CC BY
32КЛІТИННА БІОФІЗИКА
CELL BIOPHYSICS
Фізика живого, Т. 19, No 1, 2011. С. 10-15. ©Максим’юкГ.В., Максим’юкВ.М.
УДК 612.616.2.015.7
СТАНДАРТИЗОВАНА МЕТОДИКА ВИЗНАЧЕННЯ КОНЦЕНТРАЦІЇ І ПЕРЕМІЩЕНОЇ КІЛЬКОСТІ Са2+, №+, К+ У СИСТЕМІ "КЛІТИНА-СЕРЕДОВИЩЕ"
*Макшм’юк Г.В., 2Максим’юк В.М.
Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького МОЗ України,
hanna.maksymjuk@gmail.com 2Інститут землеробства і тваринництва західного регіону НААН України, Львів-Оброшино, Україна
Надійшла до редакції 27.03.2011
Для об’єктивного контролю за функціональним станом ізольованих клітин (сперматозоїди) пропонуємо розроблену і стандартизовану методику визначення динаміки концентрації та переміщеної кількості (вмісту) іонів макро- і мікроелементів у системі "клітина-середовище" методом полуменевої і/або атомноадсорбційної спектрофотометрії.
Ключові слова: еякуляти, спермальна плазма, сперматозоїди, кальцій, калій, натрій, концентрація і переміщена кількість іонів, полуменева фотометрія.
ВСТУП
Відомо, що об’єктивний аналіз "реакції-відповіді" біологічних систем на негативну або позитивну дію екстремальних чинників впливу може бути забезпечений лише за умови експериментально визначених вірогідних показників змін їх нормального стану [1, 2]. Однак, сучасні методи оцінки функціонального стану клітин не завжди відповідають вимогам практики. Тому впровадження нових методичних прийомів досліджень дозволить об’єктивно оцінювати, корегувати і розробляти ефективні способи і засоби захисту життєздатності клітин за екстремальних умов.
Оскільки об’єктивна оцінка рівноваги вмісту Са2+, №+, К+ у системі "клітина-середовище" [10] є важливою частиною активного і пасивного процесу регуляції балансу іонів макро- та мікроелементів, то ми сподіваємося, що розроблена методика визначення параметрів концентрації іонів на різних етапах кріоконсервації буде корисною для оцінки і корекції функціонального стану ізольованих клітин, дозволить розробити нові способи ефективного захисту їх життєздатності.
Мета роботи - впровадити у науково-дослідну і практичну роботу лабораторій, установ кріобіологічного та біотехнологічного профілю, вищих закладів освіти, контролюючих організацій, тощо визначення динаміки показників концентрації (вмісту) іонів макро- та мікроелементів в якості об’єктивних параметрів контролю за функціональним
станом ізольованих клітин у системі "клітина -середовище".
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
Об’єктом наших досліджень є динаміка концентрації і переміщеної кількості Са2+, К+, Ка+ у системі "сперматозоїди - спермальна плазма" за умов кріоконсервації сперми методом полуменевої фотометрії.
Для проведення визначень застосовують такі засоби вимірювальної техніки, допоміжне обладнання, реактиви і матеріали, як фотометр полуменевий; мікроскоп біологічний; дозатор рідин автоматичний А-2; ваги аналітичні; термостат повітряний або шафа сушильна; гомогенізатор; вода дистильована; центрифуга лабораторна;
глутаральдегід (С5Н803); кальцій вуглекислий (СаС03); натрію хлорид (№С1); калію хлорид (КС1); кислота соляна (НС1); кислота сірчана (Н^04); калій двохромовокислий (К2Сг207); спирт етиловий (С2Н5ОН); натрію цитрат (2,9% нейтралізований розчин С6Н507Ка3-5Н20); азот рідкий; пробірки центрифужні або флакони місткістю 5-6 см3 і 13-14 см3; колби мірні 0,5 і 1,0 дм3; стакани хімічні 25 і 50 см3; піпетки мірні 1,0 і 0,1 см3; скельця покривні; скельця предметні; палички скляні; вата; лейкопластир; балони газові для повітря, пропан-бутанової суміші, ацетилену; термоси Дюара; папір для етикеток; папір фільтрувальний лабораторний; пластини фторопластові; пінцети; ножиці; ванна для рідкого азоту.
Всі реактиви мають бути кваліфікації х.ч. або ч.д.а. Дозволяється використовувати інші засоби вимірювальної техніки, допоміжне обладнання, реактиви і матеріали, які за якістю та характеристиками не гірші за наведені.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ Порядок виконання робіт.
1. Виготовлення запасних, основних і робочих розчинів. Для приготування запасних і основних розчинів, а також концентраційних рядів робочих розчинів використовують солі СаС03, №С1 і КС1, які висушують до постійної маси у сушильній шафі (термостаті) за температури (110-120)оС. Контроль за зміною маси солей здійснюють на аналітичних вагах. Висушені солі зберігають у скляному, з притертим корком, хімічному посуді.
1.1 Запасні розчини. Готують з наважки солей, маса яких для СаС03 становить 2,497 г, №С1 -1,907 г, КС1 - 2,542 г. Кожну окремо взяту наважку засипають у колбу місткістю 1,0 дм3.
Солі №С1 і КС1 розчиняють у 100-200 см3 бідистильованої води; СаС03 - в 20 см3 НС1, розведеної у співвідношенні 1:1 бідистильованою водою. Об’єм запасних розчинів доводять водою до мітки 1,0 дм3. При цьому кінцева концентрація Са2+, №+ і К+ у них становить 1000 мг/дм3.
1.2 Основні розчини. З колби місткістю 1,0 дм3 відбирають 50 см3 запасного розчину. Відіб-раний розчин переносять у колбу місткістю 0,5 дм3 і до мітки 0,5 дм3 доливають бідистильованою водою. Після проведених маніпуляцій концентрація Са2+, Ка+, К+ в основних розчинах становить 100 мг/дм3.
1.3 Робочі розчини. З основних розчинів готують серію робочих розчинів, концентрація Са2+, №+, К+ у яких становить 50, 20, 10, 5, 2 і 1 мг/дм3 (таблиця 1).
Для визначення концентрації Са2+, Ка+, К+ у робочих розчинах і дослідних пробах використовують
металеві інтерференційні світлофільтри (Са2+ - 621 нм, Ка - 588 нм, К - 767 нм). Показник витрат повітря фіксують на рівні 250 дм3/год, ацетилену - 40 дм3/год, пропан-бутанової суміші - 13-18 дм3/год. Полуменевий фотометр вмикають в електромережу і через 10-15 хв після стабілізації роботи вимірювальної системи приступають до юстування шкали приладу.
Капіляр подачі розчинів (проб) вводять у стакан з
бідистильованою водою, запалюють газовий пальник і
виставляють стрілку гальванометра на нульову
позначку. Місцезнаходження ручки переведення
діапазонів [(0-10) поділок] чутливості приладу -
залежить від концентрації Са2+, К+, К+ у робочих
розчинах. Максимальне значення шкали
^ .. ••• 2+ гальванометра для найвищої концентрації Са
становить 8 mv, Ка+ - 120 mv, К+ - 100 mv.
Калібрувальні криві будують за визначеними у робочих розчинах концентраціями Са2+, Ка+, К+. На графік наносять середні величини показників шкали приладу, отримані за результатами двох вимірювань. Вимірювання проводять від розчину № 6 до № 1. Покази приладу записують у лабораторний журнал і будують калібрувальні криві.
Покази шкали гальванометра, діапазон якої для Са2+ становить 0-8 му, Ка+ - 0-120 му, К+ - 0-100 мv, наносять на вісь ординат (у), а на вісь абсцис (х) -концентрацію Са2+, Ка+, К+ в діапазоні (0-100) мг/дм3. За потреби крайню позначку максимальної концентрації іонів у розчинах 100 мг/дм3 можна міняти на 50, 20, 10 або 5 мг/дм3 Са2+, Ка+, К+, а саме: 100, 50, 20, 0 на 50, 20, 10, 0; 20, 10, 5, 0; 10, 5, 2, 0 чи
5, 2, 1, 0 (рис. 1).
Таблиця 1
Схема приготування робочих розчинів
Робочі розчини*, № Об’єм основного розчину, см3 Об’єм бідистильованої води, см3 Концентрація робочих розчинів, мг/дм3
1 250 250 50
2 100 400 20
3 50 450 10
4 25 475 5
5 10 490 2
6 5 495 1
*Робочі розчини використовуються до часу появи у колбах осаду.
Максим’юк Г.В1, Максим’юк В.М.
Рис. 1. Схема побудови калібрувальних кривих для визначення концентрації Са2+, №+, К+.
3. Визначення концентрації Са2+, ^+, К+. Свіжоотриману нативну (нерозріджену) сперму об'ємом 0,5 см3 переносять у центрифужну пробірку (флакон) і, з метою фіксації білків акросоми та цитоплазматичної мембрани сперматозоїдів (поперечне зшивання молекул), додають одну краплю 2%-вого розчину глутаральдегіду. Фіксатор змішують зі спермою, витримують впродовж 10-15 хв і центрифугуть протягом 5 хв за 800 g. Після зупинки центрифуги спермальну плазму відокремлюють від клітин.
Автоматичним дозатором рідин у центрифужні пробірки (флакони) доливають по 4,5 см3 бідистильованої води. Відцентрифуговані клітини гомогенізують до дрібнодисперсної однорідної суспензії, спермальну плазму ретельно перемішують і визначають концентрацію Са2+. Результати вимірювань заносять у лабораторний журнал.
Для визначення концентрації К+, К+ до суспензії клітин додають 5 см3, а до спермальної плазми - 10 см3 бідистильованої води. У додатково розведених пробах спочатку визначають концентрацію Ка , потім
- К+. Якщо стрілка гальванометра виходить за межу максимального значення шкали приладу (Ка+ - 120 ту^ К+ - 100 ту), то проби розводять, доливаючи по 5 см3 бідистильованої води.
Кінцеву концентрацію іонів у дослідних пробах знаходять за калібрувальною кривою графіку, яку будують за знятими зі шкали приладу показами концентрацій робочих розчинів. Для подання експериментальних даних за міжнародною системою одиниць (СІ), визначену у мг/дм3 концентрацію іонів можна перерахувати у ммоль/дм3 (мМ), а саме: враховуючи ступінь розведення проб, результати
вимірювань перемножують на коефіцієнти перерахунку (Са2+ - 0,02495, К+ - 0,02597, Ка+ -0,0435).
При встановленні ступеня впливу етапу еквілібрації сперми на гомеостаз іонів у системі "клітина-середовище" від залишених за температури 2-4 оС на 4 год в холодильнику проб об’ємом 2,4 см3 відбирають 1,0 см3 розрідженої сперми. Операції з визначення концентрації Са2+, Ка+, К+ у плазмі та сперматозоїдах повторюють за наведеною вище схемою. Рухливість сперматозоїдів у пробах (бал, %) контролюють методом світлової мікроскопії, концентрацію (млрд/см3) - методом
фотоелектроколориметрії.
4. Технологія кріоконсервації сперми (приклад). Еквілібровану сперму об’ємом 1,0 см3 заморожують на розміщеній над ванною з рідким азотом фторопластовій пластині. На пластину наносять 0,1,
0,2 або 0,5 см3 досліджуваної проби, отримуючи 10, 5 або 2 гранули, відповідно. Гранули зберігають не менше двох днів у термосах Дюара, заповнених рідким азотом, за температури міноус 196 С3; розморожують за температури 38±0,5 оС в 1,0 см 2,9%-вого розчину нейтралізованого цитрату натрію. Після зникнення останнього кристалика льоду у пробах знову визначають концентрацію Са2+, Ка+, К+ і рухливість сперматозоїдів.
4.1 Визначення переміщеної кількості Са2+, ^+, К+.
4.1.1 Визначення абсолютних показників переміщеної кількості Са2+, ^+, К+. Оцінку змін рівноваги вмісту (гомеостазу) іонів у системі "клітина-середовище" проводять у три етапи. Перший
- спрямований на визначення концентрації іонів. На розрідженої (х2), еквіліброваної (х3) і деконсервованої даному етапі досліджень визначають концентрацію (Х4) сперми (таблиця 2).
Са2+, №+, К+ у сперматозоїдах із свіжоотриманої (х1),
Таблиця 2
Концентрація іонів у сперматозоїдах при заморожуванні сперми, мМ
Іони Сперма
свіжоотримана розріджена еквілібрована деконсервована
Са2+ 1,27 1,53 1,72 0,94
№+ 19,02 15,43 15,15 41,36
К+ 14,99 13,99 13,89 3,77
хі х2 х3 х4
* ...
Хі, Х2, Х3, Х4 - концентрація іонів на етапах кріоконсервації сперми.
Таблиця3
Вплив умов кріоконсервації на гомеостаз Са2+, №+, К+, мМ
Абсолютні показники впливу:
Іони Прямий Сумарний
розрідження еквілібрації деконсервації кріоконсервації
С р + + 0,26 + 0,19 - 0,78 - 0,33
№+ - 3,59 - 0,28 + 26,21 + 22,34
К+ - 1,00 - 0,10 - 10,12 - 11,22
А'п = х1-х2* А 2 * Ап = х3-х2 А 3 * Ап = х3-х4 Ас = х4-х1*
х2-хь х3-х2, х4-х3 - переміщена кількість Са2+, №+, К+ у сперматозоїди (+) та вихід з них (-) після розрідження, еквілібрації і деконсервації сперми; х4-х1 - за повний цикл кріоконсервації (свіжоотримана ... деконсервована);
Ап'3 - абсолютні показники прямого, Ас - сумарного впливу умов кріоконсервації.
Таблиця 4
Вплив умов кріоконсервації на гомеостаз Са2+, ^+, К+, %
Відносні показники впливу:
Іони Прямий Сумарний
розрідження еквілібрації деконсервації Кріоконсервації
С р + + 78,8 + 57,6 - 236,4 - 26,0
№+ - 16,1 - 1,3 + 117,3 + 117,5
К+ - 8,9 - 0,9 - 90,2 - 74,9
В'п = (х9-х,У100* В;; =(х3-х9)-100* В3п=(х4-х3)-100* Вс = (х4-х,)-100*
х4-х1 х4-х1 х4-х1 х1
(х2-х1), (х3-х2), (х4-х3)- переміщена кількість Са2+, №+, К+ у сперматозоїди (+) та вихід з них (-) після розрідження, еквілібрації і розморожування сперми; х4-х1 - за повний цикл кріоконсервації (свіжоотримана ... деконсервована) сперми;
в'п'3 - відносний показник прямого, Вс -сумарного впливу умов кріоконсервації.
На другому етапі визначень (таблиця 3) знаходять абсолютні показники (мМ) переміщеної кількості іонів у сперматозоїди або виходу з них (антипорт, симпорт), а саме: після розрідження (х2-хі),
еквілібрації (х3-х2), деконсервації (х-х3) та за повний цикл (Х4-Х1) кріоконсервації (свіжоотримана деконсервована) сперми.
Для цього від більшої величини визначеного показника віднімають меншу і встановлюють абсолютну величину переміщеної кількості іонів (мМ) та оцінюють особливості їх переміщень у системі
"клітина-середовище". Для зручності аналізу даних вхід іонів у клітину позначають знаком плюс (+), вихід з них - знаком мінус (-).
Приклад розрахунків. Визначені згідно з формул:
Ап= 1,53-1,27, А;п =1,72-1,53, А^ = 1,72 - 0,94,
Ас = 1,27 - 0,94
абсолютні показники переміщеної кількості (вмісту) Са2+ після розрідження, еквілібрації, деконсервації (прямий вплив) та від отримання до
Максим’юк Г.В1, Максим’юк В.М.
деконсервації сперми (сумарний вплив) становлять +0,26, +0,19, -0,78 та -0,33 мМ, відповідно.
Аналогічно обчислюють переміщену кількість Na+ і К+.
4.2.2 Визначення відносних показників
переміщеної кількості Са2+, Na+, К+. Третій етап
аналізу визначених показників концентрації іонів
спрямований на встановлення прямого впливу умов • • • f\ 2+ кріоконсервації і кріопротекторів на гомеостаз Са ,
Na , К у системі "клітина-середовище" (таблиця 4).
Вплив умов кріоконсервації на рівновагу вмісту (гомеостаз) іонів виражають відносними (відсотковими) величинами. Кількість іонів, що переміщаються (вхід-вихід) у системі "клітина-середовище" від одержання до деконсервації сперми (х4-х1), приймають за 100%, переміщену на відповідному етапі технологічного циклу кількість (х2—х1, хз—х2, х4-хз) - за х. Із складених рівнянь знаходять ступінь прямого впливу на сперматозоїди кожного наступного етапу кріоконсервації щодо попереднього.
Визначають також сумарний вплив всіх етапів кріоконсервації на гомеостаз іонів. Початковий рівень концентрації іонів у сперматозоїдах свіжоотриманих еякулятів (х1) приймають за 100%-ів, переміщену кількість іонів (х4-х1) - за х і знаходять ступінь впливу умов кріоконсервації (концентрація кріопротекторів, температура, осмотичний тиск, рН захисних середовищ, тощо) на гомеостаз іонів у спермі.
Приклад розрахунків. Визначені згідно з формул:
Ві _ 0,26 100 В2 _ 0,19 100 _ 0,78 100
п 0,33 ’ п 0,33 ’ п _ 0,33 ’
В _ 0,33100 c _ 1,27
відносні показники переміщеної кількості (вмісту) Са2+ після розрідження, еквілібрації, деконсервації (прямий вплив) та від отримання до деконсервації сперми (сумарний вплив) становлять 78,8%, 57,6%, мінус 236,4% та мінус 26,0%-ів, відповідно. Аналогічно обчислюють переміщену кількість Na+ і К+.
За кінцевий результат приймають отриману з трьох
визначень середньоарифметичну величину ( M ). Похибка результатів визначень не повинна перевищувати ±5 %.
ВИСНОВКИ
Визначені показники свідчать, що із сперматозоїдів у середовище для деконсервації сперми (2,9%-вий нейтралізований розчин цитрату натрію) виходить 0,33 мМ Са2+ і 11,22 мМ К+, що
становить 25 % і 75 % їх початкового вмісту, але із середовища у сперматозоїди входить 22,34 мМ Na , або 117 % їх початкового вмісту 19,02 мМ у сперматозоїдах. Це означає, що після розрідження сперми антипортне переміщення у сперматозоїди 79 % вмісту Са2+ витісняє з клітин 16% Na+ і 9% К+. Впродовж еквілібрації сперми інтенсивне переміщення Са2+ (58%) у сперматозоїди триває. Однак вихід Nа+ і К+ з клітин несуттєвий. Після деконсервації гранул величина переміщеної кількості Са2+, N+, К+ є найбільшою. У сперматозоїди переміщається 117 % вмісту Nа+, який витісняє з клітин у середовище 236 % вмісту Са2+ і 90 % -ів К+.
Література
1. Юрченко Т.Н., Козлова В.Ф., Скорняков Б.А. и др. Влияние криопротекторов на биологические системы -Киев: Наук. думка, 1989. - 240с.
2. Грищенко В.И., Паращук Ю.С., Дахно Ф.В., Юрченко Г.Г. Криобиология и проблема бесплодия -Киев: Наук. думка, 1990. - 136с.
3. Линник Т. П., Грищенко В. И., Артеменко А. Б., Терещенко А. В. Влияние осмотичности криозащиты среды на сохранность спермиев петуха при криоконсервировании // Проблемы криобиологии. -
2000. - № 2. - С. 86-93.
4. Цуцаева А. А., Микулинский Ю. Е., Высеканцев И. П. и др. Холодовой стресс и биологические системы. - Киев: Наук. думка, 1991. - 176с.
5. Aalseth E.P., Saacke R.G. Morphological change of the acrosome on motile bovine spermatozoa due to storage at 4 °C //J. Reprod. Fert. - 1985. - Vol.74. - P. 473-478.
6. Cerolini S., Maldjian A., Pizzi F., Gliozzi T.M. Changes in sperm quality and lipid composition during cryopreservation of boar semen //Reproduction. - 2001. - Vol.121.
- P. 395-401.
7. Gamete physiology / ed. by Asch R.H., Balmaceda J.P., Johnston I. - USA: Norvell, 1990. - 354 p.
8. Keel B.A., Webster B.W., Roberts D.K. Effects of cryopreservation on the motility characteristics of human spermatozoa //J. Reprod. Fert. - 1987. - Vol. 81.
- P. 213-220.
9. Kliesh S., Cooper T.G. Semen analysis: spermiogram according to WHO criteria //Urologe A. - 2008. - Vol. 1548. - P. 1550-1554.
10. Mortimer Sh. T. Effect of medium on the kinematics of frozen-thawed ram spermatozoa //Reproduction. - 2004. -Vol. 127. - P. 285-291.
11. Ren D., Navarro B., Perez G. et all A sperm ion channel required for sperm motility and male fertility //Natute. -
2001. - Vol.413. - P. 603-609.
12. Watson P.F. The causes of reduced fertility with cryopreserved semen //Animal reproduction science. -2000. - Vol. 60. - P. 481-492.
СТАНДАРТИЗИРОВАННАЯ МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ И ПЕРЕМЕЩЕННОГО КОЛИЧЕСТВА Са2+, Na+, К+ В СИСТЕМЕ "КЛЕТКА-СРЕДА"
Максимьюк Г. В., Максимьюк В. М.
С целью объективного контроля за функцональным состоянием изолированных клеток (сперматозоиды) предлагаем разработанную и стандартизированную методику определения динамики концентрации и перемещенного количества (содержания) ионов макро- и микроэлементов в системе "клетка-среда" методом пламенной и/или атомноадсорбционной спектрофотометрии.
Ключевые слова: эякулят, спермальная плазма, сперматозоиды, кальций, калий, натрий, концентрация и содержание перемещённых ионов, пламенная фотометрия.
THE STANDARDIZED METHOD OF DETERMINING THE CONCENTRATION AND NUMBER OF DISPLACED AND Са2+, Na+, К+ IN THE "CELL-ENVIRONMENT" SYSTEM
Maksymjuk H. V., Maksymjuk V. M.
For an objective control of the functional state of isolated cells (spermatozoa) we offer a developed and standardized method for determining the dynamics of concentration and the amount of displaced macro- and microions in the "cell-environment" system by flame and/or atom absorption spectrophotometry.
Key words: ejaculate, sperm plasma, spermatozoa, calcium, potassium, sodium, concentration and amount of displaced ions, flame photometry.
