МОДИФИКАЦИЯ ФАКТОРОМ НЕКРОЗА ОПУХОЛИ (ФНО-α) ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО И АПОПТОТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ЛЕКАРСТВ В КЛЕТКАХ МЕЛАНОМЫ ЧЕЛОВЕКА Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОНКОЛОГИЯ

УДК 616-002.4:615.277.3:616-006.81-091.8 Е.Г. Славина, Х.А. Бигвава, Т.Н. Заботина, А.А. Борунова, Л.Ф. Морозова, А.И. Черткова,

В.А. Нуртдинова, З.Г. Кадагидзе

МОДИФИКАЦИЯ ФАКТОРОМ НЕКРОЗА ОПУХОЛИ (ФНО-а) ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО И АПОПТОТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ЛЕКАРСТВ В КЛЕТКАХ МЕЛАНОМЫ ЧЕЛОВЕКА

РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

Контактная информация:

Славина Елена Григорьевна, ведущий научный сотрудник лаборатории клинической иммунологии опухолей НИИ клинической онкологии

адрес: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24; тел. +7(495)324-94-14, моб. +7(903)590-10-52 e-mail: elena.slavina@gmail.com

Статья поступила 29.09.2009, принята к печати 20.10.2009.

Резюме

В настоящем исследовании было проведено изучение взаимодействия отечественного рекомбинантного препарата фактора некроза опухоли альфа - Альнорина с противоопухолевыми лекарствами дакарбазином (DTIC), BCNU и ACNU, применяемыми в клинике для лечения злокачественной меланомы, в индукции цито-токсического действия и апоптоза в клетках 6 линий меланом, полученных из опухолей больных.

Показано, что клетки отдельных линий проявляют различную чувствительность к этим лекарствам, и Альнорин усиливает цитотоксичность лекарств. Преимущественно - на резистентных клетках в концентрациях, в которых сам Альнорин не токсичен для клеток. Он также усиливает интенсивность апоптоза, индуцированного DTIC, в резистентных клетках. В этой системе интерфероны-а и -у не проявили подобной активности.

Ключевые слова: меланома, противоопухолевые лекарства, фактор некроза опухоли, цитотоксичность, апоптоз.

E.G. Slavina, H.A. Biguava, T.N. Zabotina, F.F. Borunova, L.F. Morozova, A.I. Chertkova, V.A. Nurtdinova, Z.G. Kadagidze

THE INTERACTION OF TUMOR NECROSIS FACTOR (TNF-a)

WITH ANTITUMOR DRUGS AT THE INDUCTION

OF CYTOTOXICITY AND APOPTOSIS IN THE HUMAN MELANOMA CELLS

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center of RAMS, Moscow

Abstract

The interaction of Russian domestic recombinant tumor necrosis factor alfa - Alnorin - with antitumor drugs dacarbasin (DTIC), BCNU and ACNU, using at the clinic for the malignant melanoma treatment, as inducers of apoptosis has been studied in 6 melanoma cell lines derived from patients tumors.

It was demonstrated that the cells originated from different patients show the distinct sensitivity to these drugs and non-toxic Alnorin concentrations enhance drug cytotoxic effect mainly in the resistant cells. This drugs also enhances the intensity of apoptosis, induced by DTIC in resistant cells. Interferons -a and -y did not show similar activity at the same system.

Key words: melanoma, antitumor drugs, tumor necrosis factor, cytotoxicity, apoptosis.

Введение

Фактор некроза опухолей (ФНО-а) был обнаружен в конце 1970-х гг. как цитокин, продуцируемый клетками иммунной системы и способный подавлять пролиферацию опухолевых клеток и индуцировать регрессию опухолей [4; 8]. В 1984 г. был клонирован ген ФНО, что послужило началом интенсивного изучения этого цитокина, а также привело к созданию его рекомбинантных препаратов. ФНО оказался многофункциональным белком, участвующим как в нормальных физиологичских процессах, таких как рост и развитие органов и тканей, так и в патологических, таких как воспаление, опухолевый рост, отторжение трансплантатов, при ревматоидном артрите и при сеп-

тическом шоке [2]. В контроле роста опухолей ФНО может выполнять диаметрально противоположные функции - с одной стороны, индуцировать гибель опухолевых клеток, а с другой - стимулировать пролиферацию и миграцию опухолевых клеток, повышать их выживаемость и усиливать ангиогенез в опухолях [9]. И эта двоякая направленность должна учитываться при попытках клинического применения ФНО.

Хотя ФНО может оказывать цитотоксическое, цитостатическое и иммуномодулирующее действие, его применение в качестве самостоятельного противоопухолевого лекарства очень ограничено из-за, во-первых, множества побочных эффектов и, во-вторых, по причине резистентности многих опухолевых клеток к его цитотоксическому действию.

38

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОНКОЛОГИЯ

МОДИФИКАЦИЯ ФАКТОРОМ НЕКРОЗА.

На многих экспериментальных моделях, включая ксенотрансплантаты опухолей человека на бестимусных мышах, было показано, что в переносимых дозах сам по себе ФНО очень слабо подавляет или вовсе не подавляет рост опухолей. Однако он проявляет синергизм с интерфероном-у [3] и с некоторыми противоопухолевыми лекарствами [5] в индукции противоопухолевого ответа. Ранее мы описывали усиление цитотоксического действия противоопухолевых лекарств в отношении опухолевых клеток in vitro интерфероном-а [1].

В настоящей работе мы изучали взаимодействие in vitro отечественного рекомбинантного препарата ФНО-а - Альнорина - с противоопухолевыми лекарствами, применяемыми для лечения диссеминированной меланомы кожи, в отношении нескольких культуральных линий клеток меланомы человека в индукции цитотоксического действия и апоптоза.

Материалы и методы

Клеточные линии

Культуры клеток меланом были получены из хирургически удаленных меланомных узлов ферментативной обработкой после механической дезинтеграции. Клетки растили в пластиковых культуральных флаконах 25 см2 (Costar, США) в питательной среде RPMI-1640 (предприятие ПанЭко, Москва) с добавлением 10 %-ной эмбриональной телячьей сыворотки (Perbio HyClone, США), 280 мкг/мл L-глютамина (ПанЭко), 80 мкг/мл гентами-цина, незаменимых аминокислот и витаминов в термостате при 37 °С в атмосфере с 5% СО2.

Определение цитотоксического действия противоопухолевых лекарств и цитокинов

В работе использовали противоопухолевые препараты Дакарбазин (DTIC, Lachema, Чешская республика), Нидран (ACNU, Япония), BCNU (Bristol Myers Squibb, США). В качестве ФНО-а применяли отечественный рекомбинантный препарат Альнорин (ГНЦ «Вектор»), интерферона-а и -у - также отечественные рекомбинантные препараты Реаферон (ГНЦ «Вектор») и Ингарон (ООО Фармаклон).

Цитотоксичность лекарств

В присутствии цитокинов или без них определяли высокочувствительным микроколориметри-ческим полуавтоматическим МТТ-тестом [6]. Клетки засевали в лунки 96-луночных планшетов (Costar) по 200 мкл/лунку при концентрации 2*104 в 1 мл, выращивали 1 сутки в термостате в атмосфере с 5% СО2, заменяли ростовую среду такой же средой, содержащей различные концентрации лекарств, одного из цитокинов или смеси лекарства с цитокином или чистой средой (контроль) и инкубировали 24 или 48 ч при тех же условиях.

По окончании инкубации во все лунки вносили по 10 мкл раствора МТТ при исходной концентрации 5 мг/мл. После 4 ч инкубации при 37 С образовавшиеся кристаллы формазана растворяли ДМСО и учитывали результаты на спектрофотометре Labsystems Multiscan MS определяя оптическую плотность (ОП) раствора при X 540 нм. Интенсивность цитотоксичности вычисляли по формуле:

% ЦТ = 100 - ( О- х 100)

контроль

Индукцию апоптоза

В целом (общего апоптоза) определяли окрашиванием клеток пропидиумом иодида. Для опреде-

ления интенсивности апоптоза клетки выращивали в лунках 6-луночных планшетов Costar, засевая их по 2 мл клеточной суспензии, содержащей 5*104 клеток/мл. После 1 суток культивирования в них так же, как и в опытах по цитотоксичности, вносили растворы лекарств с Альнорином или без него, инкубировали 24-48 ч при 37 °С, снимали с поверхности пластика обработкой раствором Версена, фиксировали ледяным 70 С этанолом и окрашивали пропидиу-мом иодидом по методу Nicoletti [7].

Для выявления раздельно раннего и позднего апоптоза и клеток с признаками некроза проводили одновременное окрашивание живых нефиксированных клеток Annexin V и пропидиумом иодида по инструкции коммерческого набора. Пропорцию апоптотических клеток определяли на проточном ци-тофлюориметре FACSсan (Becton Dickinson, США) в программе LYSIS II, применяя однопараметровый гистограммный анализ по FL2 для пропидиума иодида и Dot Plot анализ Fl1 против FL2 для Аннексина с пропидиумом иодида. В каждом образце накапливали и анализировали 104 клеток.

Cтатистическую обработку результатов проводили по определению 50% цитотоксической (ЦД50) и 50% и 10% апоптозиндуцирующей (АД50 и АД10) дозы препаратов и критерию t Стьюдента с использованием компьютерной программы Sigma Plot for Windows (Jandel Scientific, USA) и пакета программ Statistica 5.0.

Результаты и обсуждение

Цитотоксичность лекарств в отношении клеток меланомы: эффект цитокинов

Как видно из табл. 1, разные линии меланом оказались в различной степени чувствительными к цитотоксическому действию лекарств. Так меланома Mel-Il оказалась наиболее резистентной к цитотокси-ческому действию дакарбазина (DTIC) , и в то же время ее чувствительность к BCNU была наиболее высокой среди исследованных линий (рис. 1А-Б). Напротив, меланома Mel-Rac была максимально чувствительна к дакарбазину (рис. 1А) и наиболее резистентна к цитотоксичности BCNU и ACNU (рис. 1Б-В). Добавление Альнорина существенно повышало цитотоксичность DTIC в отношении клеток Mel-Il, но не Mel-Rac. Индекс стимуляции токсичности (ИСТ), представляющий собой соотношение ЦД50 препарата в присутствии и отсутствии Альнорина, равнялся для линии Mel-Il 6,5 и 7,5 при концентрациях Альнорина 500 и 50 МЕ/мл (р<0,05) соответственно и лишь 1,64 и 1,96 в отношении клеток Mel-Rac. Альнорин также существенно усиливал цитотоксичность DTIC в отношении другой резистентной линии Mel-Mtp - в 6,25 и 4,18 раза (р<0,05), и лишь в слабой степени в отношении клеток чувствительной линии Mel-P - в 1,5 и 2 раза. Однако на достаточно резистентных линиях Mel-IS и Mel-Korr усиление цитотоксического действия DTIC альнорином проявлялось лишь в слабой степени. Сходные закономерности обнаружены и для BCNU и ACNU: Альнорин усиливал цитотоксическое действие BCNU только в отношении резистентных линий Mel-Rac и Mel-P (рис. 1Б) и ACNU в отношении Mel-Rac (ACNU; рис. 1В), и действовал очень слабо или вовсе не влиял на цитотоксичность препаратов на чувствительных линиях. Усиливающее цитотоксичность Дакарбазина действие Альнорина проявлялось на клетках меланом Mel-Il и Mel-Mtp преимущественно в отношении более низких концентраций DTIC - от 125 до 500 мкг/мл и не проявлялось при максимальной его концентрации 1 000 мкг/мл. (рис. 2А-Б).

1200

И

~ 1000 ■ 1

Ъ 800■ і

сі “ 600 ■ ю і

^ 400 - 1

, 200 ■ 1

=

Мві-іі МеІ-Р МеІ- МеІ- МеІ-ів МеІ-

Мїр Яво Когг

400 350 ^ 300 ^ 250 £ 200 ° 150 100 50 0

Б ВОНи

Е-

її 1 1

Н

МеІ-іІ Меі-Р Меі-Мір МеІ-Яво

н Препарат

пш Препарат + альнорин 500 МЕ/мл

и Препарат + Альнорин 50 МЕ/мл

Рис. 1А-В. Эффект ФНО-а (Альнорин) на цитотоксичность БТІЄ, БЄМи и ЛЄМи в клетках меланом.

Концентрации ОЇІС

-|------1------1-----1-----1------1-----г

0 125 250 500 1000

Концентрации ОЇІС

Н

Рис. 2А-Б. Эффект ФНО-а (Альнорин) на цтоксичность БТІЄ в клетках меланом.

0

Таблица 1

Сравнительная цитотоксичность противоопухолевых лекарств в клетках линий меланом: эффект Альнорина________________________________________________________

ЦД 50 (мкг/ мл)

Линии меланом БТ1С БСШ лсш

Альнорин

- 500 МЕ/мл 50 МЕ/мл - 500 МЕ/мл 50 МЕ/мл - 500 МЕ/мл 50 МЕ/мл

Ме1-1Ь 1109,7±312,8 170,3±66,5* 148,15±59,3* 94,08±18,8 71,25±12,4 61,01±11.02 - - -

Ме1-Мр 684,28±21,5 109,4±52,13* 163,55±58,0* 100,18±23,5 53,88±12,6 38,54±7,6* - - -

Ме1-Р 238,0±22,4 155,3±17,9* 119,95±24,7* 289,87±58,64 253,53±55,24 133,93±49,36 256,35 39,0 217,5 48,6 243,6 49,1

Ме1-Яас 221,52±33,94 135,14±25,6* 112,8±27,32* 373,18±91,17 378,47±121,37 116,0±46,69 782,07 42,8 164,9 62,01* 189,7 70,7*

Ме1-Когг 737,7±236,4 871,032±218,8 674,4±189,8 - - - 191,0±13,3 196,0±5,0 182,4±6,8

Ме1-Ь 852,0 250,1 510,4 131,4 655,1 210,4 - - - 212,96 25,2 191,9 5,2 180,7 13,7

*р<0,05

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОНКОЛОГИЯ МОДИФИКАЦИЯ ФАКТОРОМ НЕКРОЗА... 41

Как на чувствительных, так и резистентных клеточных линиях Альнорин в большинстве случаев был более эффективным в концентрации 50 МЕ/мл, чем 500 МЕ/мл. Интерфероны -а и -у не проявили аналогичной активности (данные не приводятся). Влияние Альнорина на индукцию апоптоза в клетках меланом противоопухолевыми лекарствами.

Среди 4 линий меланом, исследованных на индукцию апоптоза дакарбазином, клетки меланом Ме1-11 и Ме1-М1р оказались наиболее резистентными так же, как и к цитотоксическому действию. Ально-рин в концентрации 500 МЕ/мл усиливал индукцию апоптоза в клетках меланомы Ме1-11, снижая 50%-ную апоптозиндуцирующую дозу БТІС в 35,8 раза, а в концентрации 50 МЕ/мл - в 62,4 раз. Клетки меланом Ме1-Яас и Ме1-Р, максимально чувствительные к цитотоксическому действию дакарбазина, были также чувствительны и к его апоптозиндуцирующе-му эффекту, и Альнорин его не усиливал (рис. 3). Усиление апоптоза в клетках меланомы Ме1-М1р Альнорином в концентрациях 500 и 50 МЕ/мл в 32,5 и 11,4 раз соответственно при оценке по 50%-ной апоптозиндуцирующей дозе (рис. 3), на самом деле представляла собой простую суммацию эффектов БТІС и Альнорина, т.к. Альнорин сам индуцировал в этих клетках высокий уровень апоптоза (рис. 4В), чего не было на клетках Ме1-І1 и Ме1-Яас (рис. 4А-Б). Клетки меланомы Р, резистентные к цитотоксическому эффекту БТІС, оцениваему по ЦД 50 , хотя и погибали в значительной мере в результате этого эффекта после 24 и 48 ч экспозиции с препаратом , но в этот период только в слабой мере проявляли признаки апоптоза (25,35 и 13 % соответственно). Только через 72 ч 41,4 % клеток проявляли признаки апоптоза (рис. 5). Индукция апоптоза БСМТи так же, как и цитотоксичность препарата проявлялась максимально на клетках меланом линий Ме1-І1 и Ме1-М1р, а клетки линии Ме1-Яас были резистентны к обоим эффектам.

Однако Альнорин не усиливал апоптоз, индуцированный БСКи ни на чувствительных, ни на резистентной линии (рис. 6 и 7А-Г). Так же, как и с дакарбазином Альнорин существенно снижал 50 %-ную апоптотическую дозу БСМТи на клетках меланомы Ме1-М1р, но и в этом случае это была лишь суммация эффектов, как и в опытах с БТІС, т.к. сам Альнорин, как указывалось выше на рис. 4Б, индуцировал в этих клетках высокий уровень апоптоза. При определении апоптоза на нефиксированных клетках Аннексином-У и пропидиумом иодида, т.е. раздельного тестирования раннего и позднего апоп-тоза, в клетках меланомы Ме1-Яас Альнорин, не усиливая индукцию общего апоптоза дакарбазином, в некоторой степени усиливал поздний, но не ранний апоптоз (рис. 4Б). Однако он не влиял на индукцию БСМи в клетках этой меланомы ни общего, ни раннего или позднего апоптоза. При этом на этих клетках при 24-48-часовой инкубации с БСМи ранний апоптоз был более интенсивным, чем поздний (рис. 7Г) в отличие от клеток Ме1-І1 (рис. 7А), а также в отличие от тех же клеток под воздействием БТІС (рис. 4Б).

Заключение

Таким образом, можно заключить, что клетки меланом, происходящие от разных больных, отличаются различной чувствительностью к цито-токсическому и апоптозиндуцирующему действию противоопухолевых лекарств, и фактор некроза опухолей (Альнорин) усиливает эту чувствительность только на резистентных, но не на чувствительных клетках. Причины различной чувствительности меланом к лекарствам и к эффекту ФНО не ясны. Возможно, это связано с неодинаковой экспрессией в клетках отдельных меланом генов, контролирующих процессы апоптоза. Это еще предстоит изучить.

МеІ-ІІ

МеМШр

ІТТТТТЛ

МеІ-Р Препарат

Препарат + Альнорин 500 МЕ/мл Препарат + Альнорин 500 МЕ/мл

МеІ-Рао

Рис. 3. Эффект ФНО-а (Альнорин) на индукцию апоптоза БТІС в клетках меланом.

DTIC

- DTIC+Альнорин 5GG МЕ/мл

- DTIC+Альнорин 5G МЕ/мл

Рис. 4А-В. Индукция апоптоза в клетках меланом дакарбазином (ЭТ1С) влияние Альнорина.

Концентрации DTIC (мкг/мл)

Концентрации DTIC (мкг/мл)

Концентрации DTIC (мкг/мл)

—•— DTIC ранний апоптоз

DTIC+Альнорин (ранний апоптоз)

DTIC (поздний апоптоз)

■ DTIC+Альнорин (поздний апоптоз)

DTIC общий апоптоз

- DTIC+Альнорин 5GG МЕ/мл - общий апоптоз

- DTIC+Альнорин 5G МЕ/мл - общий апоптоз

Рис. 5А-В. Влияние Альнорина на индукцию апоптоза дакарбазином (ЭТ1С) в клетках меланомы Ме1-Р: зависимость от продолжительности экспозиции.

% апоптотических клеток % апоптотических клеток

А Ме1-П

► —•— —•= = ! = »•

—I 1--1--1--1-1--1-1--1--1-1-1--г-

0 7.8 15.6 31.25 62.5 125

Концентрации ВСШ

- ВС1Ми - обиуй апоптоз

- ВС1Ми+Альнорин 500 мкг/мл -обиуй

апоптоз

- ВС1Ми+Альнорин 50 мкг/мл-обиуй

апоптоз ВС1Ми - ранний апоптоз

ВС1Ми+Альнорин 500 мкг/мл - ранний апоптоз

■ ВС1Ми - поздний апоптоз

■ ВС1Ми+Альнорин 500 мкг/мл - поздний

О 62.5 125 250 500

Концентрации ВСШ

■ВСШ-общий апоптоз ■ВСШ+Альнорин 500 мкг/мл-общтм апоптоз

Рис. 7А-Г. Индукция аиоитоза в клетках меланом ВОШ: влияние Альнорина.

% апоптотических клеток ^ ^ о/0 апоптотических клеток

Концентрации ВСШ

ВСЫи-общ^й апоптоз

—■— ВСЫи+Альнорин 500 мкг/мл-общлй апоптоз —А— ВСЫи+Альнорин 50 мкг/мл-общлй апоптоз —•— ВСЫи-ранний апоптоз

—■— ВСЫи+Альнорин 500 мкг/мл-ранний апоптоз

■ ■ ВСЫи-поздний

апоптоз

■ ■* ■ ВСЫи+Альнорин 500

мкг/мл-поздний

Концентрации ВСШ

-Ф— ВС N11 - обш^й апогттоз

-■— ВСЫи+Альнорин 500 мкг/мл - обш^й апогттоз ВС1Ч11-ранний апогттоз

ВСЫи+Альнорин 500 мкг/мл-ранний апоптоз -9- - ВСЫи-поздний апогттоз

- ВСЫи+Альнорин 500 мкг/мл-поздний апоптоз

44

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОНКОЛОГИЯ

МОДИФИКАЦИЯ ФАКТОРОМ НЕКРОЗА.

140 120

_ 100 I 80 і 60

о

5

40

А

20 0

Рис. 6. Эффект ФНО-а (Альнорин) на индукцию апоптоза BCNU к клетках меланом.

Литература

1. Славина Е.Г., Черткова А.И., Короткова О.В. и др. Модуляция интерфероном-а цитотоксичности и индукции апоптоза доксорубицином и 5-фторурацилом // Иммунология. - 2005. - Т. 26, № 1. - С. 16-9.

2. Aggarwal B.B. Signaling pathways of the TNF superfamily: a double-edged sword // Nat.Rev.Immunol. -2003. - 3. - P. 745-56.

3. Balkwill F.R., Ward B.G., Moodie E., Fiers W. Therapeutic potential of tumor necrosis factor-alpha and gamma-interferon in experimental human ovarian cancer // Cancer Res. - 1987. - 47. - P. 4755-8.

4. Carswell E.A., Old L.J., Kassel R.L. et al. An endotoxin-induced serum factor that causes necrosis of tumors // Proc. Nat. Acad. Sci USA. - 1975. - 72. - P. 3666-70.

5. Haranaka K., Sakurai A., Saromi N. Antitumor activity of recombinant human tumor necrosis factor in combination with hyperthermia, chemotherapy, or immunotherapy // J. Biol. Response Med. - 1987. - 6. -P. 379-91.

6. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxic assays // J.Immunol.Meth. - 1983. - 65(1-2). - P. 55-63.

7. Nicoletti I., Migliorati G., Pagliacci M.C. et al. A rapid and simple methods for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry // J.Immunol.Meth. - 1991. - 139. - P. 271280.

8. Oettgen H.F., Carswell E.A., Kassel R.L. et al. Endotoxin-induced tumor necrosis factor // Recent Results Cancer Res. - 1980. - 75. - P. 207-12.

9. Xia Wang, Yong Lin. Tumor necrosis factor and cancer, buddies or foes? // Acta Pharmacol.Sin. - 2008. -Vol. 29(11). - P. 1275-88.

Работа поддержана грантом РФФИ № 07-04-01598.

I

Mel-Il

Mel-Mtp

Mel-Rac

BCNU

BCNU + Альнорин 500 МЕ/мл BCNU + Альнорин 50 МЕ/мл