CC BY
35
УДК 612.616:544.726
Максим'юк Г. В.® канд. бюл. наук, ст. наук. ствробггаик, e-mail: hanna. maksymj uk@gmail. com Лье1еський нацюнальний медичний утеерситет iмет Данила Галицького МОЗ Украгни 1нститут землеробстеа i теаринництеа захiдного регюну НААНУ
(м. Льеiе)
МОДИФ1КОВАНА I СТАНДАРТИЗОВАНА МЕТОДИКА ВИЗНАЧЕННЯ АКТИВНОСТ1 ТРАНСПОРТНИХ АТФ-аз ЗА КОНЦЕНТРАЦ1ЯМИ Б1ЛКА I ФОСФОРУ В СПЕРМ1
Лабораторiям крiобiологiчного i бiотехнологiчного профшю наукоео-до^дних устаное, закладiе еищог осети, контролюючих оргатзацт, тощо пропонуеться модифжоеана i стандартизована методика еизначення актиеностi транспортних АТФ-аз, застосуеання яког дозеоляе об'ектиено оцтити рiеень функцюнальног поеноцiнностi сперматозоШе натиеног та крюконсереоеаног сперми.
Ключовi слова: сперма, концентращя быка i фосфору, актиетсть АТФ-аз, життездаттсть сперматозоШе.
Вступ. Вщомо, що динамжу життездатност сперматозоидов нативно1 i крюконсервовано1 сперми слщ ощнювати показниками, яю об'ективно характеризують "реакцш-вщповщь" статевих кл^ин на дiю ендо- та екзогенних чинниюв впливу. Однак впровадженi у практику методи визначення !х рухливост та заплщнювально1 здатностi балами i вiдсотками переважно е окомiрними, а отже i суб'ективними [2, 4, 5]. Тому модифжащя, адаптацiя, розробка i впровадження у практичну та науково-дослщну роботу сучасних методiв оцшки функцiонального стану сперматозовдв за бiохiмiчними показниками залишаються актуальним завданням для тзнання i розв'язку iснуючих проблем бюлогп та крюбюлоги сперми [1, 3, 6 - 10].
Отримаш об'ективш параметри оцiнки життездатностi сперматозоидов в умовах заморожування розрщжено1 сперми до -196 оС дозволять створити новi високоефективнi захиснi середовища, ям в майбутньому забезпечать максимально можливе збереження повноцiнностi !х структури i функцiй. У цьому зв'язку автори розробки сподiваються, що модифiкований спектрофотометричний метод оцшки функщонального стану сперматозоидов свiжоотриманоl, розрщжено1, еквшбровано1 та розморожено! сперми запропонованими бiохiмiчними показниками буде корисним для проведення рiзного роду дослщжень аспiрантами та науковими ствроб^никами у крiобiологiчних i бiотехнологiчних лабораторiях науково-дослiдних установ, закладiв вищо1 освгги, контролюючих органiзацiй тощо.
® Максим'юк Г.В., 2010
194
Мета роботи. За результатами проведених дослщжень впровадити у практичну та науково-дослщну роботу лабораторш крюбюлопчного i бiотехнологiчного профiлю об'ективш бiохiмiчнi параметри оцiнки функцiонального стану сперматозо!дов нативно! та крюконсервовано! сперми.
Об'ект дослщжень. Сперма, параметри бiохiмiчних показникiв оцiнки функцiонального стану сперматозоидов за активнiстю транспортних АТФ-аз нативно!, розрщжено!, еквшбровано! та розморожено! сперми.
1. Визначення концентрацп бшка. Проводять за штенсившстю перебiгу бiуретово! реакци з утворенням забарвленого у фюлетовий колiр розчину.
Для визначень застосовують:
а. вимiрювальну технiку i допомгжне обладнання - дистилятор води (скляний), спектрофотометр або фотоелектроколориметр, центрифугу, штатив для пробiрок, пробiрки (10, 20) см3, пшетки (1, 5) см3, скляш палички, фiльтрувальний папiр, флакони (300-500) см3, колби мiрнi (100-1000) см3, цилшдри мiрнi (50-500) см3;
б. реактиви i матер1алн - альбумш сироватки кровi бугая (АСКБ), ацетон, гщроксид натрiю (NaOH), дистильовану воду, Ырчанокислу мiдь (CuSO4), хлористий натрш (№аС1).
Для проведення дослiджень використовують такi реактиви i розчини.
1. Два рази перегнаний (дистильований) ацетон (С3Н6О). Молекулярна маса реактиву становить (58, 09).
2. Основний розчин альбумшу сироватки кровi бугая (АСКБ). Молекулярна маса реактиву становить (60-70) кДа. В (15-16) см3 дистильовано! води влито! у мiрний цилшдр розчиняють (40,0) мг АСКБ. Шсля повного розчинення реактиву об'ем розчину доводять дистильованою водою до (20,0) см3. Вихщна (початкова) концентрацiя АСКБ у розчиш становить (2,0) мг/см3.
3. Розчин хлористого натрiю (№С1). Молекулярна маса реактиву становить (58, 44). Розчин готують в мiрнiй колбi на (100,0) см3: (0,85) г №С1 розчиняють у 2/3 частинах об'ему колби заповнено! дистильованою водою. Шсля повного розчинення реактиву об'ем розчину доводять дистильованою водою до м^ки. Концентращя NaCl у розчиш становить (0,85) % або (0,1) М.
4. Розчин ирчанокисло!' мвд (СuSО4). Молекулярна маса реактиву становить (159,60), концентращя розчину - (1,0) % або (0,07) М.*
5. Розчин гвдрооксиду натр1ю (NаОН). Молекулярна маса реативу становить (40,00), концентращя розчину - (3,0) % або (0,75) М.*
Шдготовка проб сперми i бшка. В центрифужну пробiрку вливають (1,0) см3 свiжоотриманоl нативно! або крiоконсервовано! сперми, доливають (4,0) см3 розчину №С1. Отриману сумш охолоджують в холодильнику до температури (3-5) оС. До охолоджено! сумiшi доливають (8,5) см3 два рази перегнаного ацетону. Сумш сперми з реактивами обережно струшують, щшьно
195
Примптка. *Методика приготування розчишв СuSО4 i NаОН, враховуючи масу !х молекул, аналогiчна до розчину №С1.
закривають корками i (2-3) хв витримують в холодильнику. Охолоджеш проби сперми за 800 g центрифугують (5,0) хв. Безбшковий центрифугат вiдсмоктують пiпеткою з гумовою грушею. Залишки центрифугату в пробiрцi забирають смужками фiльтрувального паперу.
В центрифужну пробiрку з осадом бшка вливають (5,0) см3 ацетону i (5,0) см3 №С1. Утворену сумш ретельно перемiшують i центрифугують. Осад бшка декантують. До залишено! чисто! маси бшка додають (1-2) каплi розчину NаОН. Скляною паличкою осад розмшують до однорiдно! консистенцi! i доливають (1-2) см3 розчину №ОН. Вмiст пробiрки переносять в мiрну колбу на (50,0) см3 i розчином NаСl доводять до мггки. Вiд отриманого об'ему пiпеткою вщбирають (1,0) см3 розчину бiлка, який вносять в центрифужну пробiрку. До вдабранного об'ему розчину бiлка доливають (3,0) см3 розчину ШОН, (2,0) см3 розчину ^О4 i (4,0) см3 дистильовано! води. Утворену сумш ретельно перемiшують i через (5-10) хв центрифугують.
Чистий фюлетовий розчин бiурету колориметрують iз свiтлофiльтром (572) нм у кюветах об'емом (20,0) см3. В якост проби порiвняння використовують (3,0) см3 розчину №ОН i (2,0) см3 розчину СuSO4, об'ем яких доводять дистильованою водою до (10,0) см3.
Концентрацш бшка у пробах визначають за побудованою кривою калiбрувальних розчишв АСКБ № 1-7 заданих (0,50-0,05 мг/см3) концентрацш.
Побудова калiбрувального графика. З основного розчину АСКБ вихщно! (початково!) концентраций згiдно вимог наведено! таблицi 1, готують калiбрувальнi розчини № 1-7. Визначення концентраци бiлка у розчинах проводять аналопчно дослiдним пробам. За результатами визначень будують калiбрувальний графк.
Таблиця 1.
Показншкш об'ему компоненпв 1 концентрацп бшка в кал1брувальни\
розчинах АСКБ
Кал1брувальш розчини (№) Об'ем основного розчину (см3) Об'ем дистильовано!' води (см3) Концентращя бшка (мг/см3)
1 3,0 9,0 0,50
2 2,4 9,6 0,40
3 1,5 10,5 0,25
4 1,2 10,8 0,20
5 0,9 11,1 0,15
6 0,6 11,4 0,10
7 0,3 11,7 0,05
Проби розчину бiлка колориметрують спектрофотометром або фотоелектроколориметром (довжина хвилi 572 нм). Використовують кювети на (20,0) см3. Значення знайдено! величини вщповщае концентрацi! бiлка в (10,0) см3 рщини. Вказану величину множать на стутнь розведення (50,0) i знаходять концентрацiю бiлка в (1,0) см3 нативно! сперми. За отриманими
196
результатами проведених визначень будують криву к^брувального графжа вщкладаючи на ос абсцис (х) показники концентраци бiлка у розчинах АСКБ (мг/см3), на осi ординат (у) - показники шкали приладу (К). Визначену за допомогою калiбрувального графжа концентрацiю бiлка (Сб) виражають у мг/см3 нативно! (свiжоотриманоl) сперми.
2. Визначення концентрат!' неоргашчного фосфору. Проводять за iнтенсивнiстю перебiгу реакци вщновлення ейконогеном фосфорно-молiбденового комплексу з утворенням забарвленого у синш колiр розчину.
Для визначень застосовують:
а. вимiрювальну технiку i допомгжне обладнання - спектрофотометр або фотоелектроколориметр, лабораторну центрифугу, аквадистилятор, штатив для пробiрок, пробiрки (10-20) см3, пробiрки центрифужнi (5-10) см3, пшетки (1 i 5) см3 , флакони (20-50) см3 , колби мiрнi (50, 100, 1000) см3 , цилшдри мiрнi (25 i 50) см3;
б. реактиви i матерiали - бкульфгг натрiю (NaHSO3), ейконоген (1,2,4-амшонафтолсульфонову кислоту), молiбденовокислий амонiй ((КН4)6Мо7024-4Н20), арчану кислоту (H2SO4),сульфiт натрiю (Na2SO3), трихлороцтову кислоту (С13С202Н), фосфорнокислий однозамiщений калш (КН2РО4).
Для проведення дослiджень використовують такi реактиви i розчини.
1. Розчин мол1бденовокислого амошю [^Н4)6Мо7О24^4Н2О].
Молекулярна маса реактиву становить (1235,86), концентращя розчину - (5,0)% або (0,04) М. Мiрну колбу мiсткiстю (100,0) см3 на 2/3 частини об'ему заповнюють (5,0) н розчином Ырчано! кислоти (Н2SО4). В колбу вносять (50,0) г реактиву, розмшують до повного розчинення i доводять розчином кислоти до м^ки.
2. Розчин ейконогену або 1-амшо-2-нафтол-4-сульфоново*1 кислоти (С6Н^О). Молекулярна маса реактиву становить (107,12), концентращя у сум> шi розчишв - (2,0) % або (0,02) М. Дистильованою водою заповнюють 2/3 об'ему мiрноl колби мiсткiстю (50,0) см3, розчиняють (6,0) г бкульфггу натрш (NaHSO3) i додають (0,1) г ейконогену. Утворену сумш енергшно розмiшують скляною паличкою до повного розчинення ейконогену.
Окремо, в незначному об'емi дистильовано! води, розчиняють (1,2) г сульф^у натрiю (Na2SO3). Об'еми сум^ розчинiв NаНSО3 i ейконогену та розчину змiшують i доводять дистильованою водою до м^ки. Через (2-
3) години виготовлений розчин ейконогену фшьтрують. Зберiгають розчин у темному хiмiчному посудi в холодильнику за температури (3-5) оС.
3. Розчин (5,0) н мрчано*1 кислоти (Н^О4). Молекулярна маса реактиву становить (98,09), густина (р) - (1,84) г/см3. Дистильованою водою заповнюють 2/3 об'ему мiрноl колби на (1000,0) см3 i обережно вливають (140,0) см3 концентровано! Н^О4. Об'ем розчинено! кислоти у колбi доводять дистильованою водою до м^ки.
4. Розчин трихлороцтово!' кислоти (С13С2О2Н). Молекулярна маса реактиву становить (163,40), концентращя розчину - (10,0) % або (0,6) М.
197
Дистильовaною водою зaповнюють 2/3 об'ему мipноï колби та (100,0) см3. У pозчиняють (10,0) г С13С2О2Н i, тсля повного pозчинення pеaктивy, об'ем pозчинy доводять дистильовaною водою до м^ки.
5. Основний стaндapтний po34HH однозaмiщeного фосфоpнокислого кaлiю (КН2РО4). Mолекyляpнa мaсa pеaктивy стaновить (13б,09), концентpaцiя pозчинy - (0,03) М. Дистильовaною водою зaповнюють 2/3 об'ему мipноï колби та (100,0) см3 i pозчиняють (0,4389) г KK2P04. Пiсля повного pозчинення pеaктивy об'ем pозчинy у колбi доводять дистильовaною водою до м^ки. В (1,0) см3 виготовленого pозчинy мiститься (1,0) мг фосфоpy.
1з основного pозчинy готують pобочий з концентpaцiею фосфоpy (0,02) мг/см3 pозчинy. Для цього (2,0) см3 основного pозчинy вносять у мipнy колбу нa (100,0) см3. Об'ем yтвоpеного pозчинy доводять дистильовaною водою до м^ки.
Пiдготовкa дослiдноï i контpольноï npo6. У центpифyжнy пpобipкy вносять (0,5) см3 свiжоотpимaноï тативнох' aбо кpiоконсеpвовaноï спеpми, (2,0) см3 дистильовaноï води i (2,5) см3 pозчинy С13С2О2Н. Утвоpенy сyмiш pетельно пеpемiшyють. 3a умов кiмнaтноï (1б-18) оС темпеpaтypи витpимyють (10,0) xв i впpодовж (5,0) xв 3a 800 g центpифyгyють.
У пpобipкy вiдбиpaють (2,5) см3 чистого пpозоpого безбiлкового центpифyгaтy, доливaють (0,5) см3 pозчинy (NН4)бMо7О24•4H2О, (0,1) см3 pозчинy ейконогену i (0,9) см3 дистильовaноï води. 4epe3 (20,0) xв витpимyвaння сyмiшi 3a умов кiмнaтноï темпеpaтypи зaбapвлений у синiй колip pозчин фосфоpномолiбденового комплексу колоpиметpyють. В якост пpоби поpiвняння (контpоль) викоpистовyють (2,5) см3 С13С2О2Н i (1,5) см3 дистильовaноï води.
Побудовa кaлiбpувaльного rpa(l)iKa. 3гiдно з нaведеною тaблицею 2 i3 вiдiбpaниx об'емiв, a сaме: (0,25, 0,50, 0,75, 1,00 i 1,25) см3 pобочого pозчинy KK2P04 готують кaлiбpyвaльнi pозчини № 1-5.
Taблиця 2.
Покaзники об'сму компотн^в i концeнтpaцíï фосфоpу в кaлiбpувaльниx
pозчинax фосфоpнокислого килпо
Kaлiбpy-вaльнi pозчини (№) Об'ем компоненпв кaлiбpyвaльниx pозчинiв (см3) Kонцентpaцiя неоpгaнiчного фосфоpy (мкг/см )
ФKK* TXOK* MKA* ейконоген дистильо-вaнa водa
1 0,25 1,25 0,5 0,1 1,90 1,25
2 0,50 1,25 0,5 0,1 1,б5 2,50
3 0,75 1,25 0,5 0,1 1,40 3,80
4 1,00 1,25 0,5 0,1 0,15 5,00
5 1,25 1,25 0,5 0,1 0,90 б,30
^им^кл. * Ф^ - pобочий pозчин фосфоpнокислого кaлiю, TXOK - pозчин тpиxлоpоцтовоï кислоти, MKA - pозчин мол1бденовокислого aмонiю.
Kонцентpaцiя фосфоpy у виготовлениx pозчинax вiдповiдно стaновить: 1,25, 2,50, 3,80, 5,00 i б,30 мкг/см3. Kaлiбpyвaльний гpaфiк будують зa вiдклaденими нa осi оpдинaт (y) покaзникaми шкaли пpилaдy (K), a та ос
198
абсцис (х) - концентраци фосфору (мкг/см3). Проби сперми колориметрують спектрофотометром або фотоелектроколориметром. Використовують червоний свгглофшьтр (660-680) нм i кювету з шириною шару дослщно! рщини (10,0) мм. За отриманими для розчишв № 1-5 показниками будують к^брувальний графiк. Визначену концентращю неорганiчного фосфору (Сфн) виражають у мкг/см3.
3. Визначення активного транспортних АТФ-аз. Проводять за визначеними концентращями фосфору i бiлка, величина вщношень яких характеризуе iнтенсивнiсть перебiгу реакци гiдролiзу АТФ до АДФ впродовж (30) хв витримування дослiдних проб у середовищах шкубаци за (37) оС.
Для визначень застосовують:
а. вимiрювальну технiку i допомгжне обладнання - спектрофотометр або фотоелектроколориметр, рН-метр (юнометр), центрифугу лабораторну, штативи для пробiрок , пробiрки (20) см3, пшетки (1 i 5) см3, флакони (300 -500) см3, колби мiрнi (200 i 500) см3, цилшдри мiрнi (250 i 500) см3, лiйки, фiльтри;
б. реактиви i матерiали - динатрieву сiль аденозин-5'-трифосфорно! кислоти (Ci0Hi4N5Oi3P3Na2, АТФ), етиленглжольтетраоцтову кислоту (Ci4H24N2Oi0, ЕГТА), калш хлористий (KCl), кальцiй хлористий (CaCl2), магнiй хлористий (MgCl2), натрiй хлористий (NaCl), сапонiн (3-[(3-холамщопропщ)-диметиламонiй-]-1-пропансульфат, CHAPS), трихлороцтову кислоту (С13С2О2Н, ТХОК), трис-НС1, хлористоводневу кислоту (НС1).
Для проведення дослщжень використовують такi реактиви i розчини.
1. Динатрieва сiль аденозин-5'-трифосфорно!' кислоти (C10H14N5O13P3Na2, АТФ). Молекулярна маса реактиву (551,18).
2. Етиленглжольтетраоцтова кислота (C14H24N2O10, ЕГТА). Молекулярна маса реактиву (380,35).
3 Розчин трихлороцтовоУ кислоти (С13С2О2Н, ТХОК). Молекулярна маса реактиву (163,40). У мiрну колбу на (100,0) см3 вливають (50-60) см3 дистильовано! води. Доливають (10,0) см3 ТХОК i об'ем розчину доводять дистильованою водою до мiтки. Концентращя кислоти в розчинi становить (10,0) %.
4. Розчин хлористого кальцiю, безводного (СаС12). Молекулярна маса реактиву (110,99). У мiрну колбу на (10,0) см3 вливають (5-6) см3 дистильовано! води i розчиняють (12,7) мг СаС12. Об'ем розчину доводять дистильованою водою до м^ки. Концентращя СаС12 в розчиш становить (0,13) %.
5. Трис-НС1 - буферна система розчинiв № 1 i № 2.
Розчин № 1 (оксиметиламшометану) готують у мiрнiй колбi на (500) см3. У колбу вливають (250-300) см3 дистильовано! води, розчиняють (24,2) г вказаного реактиву i тсля його повного розчинення об'ем розчину доводять дистильованою водою до м^ки. Концентращя оксиметиламшометану в розчиш становить (4,8) %.
199
Розчин № 2 (хлористоводнево1 кислоти, НС1) готують iз стандартного розчину фжсаналу або самостшно. У мiрну колбу на (1000) см3 вливають (500-600) см3 дистильовано! води. Обережно доливають (82,6) см3 НС1 з концентращею (37,3) % i густиною (р) 1,185. Об'ем розчину доводять дистильованою водою до м^ки.
До (500) см3 розчину № 1 доливають (170) см3 розчину № 2. Кислотшсть (рН) виготовлено! буферно! системи розчишв становить 7,4.
6. Хлористий калш (КС1). Молекулярна маса реактиву (74,56).
7. Хлористий магнш, безводний (MgCI2). Молекулярна маса реактиву
(95,22).
8. Хлористий натрш (NaCl). Молекулярна маса реактиву (58,44).
Реакцшш та iнкубацiйнi середовища.
Середовище для вiдмивання сперматозо*1щв. У мiрну колбу на (100) см3 вливають (50-60) см3 дистильовано! води, розчиняють (702,0) мг хлористого натрш i доливають (20,0) см3 буферно! системи розчишв № 1 i 2 (рН 7,4). Об'ем виготовленого середовища доводять дистильованою водою до м^ки.
Середовище для пермеаб^шзащ!' мембран. У мiрну колбу на (100) см3 вливають (50-60) см3 дистильовано! води, розчиняють (400,0) мг сапоншу (CHAPS) i тсля повного розчинення реактиву об'ем розчину доводять дистильованою водою до м^ки. Концентращя CHAPS у розчиш становить (0,4) %.
Реакцшш середовища № 1, 2, 3. Середовище № 1 служить для визначення сумарно! активност К- i Мg2+-AТФ-аз (А1), № 2 - активност Мg2+-AТФ-ази (А2), № 3 - сумарно! активной Са2+, Мg2+- i Мg2+-AТФ-аз (А3).
Таблиця 3.
Склад, маса i об'ем реакцшних середовищ № 1, 2, 3__
Склад Маса реакгив1в (мг). Об'ем розчину, буферу, води (см3)
середовищ № 1 № 2 № 3
NaCl 876,6 - -
KCl 279,6 1398,0 1398,0
MgCl2 59,5 59,5 59,5
Розчин CaCl2 - - 2,0
Трис-HCI (рН = 7,4) 20,0 20,0 20,0
Вода дистильована до 100,0 100,0 100,0
Згiдно з наведеними у таблиц 3 вимогами в (50-60) см3 дистильовано! води, влито! у три мiрнi колби на (100) см3, розчиняють вказану кшькють вщповщних реактивiв. Пiсля !х повного розчинення об'ем реакцшних середовищ доводять дистильованою водою до м^ки.
1нкубацшш середовища № 1, 2, 3. У кожну пробiрку вносять (0,8) см3 реакцшних середовищ № 1, 2, 3, додають (2,75) мг AТФ i (0,2) см3 суспензи пермеабшзованих мембран вщмитих сперматозо!дiв. До вмкту пробiрки № 2 додатково вносять (38) мг ErTA.
200
Шдготовка проб до дослвджень. Для вщокремлення плазми вщ сперматозоидов у центрифужну npo6ipKy вносять (2,0) см3 свiжоотриманоï нативно1 або KpiOKOHcepBOBaHOï сперми, яку центрифугують впродовж (5,0) хв за (800) g. Вщокремлений супернатант зливають, а осад ресуспендують у (2,0) см3 середовища для вiдмивання сперматозоïдiв. Операцiю з вщмивання сперматозоïдiв повторюють три рази.
Для пермеабшзаци мембран до осаду сперматозовдв доливають (0,2) см3 охолодженого до (3-4) оС розчину сапоншу. Осад перемiшують гомогенiзатором i витримують впродовж (5-10) хв.
У пробiрки № 1, 2, 3 вносять (0,2) см3 осаду мембран дослiдноï проби. До осаду доливають (0,8) см3 реакцшних середовищ i додають (2,75) мг АТФ. Впродовж (30) хв дослщш проби витримують у водянш банi або термостатi за (37) оС.
Перебк реакци зупиняють охолодженим до (3-4) оС (10,0) % розчином ТХОК. До шкубацшних середовищ доливають (1,0) см3 ТХОК, вмкт пробiрок перемiшують i фiльтрують. Суспензiю вщмитих сперматозоïдiв, а саме: (0,1) см3 осаду пермеабшзованих мембран внесеного у (0,4) см3 дистильованох' води використовують для спектрофотометричного або фотоколориметричного визначення концентраци бiлка; (1,0) см3 фiльтрату - для визначення концентраци фосфору.
Визначення активност транспортних АТФ-аз проводять в шкубацшних середовищах № 1, 2, 3. Сумарну актившсть Na+, К- та Mg2+-АТФ-аз (Ai), активнiсть Mg^-АТФ-ази (А2) та сумарну активнiсть Са2+, Mg2+- i Mg2+-АТФ-аз (А3) вираховують за формулою (1). Звщси за формулою А4 = А1 - А2 (2) знаходять актившсть Na+, К-АТФ-ази, а за формулою А5 = А3 - А2 (3) -активнiсть Са2+, Mg^-АТФ-ази.
Ai, 2, 3 = 0,2 С?30 ' (1)
де, А1; 2, 3 - актившсть АТФ-аз (мкг Фн/мг бiлка ■ хв), Сфн - концентрацiя неорганiчного фосфору (мкг), Сб - концентращя бiлка (мг), 0,2 - коефщент перерахунку на мг бiлка, 30 - час гiдролiзу проби (хв).
Застосоваш для визначень реактиви мають бути квалiфiкацiï х.ч. або ч.д.а. Розчини готують самостшно або користуються набором стандартних середовищ (реактивiв). Можна використовувати шшу вимiрювальну технiку, яка за якюними характеристиками не прша за наведену.
За кiнцевий результат приймають отриману з трьох визначень середньо-арифметичну величину (M). Похибка результат визначень не повинна перевищувати ±5 %.
201
Л1тература
1. Горячковский А. М. Клиническая биохимия в лабораторной диагностике / А. М. Горячковский. - Одесса: Экология, 2005. - 607 с.
2. ГОСТ 20909.3-75 - ГОСТ 20909.6-75. Сперма быков неразбавленная: методы испытаний. - Введ. 19. 09. 75. М. : [Б. и.], 1975. - 50 с.
3. Диагностика мужского бесплодия (методические рекомендации) / Минздрав. УССР ; [И. Ф. Юнда, Ю. И. Кушнирук]. - К. : [Б. и.], 1973. - 24 с.
4. Мешкова Н. П. Практикум по биохимии животных / Н. П. Мешкова, С. Е. Северин. - М. : Советская наука, 1950. - С. 168-169.
5. Фiзiолого-бiохiмiчнi методи дослщжень у бюлогп, тваринництвi та ветеринарнш медициш: довщник / 1н-т бюлогп тварин УААН, Науково-методичний центр '^зюлопя тварин" ; [Л.В. Андреева та ш.]. Вид. 3-те, переробл. i доповн. - Львiв: [Б. в.], 2004. - 401 с.
6. Asch R. H Gamete physiology /Asch R. H., Balmaceda J. P., Johnston I. -Norvell, USA, 1990. - 354 p.
7. Esmann M. ATPase and phosphatase activity of Na-K-ATPase: Molar and specific activity, protein determination. / M. Esmann. Methods Enzymol. - 1988. - V. 156 (Part P) - P. 105 - 115.
8. Lowry O. H., Rosebrough J. H., Farr A. L. and Randall R. J. Protein measurement with Folin phenol reagent./ O. H. Lowry et al. J. Biol. Chem. - 1951. -V.193. - P. 265 - 275.
9. Pradip K. Sarkar A quick assay for Na-K-ATPase specific activity / K. Pradip, A. Sarkar. Z. Naturforsch. - 2002. -V. 57c. - P.562 - 564.
10. World Health Organisation: WHO Laboratory Manual for the Examination of Human Semen Cervical Mucus Interaction. / Cambridg: University press, 1992. - P. 3 - 27.
Summary Maksymyuk H.V. PhD
e-mail: hanna. maksymjuk@gmail. com Lviv National Medical University Institute of Agriculture and Stock-Breeding of Western Region UAAS MODIFIED AND STANDARDIZED METHOD OF DETERMINING TRANSPORT ATP-ASES ACTIVITY BY PROTEIN AND PHOSPHORUS CONCENTRATION IN SEMEN
Laboratories with cryobiological profile and biotech research institutions, universities, regulatory organizations, etc. are offered a modified and standardized method of determining the activity of transport ATP-ases which allows to objectively assess the level offunctional full-value of native sperm and cryoconserved sperm.
Key words: sperm, concentration of protein and phosphorus, the activity of ATP-ases, sperm viability.
Стаття надшшла до редакцИ 23.03.2010
202
