CC BY
7
закрытые капроновой сеткой пробирки с самцами линии Д-32.
Данные, представленные в таблице, свидетельствуют о том, что в результате проведенных экспериментов не выявлено достоверное повышение спонтанного мутирования у дрозофилы при воздействии изучаемых веществ.
Следовательно, в описанных условиях опытов препараты не вызывают наследственных изменений в Х-хромосоме половых клеток плодовой мушки, т. е. они не оказывают мутагенное действие на дрозофилу.
Л итература
1. Бочков И. П., Шоам Р. Я. и др.//Генетика. — 1975. — Т. 11, № 10, —С. 156—169.
2. Гжегоцкий М. И., Комиссарова Л. А.. Ребрин В. Г. // Гигиена населенных мест. — Киев, 1984. — Вып. 23. — С. 53—55.
3. Демченко С. И., Авруцкая Т. Б. и др. // Европейское об-во по мутагенам внешней среды: Ежегодная конф., 14-я: Тезисы докладов.— 1984. — С. 45—46.
4. Журков В. С.// Медицинские проблемы охраны окружающей среды. — М., 1981. — С. 36—42.
5. Курччный А. Я.//Всесоюзный съезд генетиков и селекционеров, 4-й: Тезисы докладов. — Кишинев, 1982.— Ч. 4, —С. ИЗ.
6. Пилинская М. А. // Гигиена, токсикология пестицидов в клинике отравлений. — Киев, 1967. — Вып. 5. — С. 305— 311.
Поступила 12.06.87
УДК 616-018.1-008.931:577.1.52.|]-02:615.285.7-092.9
Л. П. Сычева, Н. П. Бурмантова, В. С. Журков
МОДИФИКАЦИЯ МУТАГЕННОГО ЭФФЕКТА ЦИКЛОФОСФАМИДА ПРИ ДЛИТЕЛЬНОЙ ИНДУКЦИИ СИСТЕМЫ МИКРОСОМАЛЬНЫХ МОНООКСИГЕНАЗ
НИИ общей и коммунальной гигиены им. Л. Н. Сыснна АМН СССР, Москва
Многочисленные соединения, загрязняющие окружаю-ищо среду, не являясь мутагенами или канцерогене«*; могут-тгодпфнцнровать эффекты генотоксических агентов, что подтверждается экспериментальными [2, 3] и эпидемиологическими исследованиями [7]. Одним из основных механизмов модификации является изменение системы метаболизма мутагенов, в частности системы микросомаль-ных монооксигеназ (СММ). Ранее [2] в подострсм эксперименте показано, что усиление цитогенстпческого эффекта циклофосфамида возможно даже на фоне минимальной статистическг значимой индукции СММ.
Целыо настоящей работы явилась оценка мутагенного эффекта циклофосфамида при длительной индукции СММ фенобарбиталом в условиях хронического эксперимента.
Эксперименты проведены нз 171 самце неинбредных крыс массой 200—250 г. Животных на протяжении всего опыта содержали в пластиковых клетках на стандартной диете.
В качестве мутагена применяли циклофосфамид («Jenapharm», ГДР) — хорошо изученный препарат, относящийся к группе алкилнруюших соединений, мутаген непрямого действия, активность которого определяется метаболитами, образующимися при участии СММ.
В качестве модификатора применяли фенобарбитал натрия («Farmacon». ЧССР) — классический индуктор СММ, не обладающий мутагенной активностью в соматических клетках млекопитающих [11].
Крысы получали питьевую воду с фенобарбиталом в концентрациях 8, 40 и 200 мг/л, что соответствовало средним дозам 0.4, 2 и 10 мг/кг. Состояние СММ оценивали в группах животных (по 6—8 крыс на группу), получавших индуктор в течение 5, 30 и 120 сут. Группы животных вводили в эксперимент по схеме, при которой забой всех животных был проведен приблизительно в одно время. Это позволило избежать влияния возрастного и сезонного факторов.
Состояние СММ оценивали по содержанию цитохромов Р-450 и ¿5 [13]. Фракцию микросом печени получали путем ультрацентрнфугнрованпя постмитохондриальпого на-досадка в центрифуге VAC 601 при 105 000 g в течение 1 ч. Определение содержания цитохромов проводили на двулу-чевом двухволновом спектрофотометре «Хитачи-556». Содержание микросомального белка оценивали по Лоурн [1?1.
Нагрузка мутагеном проведена после 120-суточного воздействия индуктора. Использована схема полного двух--факторного эксперимента, в котором одним фактором бы-
ла доза циклофосфамида (0, 5, 10 и 20 кг/кг), другим — доза индуктора. За 5 дней до конца потребления фенобарбитала крысам вводили циклофосфамид внутрижелудоч-но 5-кратно с интервалом 24 ч между введениями. Животных забивали через 6 ч после последнего введения мутагена. В каждой группе было по 6 животных. Определяли частоту метафаз с аберрациями хромосом в клетках костного мозга крыс. Цитогенетнческий анализ проводили на зашифрованных препаратах. Анализировали по 100 метафаз от каждого животного. Учитывали одиночные и парные фрагменты, обмет хромосомного и хроматидного типов. Для сравнения долей аберрантных метафаз использовали /-критерий Стьюдента с предварительным преобразованием данных по каждому животному (для стабилизации дисперсии) по формуле: Z-arc — sin р, где р — доля метафаз с аберрациями хромосом [5]. Регрессионный анализ проводили по методу наименьших квадратов.
По данным цитогенетического анализа (табл. 1) фенобарбитал во всех испытанных дозах не индуцировал аберрантные метафазы. Циклофосфамид при изолированном введении увеличивал частоту клеток с аберрациями хромосом до 3 % (5 мг/кг), 7,7 % (10 мг/кг) и 11% (20 мг/кг). Зависимость частоты метафаз с аберрациями хромосом как при изолированном, так и при. совместном с фенобарбиталом действии (во всех вариантах) описывается линейным4«« уравнением: у=а+Ьх, где у — доля метафаз с аберрациями хромосом: х — доза мутагена, а и Ь — коэффициенты уравнения. Коэффициент Ь характеризует нарас-
Таблица 1
Частота клеток с аберрациями Vj.qmocom в костном мозге крыс при действии равных доз циклофосфамида и фенобарбитала
Количество клеток с аберрациями, %
0 5 10 20
0,67±0,49 3,0±0,55 7,67±1,05 П,0±1,06
1,50±0,81 4,0±0,52 8,13±1,20 11 ,17± 1,20
1,33+0,21 3,50±0,67 8,0±1,18 16,0± 1,79
1,33±0,42 2,83±0,79 4,5О±0,76 Ю,33±1,26
Таблица 2
результаты регрессионного анализа зависимости доли клеток с аберрациями хромосом в костном мозге крыс от дозы цнклофосфамида на фоне введения разных доз фенобарбитала
1 Доза фенобарбитала, мг/кг Л* Р критерий регрессии Коэффициенты уравнения Частота клеток с аберрациями в контроле, %
ь±$ь 0+5 а
0 0,79 79,25» 0,530-1- 0.060 0,975 + 0,695 0.67
0,4 0,71 54,69» 0.492 + 0. 1 14 0, 30 I ,893±1,308 1 ,50
2 0,82 101,91» 0.755 + 0,075 2,37 0,624 ±0.859 1 ,33
10 0,74 61,89» 0,455 + 0,058 0.90 0,767 ±0.664 1 .33
П р и м е ч а н и с. Л2—доля объяснимого уравнением регрессии разброса экспериментальных данных; / — показатель достоверности различий коэффициентов Ь в вариантах с совместным действием цнклофосфамида и фенобарбитала по сравнению с таковыми при изолированном действии мутагена (односторонний /критерий); звездочка — достоверное различие с контролем при р<0,05.
тание эффекта па единицу дозы мутагена, и его можно рассматривать как основной показатель модификации.
Фенобарбитал в дозах 0,4 и 10 мг/кг не влиял на цп-^.тогенетический эффект цнклофосфамида: на этом фоне ни . частота клеток с аберрациями хромосом, ни коэффициенты 1 ■ й регрессионных уравнений (табл. 2) не отличались от таковых при изолированном действии мутагена. Фенобарбитал в дозе 2 мг/кг повышал частоту аберрантных мета-фаз, индуцированных цнклофосфамндом. Коэффициент Ь также был значимо выше в вариантах с введением 2 мг/кг фенобарбитала в отличие от вариантов без введения индуктора или при его введении в дозах 0,4 и 10 мк/кг. Следовательно, на фоне индукции СММ отмечены изменения количественных показателей мутагеннс-го эффекта.
Качественные параметры (специфику) действия мутагенов принято оценивать по виду регрессионных зависимостей доли метафаз от концентрации мутагенов, соотношению индуцируемых одиночных и парных разрывов, доле аберраций хроматидного и хромосомного типов. Эти характеристики оказались сходными как при изолированном действии мутагена, так и на фоне введения модификатора. Из этого следует, что модификатор не изменяет специфику действия мутагена.
Наблюдаемое повышение эффекта цнклофосфамида, по-видимому, определяется тем, что фенобарбитал индуцирует СММ и изменяет количество образующихся актнв-у . них метаболитов мутагена. Это подтверждается сходными .данными, полученными па микроорганизмах (тест Эймса) Ч-Лри использовании для метаболической активации микро-сом крыс, индуцированных фенобарбиталом [10]. Поэтому фенобарбитал мы применяли для создания определенных уровней индукции СММ, которые контролировали по содержанию цитохромов Р = 450 и ¿5(табл. 3). Это позволило оценить зависимость эффекта мутагена от уровня индукции, а не от дозы модификатора. Такой подход дает возможность прогнозировать эффект мутагенов в зависимости от активности системы метаболизма, даже если неизвестен конкретный модификатор или действует комплекс соединений.
Фенобарбитал в дозе 0,4 мг/кг не влиял на активность системы микросомалыюго окисления, и в отсутствие индукции эффект мутагена не изменялся. Доза 2 мг/кг вызывала стойкое повышение активности ферментов СММ на 130—150% (минимальный статистически значимый уровень индукции) на протяжении всего срока воздействия. На этом фоне отмечено повышение мутагенного эффекта цнклофосфамида. При длительной индукции СММ фенобарбиталом в более высокой дозе (10 мг/кг) на 5-е и 30-е сутки наблюдали повышение содержания цитохрома Р-450 до 223 и 226% (максимальный уровень индукции), а к 120-м суткам — только до 177% (в контроле 100%). На
Таблица 3
Активность СММ при действии разных доз фенобарбитала
(М±т)
Доза фенобарбитала, мг/кг Длительность введения фенобарбитала . сут Число животных Содержание цитохрома Р<10 иМоль на 1 мг белка Содержание цитохрома 66, нМоль на 1 мг белка
0 (контроль) 5 8 0,82±0,07 0,60±0,03
0,4 5 7 0,84±0,03* 0,63±0,06
2 5 8 1,05±0,07* 0,63 ±0,02
10 5 8 1,83+0,09* 0,83±0,04**
0,4 30 8 0,87±0,05 0,58±0,03
2 30 6 1 ,12±0,08* 0,57±0,05
10 30 8 1,86±0,11** 1,09±0,06**
0,4 120 8 0,80±0,06 0,63±0,03
2 120 8 1,21 ±0,12* 0,83±0,04**
10 120 6 1,45±0,12** 0,93±0,П*
Примечание. Одна звездочка — достоверные различия с контролем (р<0,05), две — то же при /?<0,001-
этом фоне в конце эксперимента эффект модификации не выявлен. Вероятно, при длительном введении индуктора после выраженного повышения активности СММ возможен синтез малоактивного ферментного белка, в результате чего функционально менее активная система микросомалыюго окисления существенно не влияет на метаболизм цнклофосфамида. О возможном образовании гипертрофированного малоактивного гладкого эндоплазматпче-ского рстикулума при длительном введении крысам дильд-рина (индуктора СММ) указано в работе [14]. Наше предположение согласуется также с гипотезой А. С. Са-ратнкова и соавт. [6], которые считают, что длительная нн-дукция СААМ барбитуратами приводит к ускоренному метаболизму не только чужеродных соединении, но и эндогенных субстратов (фолиевой кислоты, холестерина, гормонов и др.), которые по принципу обратной связи могут влиять на синтез ферментного белка и приводить к снижению мощности ферментных систем микросом.
В проведенном исследовании наиболее важны данные об усилении мутагенного эффекта цнклофосфамида на фоне длительных минимальных изменений активности системы микросомалыюго окисления. Этот эффект отмечен нами в остром [1] и подостром [2| экспериментах. Снижение мутагенной активности цнклофосфамида выявлено на фоне 6-месячного ннгибирования СММ четыреххлористым углеродом в довольно низких концентрациях на уровне 10 и 100 ПДК [4, 8]. Близкие данные получены при оценке генотоксического эффекта бенз(а) пирена на фоне длительного 30—50% ннгибирования СММ этанолом [9].
Полученные результаты характеризуют роль минимальных изменений СММ как условий для модификации эффекта мутагенов и имеют важное значение для оценки влияния на организм загрязнений окружающей среды, поскольку многие ксенобиотики: полицнклнческие ароматические углеводороды, полнхлорированные бпфенилы, хлор-и фосфорорганические соединения — являются индукторами СММ и наличие их в окружающей среде может способствовать возникновению определенного фона активности данной ферментной системы и повышению уровне мутагенных, канцерогенных и других специфических эффектов.
Таким образом, минимальная индукция мнкросомаль-ных моноокенгеназ фенобарбиталом приводит к увеличению количества клеток с аберрациями хромосом, индуцированных мутагеном непрямого действия, в костном мозге крыс, причем это увеличение не зависит от длительности воздействия индуктора. Определена значимость длительного статистически достоверного изменения активности микросомальных моноокенгеназ при действии химических
соединении как условия для модификации эффекта мутагенов.
Литература
1. Бурмантова Н. П.. }Курков В. С.. Выскубенко И. Ф„ Сычева Л. П. // Современные биохимические методы в гигиене окружающей среды, — М„ 1982. — С. 45—52.
2. Журков В. С., Меркурьева Р. В., Бурмантова Н. П. и др.//Вести. АМН СССР. — 1985. — № 1, —С. 54—58.
3. Литвинов Н. И., Воронин В. М., Казачков В. И.// Вопр. онкол. — 1984, —Т. 30, № 4, —С. 56—60.
4. Литвинов И. Н.. Соколовский В. В., Журков В. С. // Генетические последствия загрязнения окружающей среды. — Орджоникидзе, 1986. — С. 81.
5. Подомная М. А., Бобринев Е. В., Радченко Л. У. и др.//Актуальные проблемы оценки фармакологической активности химических соединений. — М., 1981.— Ч. 2, —С. 124—125.
6. Саратиков А. С.. Новожеева Т. П.. Горшкова В. /(. //
Фармакол. и токсикол. — 1982, —№6. — С. 55—59.
7. Скворцова Н. Н., Иродова Е. В. // Гиг. и сан, — 1981. —L №7, —С. 9—12. *
8. Сычева Л. П., Казачков В. И. //Там же.— 1985. — № 7, —С. 29—31.
9. Capel J. D., Dorrel H. M.. Jenner М. et al.//Biochem. Pharmacol.— 1979, — Vol. 28, N 8. — P. 1139—1141.
10. Hales В. F.. Jain R. // Ibid. — 1980. —Vol. 29, N 2. — P. 256—259.
11. Von Halle E. S. // Progress in Mutation Research. — Geneva, 1985, — Vol. 5. — P. 699—725.
12. Lowry О. H., Rosebrough N. J., Farr A. Z„ Randall R. J. U J. biol. Chem.—1951. —Vol. 193, N I. — P. 265—275.
13. Omura Т.. Sato R.// Ibid. — 1964. — Vol. 239, N 7. — P. 2370—2378.
14. Stevens J. Т.. Oberholser К■ M., Wagner S. R., Green F. E. //Toxicol, appl. Pharmacol. — 1977. — Vol. 39, N 3, — P. 411—421.
Поступила I9.08.S7
УДК 616.155.1-02:613.632:547.532]-092.9
Е. Г. Фельдт, Е. Л. Скворцова
АНАЛИЗ НОРМОХРОМНЫХ ЭРИТРОЦИТОВ С МИКРОЯДРАМИ В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ КРЫС ПОСЛЕ ПЕРОРАЛЬНОГО ВВЕДЕНИЯ БЕНЗОЛА
НИИ общей и коммунальной гигиены им. А. Н. Сысина АМН СССР, Москва
'vi
Учет частоты нормохромных эритроцитов с мнкроядра-ми в периферической крови мышей при длительном воздействии химического вещества служит эффективным непрямым тестом выявления мутагенной активности [6, 8].
В настоящее время этот метод широко применяется зарубежными исследователями для оценки действия модельных мутагенов — ацетилальдегида, диметнлбензантрацена, циклофосфамида, азотистого иприта, алкалоидов пнрролн-зина, триэтиленмеламина, митомнцина С, колхицина [6— 9]. Мы также использовали модифицированный микроядерный тест для оценки мутагенного действия циклофосфамида при длительном поступлении и показала совпадение данных, полученных с применением мнкроядерного теста на эритроцитах периферической крови и костного мозга с результатами метафазного анализа аберраций хромосом в клетках костного мозга мышей [3].
Одним из достоинств рассматриваемого метода является возможность получения информации в динамике, что может представлять определенный интерес для гигиенистов. Поскольку большинство исследований в гигиене проводится на крысах, мы сочли целесообразным проанализировать частоту эритроцитов с микроядрами в периферической крови крыс при длительной затравке мутагеном. В качестве модельного вещества избран бензол, мутагенные свойства которого хорошо изучены.
Эксперимент проведен на самцах нелинейных крыс. Бензол в дозах 50, 500 и 1000 мг/кг (0,008, 0,08 и 0,16 ЬОг,о соответственно) в растворе подсолнечного масла вводили крысам зондом в желудок в течение 6 нед по 5 дней в неделю. В опытных и контрольной группах было по 6 животных. Препараты периферической крови готовили 6 раз (1 раз в неделю), начиная с 7-х суток после начала эксперимента. Каплю крови из хвостовой вены помещали на сухое обезжиренное предметное стекло, шлифованным стеклом делали мазок. Препараты высушивали на воздухе, затем (через 1 ч) фиксировали в абсолютном метаноле (3 мин), окрашивали по методу Мая — Грюнвальда — Гнмзы. При анализе подсчитывали количество нормохромных эритроцитов с мнкроядрамн и полихроматофиль-ных эритроцитов на 2000 нормохромных эритроцитов.
У контрольных животных на протяжении 6 нед затравки колебаний частоты нормохромных эритроцитов с
микроядрами не выявлено (0—0,01 %). При воздействии дозы 50 мг/кг в препаратах не было обнаружено ни одного мнкроядерного эритроцита. При дозах 500 и 100 мг/кг средние значения анализируемого показателя в группах колебались в пределах 0—0,01 и 0—0,025 % соответственно, что свидетельствует об отсутствии повышения частоты нормохромных эритроцитов с микроядрамн у подопытных животных по сразнснню с контролем.
Показатель «% полихроматофильных эритроцитов» в контрольной группе и у животных, получавших бензол в дозах 50 и 500 мг/кг, колебался незначительно (см. таблицу). При воздействии дозы 1000 мг/кг наблюдалось снижение частоты полихроматофилов в крови через 2 нед затравки, а затек резкое повышение ее к концу опыта как результат процессов' угнетения кроветворения и компенсации, развивающихся последовательно в костном мозге экспериментальных животных.
Таким образом, полученные данные не выявили накопления в периферической крови крыс нормохромных эрит-роцитов с микроядрами при пероральном введении бензЪи^Г ла в подсолнечном масле в течение 6 нед. В то же время известно, что при других путях поступления (подкожном, ингаляционном) бензол дает выраженный цнтогенетнческий эффект в клетках костного мозга крыс [1, 2. 4]. По-види-мому, продолжительность существования микроядерных
Содержание полихроматофильных эритроцитов в периферической крови крыс при пероральном введении бензола (М±т)
о Количество полихроматофильных эритроцитов, %
доза бензола, мг/кг
ч = <1) в) X г; 0 . 50 500 1000
1-я 2-я 3-я 4-я 5-я 6-я 1 .025 ±0,240 0,775±0,130 0,492 ±0,093 0,61 7 ±0,069 0,925 + 0,1 53 0,776±0,208 1 . 1 08 ±0. 1 75 0 ,755 + 0,075 1 ,033 + 0,151 1 ,042 ±0,1 54 1 ,508 ±0. 180 0,800 ± 0,278 1 ,075 ± 0,107 1,050 ± 0,248 0. 508 ±0, 126 1 , 125 ±0, 121 1 ,333 ±0.21 1 1.465 ± 0,172 0,61 7 ±0.305 0,058 ± 0,042 0.450 ± 0,303 1,483 ± 0,2G5 1,367 ± 0,255 2,258 ± 0,300
зии
J
