МОДИФИКАЦИЯ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ГРИБА FUNALIA TROGII - ПРОДУЦЕНТА ЛАККАЗ Текст научной статьи по специальности «Нанотехнологии»



I

SCIENCE TIME

I

МОДИФИКАЦИЯ питательной среды гриба FUNALIA TROGП - ПРОДУЦЕНТА ЛАККАЗ

Лебеда Михаил Вячеславович, Марковин Роман Юрьевич, Кузнецова Елизавета Николаевна, Санкт-Петербургский государственный технологический

институт (технический университет),

г. Санкт-Петербург

E-mail: lebeda-misha@yandex.ru

Аннотация. В данной статье была проведена модификация питательной среды гриба Funalia trogii. По резултатам эксперимента был поведен математический анализ полученных данных.

Ключевые слова: лакказа, фермент, активность, модификация, Funalia trogii, индукторы, медь, зеленый чай, виноградные гребни.

Лакказа (пара-дифенол: кислород оксидоредуктаза) принадлежит к классу оксидоредуктаз, участвует в катализе реакций окисления орто- и пара-дифенолов, полифенолов, аминофенолов, полиаминов, лигнинов, а также определенных неорганических ионов с параллельным восстановлением молекул кислорода до воды [1].

Так, данный фермент применяется при изготовлении современных экологичных древесноволокнистых плит [2]; в целлюлозно-бумажной промышленности для удаления лигнина из древесины; в разработке биосенсоров для определения фенольных соединений; в текстильной промышленности для экологически чистого отбеливания тканей; в пищевой промышленности при удалении следов кислорода из продуктов питания с целью продления срока годности; для биоразложения ксенобиотиков и отравляющих веществ [3] и некоторых других областях.

Однако для использования фермента в промышленных оборотах требуется отработать методику его получения. Для этого нами была произведена модификация питательной среды гриба Funalia trogii.

Активность определялась в нативном растворе культуральной жидкости спектрофотометрически при длине волны 410 нм, на спектрофотометре APEL PD-303 (Япония). В качестве хромогенного субстрата используется 0,01 М раствор пирокатехина в 0,1 М цитратном буфере, рН 4,96. Кювету толщиной 10 мм заполняют 100 мкл культуральной жидкости, 3,4 мл раствора субстрата и определяют изменение оптической плотности за 1 мин. в течении 15 мин [4].

| SCIENCE TIME Щ

В качестве единицы оксидазной активности (Ед/мл) принимают увеличение оптической плотности реакционной смеси при 410 нм за 1 мин, в пересчёте на 1 мл раствора культуральной жидкости.

Для расчета общей активности фермента использовалась формула(1)[5]:

ДДИ(мл)1000

(1)

(") = \мл/

£(л,моль*см-1)-1'(мл)-сСс)

где ДD - измеренное значение, характеризующее ферментативную активность (изменение оптической плотности);

V - объём реакционной смеси, в которой протекает ферментативная реакция, мл;

1000 - фактор пересчета л в мл в коэффициенте экстинкции;

в - молярный коэффициент поглощения, л^мольхм-1;

V - объём раствора фермента, мл;

t - время, по прохождении которого фиксируется изменение измеряемого параметра.

Для каждого измерения коэффициент экстинкции в = 740 (л^мольхм-1), изменение времени равно 1 минуте.

Для подготовки культуры к эксперименту образец из коллекции кафедры ТМС СПБГТИ(ТУ) в пробирке со скошенным агаром был пересеян в колбы Эйленмейлера с керамическими бусми.

В качестве объекта исследования были лакказы содержащиеся в культуральной жидкости полученной в ходе глубинного культивирования штамма гриба-продуцента ГппаНа trogii ТИ035. Культивирование проводилось в лабораторных условиях глубинным методом на глюкозо-пептонной среде (табл. 1).

За основу бралась среда следующего состава: глюкоза - 10,0 г/л; пептон-3,0 г/л; КН2РО4 - 0,6 г/л; К2НР04-0,4 г/л; MgSO4 - 0,5 г/л; М^*7Н20 - 0.05 г/ л; ^04*7Н20 - 0.0001 г/л; FeSO4*7H2O - 0.0005 г/л.

Из ранее проведенных исследований были получены следующие оптимальные концентрации данных веществ: чай - 1 г/л; виноградные гребни -2 г/л; ионы меди - 3000 мкмоль/л.

Поскольку различные факторы могут оказывать взаимное воздействие друг на друга мною были выбраны следующие количества компонентов:

- 0.8, 1 и 1.2 г/л, для чая;

- 1.8, 2 и 2.2 г/л, для виноградных гребней;

- 2250, 2750 и 3250 мкмоль/л, для ионов меди.

Для проведения анализа данных был выбран метод Бокса, в соответствии с которым были выбраны представленные ранее концентрации индукторов. Метод подразумевает наличие каждого из факторов в 3-х концентрациях: (+) - высокая, (-) - низкая, (0) - средняя (центральная).

Обозначения элементов таблиц проведённых опытов (табл. 2):

1 SCIENCE TIME 1

х0 - влияние общих факторов не затрагиваемых экспериментом, таких как температура, рН, давление и тд;

х1 - влияние первого фактора (ионы меди);

х2 - влияние второго фактора (измельчённый зелёный чай);

х3 - влияние третьего фактора (измельчённые сухие виноградные гребни);

х12, х13, х23, х123- совместное влияние факторов;

Таблица 1

Данные полученные в ходе двухфакторного эксперимента смеси индукторов Чай-Гребни на общую оксидазную активность при глубинном культивировании штамма ГппаНа trogii

№ Xo Xi X2 Хз X12 X13 X23 X123 Активность, Ед/мл

1 + + + + + + + + 2,29

2 + + + - + - - - 25,78

3 + + - + - + - - 26,72

4 + + - - - - + + 0

5 + - + + - - + - 14,74

6 + - + - - + - + 39,31

7 + - - + + - - + 26,32

8 + - - - + + + - 23,64

9 + 0 0 0 / / / / 28,53

10 + 0 0 0 / / / / 32,01

По результатам эксперимента было определенно, что наибольшая активность наблюдается в образцах с увеличенным содержанием чай и уменьшенным содержанием виноградных гребней и ионов меди. Помимо этого было отмечено, что колбы с усредненной концентрацией индукторов также показали высокую активность.

Для анализа полученных данных был произведен расчет критериев Стьюрента для проведения оценки значимости (табл. 2).

Таблица 2

Результаты математического анализа

Фактор Критерий Стьюрента

X0 4,64

X1 1,43

X2 0,18

X3 0,55

X12 0,08

X13 0,73

X23 2,26

X123 0,61

1 SCIENCE TIME 1

Проверку значимости коэффициентов (t=3.18) прошел только X0. Поскольку данный коэффициент отвечает за внешние, неконтролируемые нами условия и факторы, можно сделать вывод что мы находимся в зоне максимума при данных внешних условиях, для последующей оптимизации среды нужно проводить трехфакторный эксперимент по методу Бокса-Бенкена.

Литература:

1. Осипов, Е. М. Структурно-функциональная характеристика хлорид-резистентной лакказы из Botrytis aclada: специальность 03.01.04 «Биохимия»: диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук / Осипов Евгений Михайлович ъ; Институт биохимии им. А.Н. Баха. - Москва, 2016. - 108 с.

2. Теоретические основы биотехнологии древесных композитов. Книга 2. Ферменты, модели, процессы / А.В. Болобова, А.А. Аскадский, В.И. Кондращенко, М.Л. Рабинович. - Москва: Наука, 2002. - 344 с.

3. Биология - наука XXI века. Сборник тезисов конференции молодых ученых, 16-21 апреля 2012 / 16-я Международная Пущинская школа. - Пущино, 2012. - 445 с.

4. Клепиков А.А. Скрининг и изучение базидиальных грибов в качестве продуцентов лакказ / А.А. Клепиков, М.М. Шамцян // Известия СПбГТИ (ТУ). -2014. - № 23 (49). - С. 39-42.

5. Полыгалина Г.В. Определение активности ферментов. / Г.В. Полыгалина, Л.В. Римарева, В.С. Чередниченко. - Москва, 2003. - С. 375.