
Наибольшее супрессирующее действие в отношении синтеза ИЛ-6 и ИЛ-10 выявлено у R-VX, наименьшее — у сернистого иприта.
ИЛ-6 (провоспалительный цитокин) [6] активирует В-клетки, продуцируется ТИ2-лимфоци-тами (и ТМ-типа), макрофагами и лимфоидны-ми дендритными клетками покровных тканей в очаге внедрения патогена [9]. Вероятно, именно поэтому СИ, вводившийся подкожно, вызывает меньшее снижение концентрации этого цитоки-на, чем другие ТХ вследствие поражения тканей и, возможно, индукции реакции гиперчувствительности к СИ.
Концентрация ИЛ-10 изменялась при действии ТХ также, как и ИЛ-6. Люизит вызывал максимальное снижение содержания ИЛ-10 в крови. Этот эффект характерен для тяжелых металлов [7], динитрохлорбензола, формальдеги-
Влияние подострой интоксикации химикатами на содержание цитокинов в плазме крови крыс, пг/мл (M±m, п = 6)
Таблица 1
Вещество ИФН-у ИЛ-4 ИФН-у/ИЛ-4 ИЛ-6 ИЛ-10
Контроль 985+81 144+20 6,8 45+6 305+39
R-VX 430+60* 86+12* 5,0 18+4* 146+22*
СИ 315+43* 48+7* 6,6 26+5* 195+19*
Люизит 366+40* 53+9* 6,9 24+4* 182+20*
Примечание. Здесь и в табл. 2: * — р < 0,05 по сравнению с контролем
Таблица 2
Влияние подострои интоксикации химикатами на функцию ТИ1- и ТИ2- лимфоцитов у крыс (М±т, п = 7-15)
Вещество Функция ТЫ-лимфоцитов Функция ТЬ2-лимфоцитов
АОК к ЭБ (^М), 103 ГЗТ,% АОК к ЭБ (ДО), 103
Контроль 47,7±4,2 41,5±3,4 56,1±5,5
R-VX 19,0±2,2* 20,8±2,3* 40,2±3,9*
СИ 12,1±1,6* 9,8±1,9* 14,4±2,3*
Люизит 14,8±1,8* 13,1±2,1* 23,5±3,5*
да и других токсикантов [15]. Кроме того, выявленная концентрация ИЛ-10 относительно более высокая при действии везикантов, чем при отравлении R-VX, вследствие антивоспалительного эффекта ИЛ-10 (иммуносупрессивного действия) [12], который проявляется при многократном введении СИ и люизита. Это действие можно рассматривать как реакцию на воспаление в месте введения везикантов.
Нами установлено, что соотношение ИФН-у/ИЛ-4 при отравлении R-VX, СИ, и люизитом составляло соответственно 5,0, 6,6 и 6,9 (контрольный показатель — 6,8). Это свидетельствует о поражении ТЫ- и ТИ2-клеток ве-зикантами в равной степени и большем редуцирующем эффекте R-VX в отношении ТЫ-лим-фоцитов.
При воздействии ТХ (табл. 2) отмечалось уменьшение гуморального иммунного ответа через 4 сут к Т-зависимому антигену (по числу АОК в селезенке), характеризующему синтез ^М В-клетками и функцию ТЫ-лимфоци-тов, по сравнению с контрольным уровнем под влиянием R-VX, СИ и люизита соответственно в 2,51, 3,94 и 3,22 раза (р < 0,05), а через 13 сут после иммунизации (пик иммунного ответа, оцениваемый по IgG) отмечалось уменьшение продукции IgG (по числу АОК в селезенке) соответственно в 1,39, 3,89 и 2,39 раза (р < 0,05), свидетельствующее о редукции функции ТИ2-лимфоцитов. При подостром отравлении R-VX, СИ и люизитом на 5-е сут отмечалась существенная супрессия реакции ГЗТ (функция ТЫ-клеток) соответственно в 1,99, 4,23 и 3,17 раза (р < 0,05).
Характеризующие иммунные реакции и связанную с ними функцию ТЫ-лимфоцитов, параметры при действии R-VX, СИ и люизита в среднем снижались соответственно в 2,25, 4,08 и 3,20 раза. Установлено уменьшение иммунного ответа, который обеспечивается функцией ТИ2-лимфоцитов (и В-клеток), при отравлении R-VX, СИ и люизитом, соответствующее редукции числа АОК, синтезирующих IgG. Очевидно, под влиянием R-VX в большей степени поража-
ется функция ТЫ-лимфоцитов, при действии везикантов — функция ТЫ- и ТИ2-лимфоцитов нарушается в равной степени.
Редукция активности ТЫ-клеток R-VX может быть обусловлена существенным увеличением в крови концентрации кортикостерона [1, 3], к которому в большей степени чувствительны лимфоциты ТЫ-типа по сравнению с ТИ2-лим-фоцитами [4], большим содержанием эстераз на наружной мембране и в цитозоле ТЫ-клеток. Поражение СИ ТЫ- и ТИ2- лимфоцитов связано с алкилирующим действием в отношении ДНК этих клеток СИ [10], инициацией пероксидации липидов иммуноцитов [1, 3], а иммунотоксиче-ский эффект люизита обусловлен ингибирова-нием моно- и дитиоловых ферментов (в частности, дегидролипоевой кислоты пируватоксидаз-ной системы) иммуноцитов [3] как ТЫ-, так и ТИ2-клеток.
Выводы. 1. Подострое действие токсичных химикатов (R-VX, сернистого иприта и люизита) существенно снижает концентрацию в крови цитокинов (ИФН-у, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-10), при этом соотношение ИФН-у/ИЛ-4 при отравлении R-VX по сравнению с контролем снижается, а при воздействии везикантов не изменяется.
2. Максимальное редуцирующее действие в отношении синтеза ИЛ-6 и ИЛ-10 выявлено у R-VX, минимальное — у сернистого иприта.
3. Под острая интоксикация R-VX вызывает большее поражение ТЫ -клеток по сравнению с ТИ2-лимфоцитами. Везиканты обусловливают редукцию функции ТЫ- и ТИ2-лимфоцитов в равной степени.
Список литературы
1. Забродский П.Ф., Лим В.Г., Мальцева Г.М. и др. Иммунотропные свойства холинергических веществ / Под ред. П.Ф.Забродского. -Саратов: Издательство «Научная книга», 2005. — 251 с.
2. Нестерова И.В. // Аллергология и иммунология, 2005. - Т. 6. - № 2. - С. 139-140.
3. Общая токсикология /Под ред. Б.А.Курлянд-ского, В.А.Филова. — М.: Медицина, 2002. — 608с.
4. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология /Пер. с англ. — М.: Мир, 2000. — 582 с.
5. Asquith B, Zhang Y., Mosley A.J. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2007. - V. 104. - № 19. - P. 8035-8040.
6. Becker R.L., Nylen E.S., White J.C. et al. // J. Clin. Endocrinol. Metab, 2004. - V. 89. - № 4. - P. 1512-1525.
7. Chen J.Y., Yu W., Liu W.W. et al. // Zhonghua Lao Doyg Wei Sheng Zhi Ye Bing Za Zhi, 2007. - P. 279-281.
8. Corsini E, Kimber I. // Toxicol. Lett., 2007. -V. 168. - № 3. - P. 255-299.
9. Georgiev V.St., Albright J.E. // Immunomodulation drugs / Ann. of the N.-Y. Acad. Sci., 1993. - V. 685. - P. 284-602.
10. Hefaxi M, Maleki M.L., Mahmoudi M. et al. //Int. J. Dermatol., 2006. - V 45. - № 9. - P. 10251031.
11. Hsu H.Y., Lin B.F., Lin J.Y. et al. // J. Ag-ric. Food. Chem, 2003. - V. 51. - № 13. - P. 37633769.
12. Kim H.S. Eom J.H., Cho H.Y. et al. // J. Toxicol. Environ. Health, 2007. - V. 70. - № 15-16. - P. 1278-1287.
13. Romagnani S. // Immunol. Today, 1997. - V. 18. - № 6. - P. 263-266.
14. Strid J., Hourihane J., Kimber I. et al. // Eur. J. Immunol., 2004. - V. 34. - № 8. - P. 2100-2109.
Материал поступил в редакцию 21.02.08.
P.F.Zabrodskiy, V.G.Mandych, Ye.P.Zabrodskaya, A.V.Smurov, I.Kh.Yafarova FEATURES OF THE CYTOKINE PROFILE AT SUB-ACUTE POISONING BY TOXIFEROUS CHEMICALS
Saratov Military Institute of Chemical and Biological Safety
It was established in experiments on non-inbred rats that sub-acute poisoning by toxic agents (Russian VX, sulfur mustard and lewisite) induces changes distinctive for each toxic agent in the cytokine profile. Intoxication by R-VX causes a greater lesion of Th-1 cells as compared to Th-2 lymphocytes. Vesicants bring forth reduction of Th1- and Th2-lymphocytes functions in an equal way
УДК 612.222.014.46:546.74
М.Г.Домшлак, Е.Н.Макарова-Землянская
ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ООЦИТОВ МЫШЕЙ WR К ДЕЙСТВИЮ СУЛЬФАТА НИКЕЛЯ
ГУ Научно-исследовательский институт медицины труда РАМН, Москва
Однократное введение сульфата никеля в интервале доз 0,5—5,0 мг/кг (= 1/20 — 1/2 Ышас) самкам мышей WR не индуцировало увеличения частоты доминантных летальных мутаций ни по одному из изучаемых показателей (гибели эмбрионов до имплантации, постимплантационной и общей) в ооцитах на разных стадиях созревания.
Ключевые слова: генетическая чувствительность, сульфат никеля, антральный ооцит, доминантные летальные мутации.
Введение. Генотоксический эффект никеля и его соединений установлен на молекулярном [18, 20, 23] и клеточном уровнях [7, 8, 27]. В то же время, практически отсутствуют данные о влиянии этих веществ на половые клетки. В частности, установлено, что однократное действие растворимых солей никеля (хлорида и нитрата) не вызывает увеличения частоты доминантных летальных мутаций (ДЛМ) в половых клетках мышей [12, 19], тогда как однократное введение сульфата никеля увеличивает как частоту ДЛМ в половых клетках на разных стадиях сперматоге-
неза, так и фрагментацию ДНК на стадии поздних сперматоцитов (0,5 мг/кг) [2, 3].
В доступной литературе не найдены экспериментальные данные относительно действия никеля и его соединений на ооциты лабораторных животных. В то же время, установлено влияние никеля и его соединений на репродуктивность женщин. Так, результаты эпидемиологического исследования работниц электролизных цехов гидрометаллургического производства, воздушная среда которых загрязнена никельсодер-жащим аэрозолем, показали увеличение часто-
