CC BY
155
УДК 57.085.23
Митохондриальный путь апоптоза в клетках эпидермоидной карциномы человека Д431 при действии а-токоферилсукцината
М. А. Савицкая*, М. С. Вильданова, О. П. Кисурина-Евгеньева, Е. А. Смирнова,
Г. Е. Онищенко
Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 12 *E-mail: nakomis@mail.ru Поступила в редакцию 24.05.2012 г.
РЕФЕРАТ В связи с распространенностью злокачественных заболеваний большое внимание уделяется поиску соединений, обладающих противоопухолевой активностью и селективностью в отношении опухолевых клеток. К этим соединениям относятся и такие производные витамина Е, как сукцинат витамина Е (СВЕ). В связи с тем, что опухоли кожи трудно поддаются лечению, мы изучали действие СВЕ на культивируемые клетки эпидермоидной карциномы человека при помощи прижизненного окрашивания флуоресцентными красителями, иммуноцитохимического окрашивания и трансмиссионной электронной микроскопии. Показано, что СВЕ вызывает апоптотическую гибель клеток А431, уровень которой зависит от концентрации и продолжительности воздействия применяемого агента. Индукция апоптоза сопровождается гиперпродукцией активных форм кислорода, изменением формы, размеров и ультраструктуры митохондрий, выходом цитохрома с из митохондрий в цитозоль, что позволяет сделать заключение о митохондриальном механизме апоптоза. Таким образом, показано, что митохондрии служат важной мишенью действия СВЕ при запуске каспазозависимой апоптотической гибели клеток эпидермоидной карциномы человека А431 в культуре.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА а-токоферилсукцинат, апоптоз, митохондрии, активные формы кислорода, цитохром с. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ СВЕ - сукцинат витамина Е; АФК - активные формы кислорода; АИ - апоптотиче-ский индекс; СДГ - сукцинатдегидрогеназа.
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время внимание многих исследователей направлено на поиск противоопухолевых средств, селективно действующих на злокачественные клетки, но нетоксичных для нормальных клеток и тканей. В число таких соединений входят производные витамина Е.
Сегодня термин «витамин Е» применяют к целой группе как природных, так и синтетических соединений, называемых токоферолами и токотриенолами, а также к ацетиловым и сукциниловым производным токоферола. Проявления биологической активности витамина Е разнообразны и недостаточно изучены. Некоторые формы витамина Е можно рассматривать в качестве потенциальных противоопухолевых средств, поскольку они могут нейтрализовывать свободные радикалы, подавлять рост трансформированных клеток и индуцировать их дифференцировку, влиять на прохождение клеточного цикла, вызывать
апоптоз, а также усиливать работу иммунной системы [1-3].
Показано, что сам а-токоферол практически не обладает противоопухолевой активностью, в то время как ряд его производных, в том числе и сукцинат витамина Е (а-токоферилсукцинат, СВЕ), в той или иной степени проявляют такую активность. Негидролизованный СВЕ не обладает окислительновосстановительными свойствами, но, в отличие от свободного а-токоферола, имеет уникальные ан-типролиферативные и проапоптотические свойства [4]. СВЕ может действовать как на культивируемые опухолевые клетки [5, 6], так и на трансплантированные животным опухоли человека, и опухоли, индуцированные химическими канцерогенами [7-11]. СВЕ может вызывать гибель клеток, остановку клеточного цикла [12, 13], подавлять ангиогенез [14] и защищать организм от действия ионизирующего облучения
[15].
Мишени СВЕ в клетках различного происхождения интенсивно изучаются. Показано, что СВЕ запускает апоптотическую гибель ряда опухолевых клеток (рак молочной железы, злокачественная мезотелиома, нейробластома) по митохондриальному пути [16-21]. Тем не менее механизмы СВЕ-индуцированного апоптоза изучены еще недостаточно. Действие СВЕ изучали на культивируемых опухолевых клетках разного происхождения. Опухоли кожи обладают высокой злокачественностью и относятся к числу плохо поддающихся лечению, однако работы, посвященные действию производных витамина Е на трансформированные кератиноциты, в настоящее время практически отсутствуют. Прогноз при злокачественных заболеваниях кожи часто оказывается неблагоприятным.
В связи с этим в представленной работе изучено действие а-токоферилсукцината на культивируемые клетки эпидермоидной карциномы человека А431.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Культура клеток и постановка эксперимента
Клетки культуры А431 (эпидермоидная карцинома человека) (Институт цитологии РАН, Россия) растили в среде DMEM («ПанЭко», Россия) с добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота («PAA Laboratories», Австрия) и 80 мг/мл гентами-цина («ПанЭко») при 37°С и 5% CO2.
В качестве растворителя для СВЕ («Sigma») использовали 96% этанол. Первым контролем служили клетки, среда культивирования которых не содержала добавок. В качестве второго контроля в среду культивирования добавляли этанол. Агент и спирт, используемый в качестве второго контроля, вносили на 2 сут после посадки клеток и инкубировали в течение 24, 48 и 72 ч.
Оценка уровня гибели клеток
Долю апоптотических клеток в популяции подсчитывали на препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, по стандартной методике. Критериями для распознавания клеток, вступивших в апоптоз, служили такие морфологические признаки, как конденсация хроматина, уплотнение и блеббинг цитоплазмы. Оценивали действие СВЕ в концентрации 20, 40, 60 и 100 мкМ. Препараты анализировали на микроскопе Leica DM 1000 с использованием объектива N PLAN 100x/1.25 Oil. Результаты обрабатывали в программе Microsoft Office Excel 2007.
Цитохимия и иммуноцитохимия
Для иммуноцитохимических исследований клетки фиксировали 4% формальдегидом («MP
Biochemicals», Франция), приготовленным на 0.1 М буфере PBS («Sigma») рН 7.2. Препараты окрашивали моноклональными антителами мыши к активной форме каспазы-3 («Sigma»), антителами овцы к цитохрому с («Sigma»). В качестве вторых антител использовали антитела к Ig мыши, конъюгированные с Alexa Fluor-488 («Sigma»), и антитела к Ig овцы, конъюгированные с Alexa Fluor-488 («Invitrogen», США) соответственно. Ядра клеток докрашивали DAPI (100 нМ, «Sigma»). Препараты заключали в PBS-глицерин (1 : 1) и анализировали на люминесцентном микроскопе Axiovert 200M («Carl Zeiss Inc.», Германия) с использованием объектива Plan-NEOFLUAR 100x/1.30. Снимки обрабатывали с помощью программ Adobe Photoshop и ImageJ.
Митохондрии выявляли при помощи потенциалзависимого красителя Mitotracker Orange CMTMRos (100 нМ, «Invitrogen Molecular Probes»). Клетки фиксировали 4% формальдегидом («MP Biochemicals», Франция), приготовленным на 0.1 M буфере PBS рН 7.2, и заключали в смесь PBS-глицерин (1 : 1).
Прижизненные наблюдения
Для выявления АФК в среду добавляли 2',4'-ди-хлорфлуоресцеиндиацетат (DCFH-DA, «BioChemika», США) в концентрации 10 мкМ и выдерживали в течение 20 мин. В присутствии АФК (пероксид водорода, пероксид-анион, пероксид-радикал) в клетке образуется флуоресцентный продукт окисления -дихлорфлуоресцеин. DCFH-DA вносили через 48 ч после внесения СВЕ в среду культивирования. Фотосъемку проводили на люминесцентном микроскопе Axiovert 200M («Carl Zeiss Inc.») с использованием объектива Plan-NEOFLUAR 20x/0.50. Подсчитывали долю АФК-положительных клеток на снимках. Статистическую обработку проводили в программе Microsoft Excel. Фотографии обрабатывали при помощи программы Adobe Photoshop CS3.
Трансмиссионная электронная микроскопия
Для электронно-микроскопического исследования клетки фиксировали 2.5% глутаровым альдегидом («Sigma») с 2% формалином в 0.1 М PBS рН 7.2 («Sigma»). Постфиксацию проводили 1% раствором OsO4 («Sigma») в PBS в течение 1 ч в темноте. Далее использовали стандартные процедуры приготовления препаратов для трансмиссионной электронной микроскопии. Ультратонкие срезы (60-80 нм) изготавливали на ультрамикротоме Ultratom-5 («LKB», Швеция). Срезы окрашивали 1.5% водным раствором уранилацетата («Serva», США) и цитратом свинца («Serva») по Рейнольдсу. Препараты анализировали при помощи трансмиссионного электронного микроскопа JEM-1011 («JEOL») с цифровой фотокамерой
г»» я
Г
2 мкм 2 мкм 2 мкм
Рис. 1. Апоптоз в культуре клеток А431. А - Окраска гематоксилином и эозином; Б -фазовый контраст; В - иммуноцитохи-мическое выявление каспазы-3 в клетке, показанной на «Б».
GATAN ES500W, работающей под управлением программы Digital Micrograph фирмы «GATAN» и трансмиссионного электронного микроскопа JEM-100B («JEOL»).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
СВЕ вызывает апоптотическую гибель клеток А431 и его эффект зависит от концентрации и продолжительности воздействия
На препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, обнаружен только один тип гибели клеток - апоптоз. Апоптотические клетки можно было выявить по ряду критериев, таких, как ошаривание, уплотнение цитоплазмы, конденсация хроматина, блеббинг и распад на апоптотические тельца. Некротические клетки не выявлены (рис. 1А). Присутствие активной формы каспазы-3 (рис. 1Б,В) также указывает на апоптотический путь гибели клеток.
Величина АИ в контрольных образцах культуры клеток A431 составляет 0.4-0.9%, а добавление 96% этанола практически не влияет на величину АИ. На 2-е сут инкубации клеток с СВЕ в концентрации 40 мкМ АИ значительно повышается (9.67%) и остается на том же уровне на 3-и сут. При добавлении 60 мкМ СВЕ на 1-е сут АИ практически не меняется, на 2-е резко повышается (более 60%), а на 3-и клетки на стеклах не обнаруживаются. Подобный эффект наблюдается и при действии 100 мкМ СВЕ (63.5%), но величины АИ в этом случае наиболее высокие (рис. 2).
Таким образом, статистический анализ показал, что под действием СВЕ увеличивается уровень гибели клеток линии А431, причем эффект зависит от концентрации и продолжительности воздействия.
При концентрации СВЕ, равной 40 мкМ, и инкубации в течение 48 ч величина АИ заметно повышается, но массовая гибель клеток еще не происходит, поэтому данная доза была выбрана для изучения механизма индукции апоптоза.
СВЕ вызывает изменение структуры митохондрий и выход цитохрома с из митохондрий в цитозоль
Согласно опубликованным данным, во многих линиях клеток СВЕ запускает апоптоз по митохондриальному механизму. С целью изучения роли митохондриального механизма в запуске апоптоза анализировали общую структуру хондриома, ультраструктуру митохондрий, локализацию цитохрома с и уровень индукции АФК.
Для анализа состояния хондриома в контроле и при воздействии СВЕ клетки окрашивали потенциал-зависимым красителем Mitotracker Orange CMTMRos, способным накапливаться только в работающих митохондриях. На рис. 3А,Б представлены клетки А431, у которых хондриом образован многочисленными митохондриями, среди которых встречаются небольшие овальные, округлые и нитевидные митохондрии, изогнутые, с перетяжками и т.д. Как правило, митохондрии распределены равномерно по всей цитоплазме, очень редко они образуют скопления вокруг ядра, иногда располагаются в периферической цитоплазме. В отдельных случа-
80
70
60
50
40
30
20
10
0
-10
■5 Контроль : Контроль + спирт 20 мкМ СВЕ : 40 мкМ СВЕ 60 мкМ СВЕ 100 мкМ СВЕ
24 ч 48 ч
Время воздействия
72 ч
Рис. 2. Зависимость апоптотического индекса клеток в культуре А431 от концентрации СВЕ и времени инкубации.
ях могут встречаться крупные овальные и округлые митохондрии (рис. 3А). При добавлении спирта распределение митохондрий и их форма не изменяются (рис. 3Б).
Под действием СВЕ изменяется форма митохондрий, появляются многочисленные крупные округлые и овальные митохондрии, значительно превосходящие по размеру митохондрии в контрольных клетках. Число таких митохондрий в клетке может различаться, но в целом их, как правило, заметно меньше, чем в контрольных клетках.
Локализацию цитохрома с определяли иммуноцитохимически. Выход цитохрома с из митохондрий в цитозоль является ключевым процессом в апопто-зе, протекающем по митохондриальному («внутреннему») пути.
В контроле и в контроле с добавлением спирта антитела к цитохрому с выявляют данный белок в составе митохондрий. Как видно из рис. 4А,Б митохондрии небольшие, многочисленные, часто имеют нитевидную форму. Иногда встречаются небольшие овальные и округлые митохондрии.
В клетках, которые культивировали в присутствии СВЕ (рис. 4В-Е), можно проследить различную степень окрашивания цитоплазмы и разное количество окрашенных митохондрий, что свидетельствует о выходе цитохрома с из некоторых митохондрий в цитозоль. Так, на рис. 4Г видна клет-
А Б
5 мкм
В Г
Рис. 3. Митохондрии в клетках А431, окрашенные Mitotracker Orange. А - контроль; Б - контроль с добавлением спирта; В, Г - 40 мкМ СВЕ, 48 ч.
Рис. 4. Иммуно-цитохимическое выявление цитохрома с в клетках А431. А, Б - контроль; В-Е - 40 мкМ СВЕ, 48 ч.
Ц'Г ,.У
0*6
°
& °
Э- '¿'*Л С^- ° о У&Ш 'С/
ч' т+:
V #
.< о О
ы° Ог
4*
о С
• &
ос^:
о
о о
°°^-
8
в
Я?
•-Ж
0
50 мкм
Рис. 6. Прижизненное выявление пероксида водорода в клетках А431. А, В - Контроль; Б, Г - 40 мкМ СВЕ, 48 ч.
Рис. 5. Ультраструктура митохондрий в клетках А431. А - Контроль; Б - контроль с добавлением спирта; В-Д - 40 мкМ СВЕ, 48 ч.
ка, митохондрии в которой увеличены в размерах и приобрели округлую и овальную форму. При этом цитоплазма остается практически неокрашенной. На рис. 4Д представлена клетка, митохондрии в которой сходны по размеру с митохондриями контрольных клеток. Однако, в отличие от последних, они имеют вид коротких овальных телец. На рис. 4Е виден выход цитохрома с из митохондрий в цитозоль. Следует отметить, что отдельные митохондрии содержат цитохром с.
При ультраструктурном исследовании клеток эпидермоидной карциномы обнаруживаются небольшие митохондрии со светлым матриксом и сравнительно немногочисленными тонкими кристами (рис. 5А,Б). При воздействии СВЕ митохондрии претерпевают значительные изменения (рис. 5В-Д). На срезах могут встречаться гигантские митохондрии с большим количеством крист, митохондрии с инвагинациями, отдельные участки которых заполнены многочисленными кристами (рис. 5Г). В некоторых митохондриях матрикс уплотнен, а кристы расширены (рис. 5Д). Встречаются также митохондрии, ультраструктура которых практически такая же, как у митохондрий контрольных клеток. Интересно отметить, что митохондрии с различной
-£~X
Контроль Контроль 40 мкМ
+ спирт СВЕ
Рис. 7. Прижизненное выявление пероксида водорода в клетках А431. Доля окрашенных клеток в контроле и при воздействии 40 мкМ СВЕ в течение 48 ч.
ультраструктурой могут встречаться в цитоплазме одной и той же клетки. Возможно, гетерогенность популяции митохондрий отражает различные стадии изменений, происходящих с ними при воздействии СВЕ.
СВЕ повышает уровень АФК в клетках линии А431
Гибель клеток может опосредоваться увеличением продукции АФК. В связи с этим проведено прижизненное окрашивание клеток красителем DCFH-DA,
"3?
І
О I-с (и о с
6
<
8
6
4
2
0
что позволяет выявлять пероксид водорода. В контроле окрашивание выявляет одиночные флуоресцирующие клетки (рис. 6А,В), а добавление спирта видимых изменений не вызывает.
Воздействие 40 мкМ СВЕ в течение 48 ч приводит к значительному усилению продукции АФК в клетках. Доля окрашенных клеток (рис. 7) как в контроле, так и при добавлении 96% этанола относительно невысока и составляет 0.08 и 0.49% соответственно. При этом под действием СВЕ доля клеток с избыточным содержанием АФК значительно повышается и составляет 8.18%.
Таким образом, в ходе данной работы показано, что СВЕ дозозависимо индуцирует апоптоти-ческую гибель клеток в культуре эпидермоидной карциномы человека А431. Морфологически выявляются такие характерные для апоптоза признаки, как блеббинг, конденсация хроматина, фрагментация ядер и распад клетки на апоптотические тельца. Кроме того, апоптотический путь гибели подтверждается тем, что клетки окрашиваются антителами к активной форме каспазы-3. При этом таких признаков некроза, как набухание клетки, не обнаружено. Имеются данные о том, что СВЕ вызывает апоптотическую гибель злокачественных клеток желудка [22], толстого кишечника [10], молочной железы [23, 16], предстательной железы [17], легкого [24], шейки матки, яичника [25], клеток гепатомы [26], остеосаркомы [12, 13], мезоте-лиомы [27, 28], Т-клеточной лимфомы Jurkat [8, 18, 29] и других злокачественных линий кроветворных клеток [8, 19], меланомы и глиомы мыши и нейробластомы крысы и человека [30, 31]. Показано, что апоптоз вызывается микромолярны-ми концентрациями СВЕ, причем эффект зависит от концентрации и продолжительности инкубации [8, 18, 32-35]. Нами показано, что индукция апопто-за в клетках эпидермоидной карциномы человека также является дозозависимой.
В отличие от а-токоферола, известного своими ан-тиоксидантными свойствами, СВЕ является редокс-неактивным соединением и не обладает антиокси-дантными свойствами [35]. Напротив, как показано нами и другими авторами [21], в опухолевых клетках СВЕ способен действовать как прооксидант, усиливая генерацию кислородных радикалов.
Большое количество исследований указывает на то, что главной мишенью действия СВЕ на опухолевые клетки служат митохондрии [18, 19, 35-38]. Нами выявлено значительное изменение ультраструктуры митохондрий, а также выход цитохрома с из митохондрий в цитозоль клеток линии А431. Можно предположить, что усиление продукции АФК и выход цитохрома с представляют собой связанные
процессы. Многочисленные данные свидетельствуют о том, что СВЕ способен значительно повышать генерацию АФК в различных линиях клеток, таких, как клетки опухолей молочной железы человека и мыши, Т-клеточной лимфомы Jurkat, фибробласты легкого китайского хомячка, клетки злокачественной мезотелиомы, рака головы и шеи человека [27, 36-40]. В большинстве работ указывается, что ведущая роль в апоптозе, следующем за гиперпродукцией АФК, принадлежит супероксидному анион-радикалу, но Gu et al. [40] показали, что в клетках эпидермо-идной карциномы преобладает пероксид водорода, а количество супероксида незначительно. В данной работе выявлено также значительное увеличение доли клеток, в которых наблюдается гипергенерация АФК. Краситель DCFH-DA способен взаимодействовать с пероксидом водорода, следовательно, в нашей работе выявлено образование пероксида водорода. Поскольку в клетках пероксид образуется из супе-роксидного анион-радикала, по всей вероятности, первичной формой кислородных радикалов служит именно O2-.
Основное место образования АФК внутри клетки - митохондрии, где свободные радикалы генерируются благодаря работе цепи переноса электронов. Показано, что СВЕ способен подавлять активность комплексов I [41] и II дыхательной цепи митохондрий. Ингибирование комплекса II под действием СВЕ наблюдали в клетках рака молочной железы, клетках Jurkat, тимоцитах крысы [36, 42, 43]. Есть данные о том, что активность комплекса II снижается благодаря тому, что СВЕ служит псевдосубстратом для СДГ, связываясь с Qp- и QD-сайтами ферментного комплекса. Таким образом, ингибирование носит конкурентный характер. При замещении убихинона на СВЕ в сайте связывания убихинона электроны не транспортируются по гидрофильной части СДГ на FAD, [Fe-S]-центры, гем и убихинон. Вместо этого они рекомбинируют с молекулярным кислородом, образуя супероксидный анион-радикал, накопление которого, в конечном счете, может приводить к апопто-зу опухолевых клеток [38].
Известно, что усиление генерации АФК может запускать развитие апоптоза по митохондриальному пути. АФК способны опосредовать формирование дисульфидных мостиков между мономерами Bax в цитозоле, что приводит к образованию каналов во внешней митохондриальной мембране [42], а также разрушать связь цитохрома с с кардиолипином, мембранным фосфолипидом митохондрий, вызывая его гидропероксидацию [43, 44]. АФК, образующиеся при культивировании клеток в присутствии СВЕ, могут вызывать диссоциацию цитохрома c от кардио-
липина и выход белка в цитозоль, где цитохром c запускает активацию каспаз.
Отметим, что цитохром с выходит не одновременно из всех митохондрий. Даже в тех клетках, где цитоплазма достаточно сильно окрашена антителами к цитохрому c, сохраняется несколько митохондрий, содержащих цитохром c. При этом такие митохондрии, как правило, сильно увеличены в размерах и имеют овальную или округлую форму. Такие же крупные митохондрии выявляются при окрашивании клеток потенциал-зависимым красителем Mitotracker Orange. Поскольку для выхода цитохрома c необходимо нарушение проницаемости митохондриальной мембраны, выход должен сопровождаться потерей мембранного потенциала. Таким образом, нами показано, что при воздействии СВЕ в клетках могут сохраняться митохондрии, содержащие цитохром c и обладающие мембранным потенциалом, т.е. митохондрии, участвующие в синтезе АТР, продукция которого необходима даже на поздних этапах апоптоза, являющегося энергозависимым процессом.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Нами показано, что митохондрии являются важной мишенью действия СВЕ на культуру клеток эпидер-моидной карциномы А431. Обнаружено, что под действием СВЕ изменяется форма митохондрий и их ультраструктура, усиливается продукция АФК и выход цитохрома с из митохондрий в цитозоль, что приводит к запуску каспазозависимого апопто-за. Полученные результаты позволяют предложить следующий механизм индукции клеточной гибели под действием СВЕ. а-Токоферилсукцинат ингибирует действие комплекса II дыхательной цепи, в результате чего транспорт электронов нарушается, и усиливается образование АФК. АФК, в свою очередь, накапливаются в клетке и повреждают митохондрии, что приводит к выходу цитохрома c в цитозоль и запуску программы апоптотической каспазозависимой гибели клетки. •
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 11-04-01518-а).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Prasad K.N., Edwards-Prasad J. // J. Am. Coll. Nutr. 1992.
V. 11. P. 487-500.
2. Kelloff G.J., Crowell J.A., Boone C.W., Steele V.E., Lubet R.A., Greenwald P., Alberts D.S., Covey J.M., Doody L.A., Knapp G.G., et al. // J. Cell Biochem. Suppl. 1994. V. 20. P. 282-299.
3. Theriault R.L., Lipton A., Hortobagyi G.N., Leff R., Gluck S., Stewart J.F., Costello S., Kennedy I,. Simeone J, Seaman J.J., et al. // J. Clin. Oncol. 1999. V. 17. P. 846-854.
4. Fariss M.W., Fortuna M.B., Everett C.K., Smith J.D., Trent D.F., Djuric Z. // Cancer Res. 1994. V. 54. P. 3346-3351.
5. Kline K., Yu W., Sanders B.G. // Mol. Carcinog. 1998. V. 22.
№ 4. P. 247-257.
6. Kline K., Yu W., Sanders B.G. // J. Nutr. 2001. V. 131. P. 161163.
7. Malafa M.P., Neitzel L.T. // J. Surg. Res. 2000. V. 93. P. 163-170.
8. Neuzil J., Weber T., Gellert N., Weber C. // Br. J. Cancer. 2001. V. 84. P. 87-89.
9. Malafa M.P., Fokum F.D., Smith L., Louis A. // Ann. Surg. Oncol. 2002. V. 9. P. 1023-1032.
10. Weber T., Lu M., Andera L., Zhao Y. // World J. Gastroenterol. 2001. V. 7. P. 83-87.
11. Alleva R., Benassi M.S., Pazzaglia L., Tomasetti M., Gellert N., Borghi B., Neuzil J., Picci P. // Cancer Lett. 2006. V. 232.
№ 2. Р. 226-235.
12. Alleva R., Benassi M.S., Tomasetti M., Gellert N., Ponticelli F., Borghi B., Picci P., Neuzil J. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005. V. 331. № 4. P. 1515-1521.
13. Yu W., Sanders B.G., Kline K. // Nutr. Cancer. 2002. V. 43.
№ 2. P. 227-236.
14. Dong L.-F., Swettenham E., Eliasson J., Wang X.-F., Gold M., Medunic Y., Stantic M., Low P., Prochazka L., Witting P.K., et al. // Cancer Res. 2007. V. 67. P. 11906-11913.
15. Singh V.K., Brown S.D., Kao T.-C. // Int. J. Rad. Biol. 2010.
V. 86. № 1. P. 12-21.
16. Prochazka L., Dong L.F., Valis K., Freeman R., Ralph S.J., Turanek J., Neuzil J. // Apoptosis. 2010. V. 15. № 7. P. 782-794.
17. Shiau C.W., Huang J.W., Wang D.S., Weng J.R., Yang C.C.,
Lin C.H., Li C., Chen C.S. // J. Biol. Chem. 2006. V. 281. № 17.
P. 11819-11825.
18. Neuzil J., Svensson I., Weber T., Weber C., Brunk U.T. // FEBS Lett. 1999. V. 445. № 2-3. P. 295-300.
19. Yamamoto S., Tamai H., Ishisaka R., Kanno T., Arita K., Kobuchi H., Utsumi K. // Free Radic. Res. 2000. V. 33. № 4.
P. 407-418.
20. Yu W., Heim K., Qian M., Simmons-Menchaca M., Sanders B.G., Kline K. // Nutr. Cancer. 1997. V. 27. P. 267-278.
21. Gogvadze V., Norberg E., Orrenius S., Zhivotovsky B. // Int. J. Cancer. 2010. V. 127. № 8. P. 1823-1832.
22. Zhao Y., Zhao X., Yang B., Neuzil J., Wu K. // Cancer Lett. 2007. V. 247. № 2. P. 345-352.
23. Charpentier A., Groves S., Simmons-Menchaca M., Turley J., Zhao B., Sanders B.G., Kline K. // Nutr. Cancer. 1993. V. 19. P. 225-239.
24. Lim S.J., Choi M.K., Kim M.J., Kim J.K. // Exp. Mol. Med. 2009. V. 41. № 10. P. 737-745.
25. Anderson K., Simmons-Menchaca M., Lawson K.A., Atkinson J., Sanders B.G., Kline K. // Cancer Res. 2004. V. 64. № 12. P. 4263-4269.
26. Min J., Guo J., Zhao F., Cai D. // Wei Sheng Yan Jiu. 2003.
V. 32. № 4. P. 343-345.
27. Stapelberg M., Gellert N., Swettenham E., Tomasetti M., Witting P.K., Procopio A., Neuzil J. // J. Biol. Chem. 2005.
V. 280. № 27. P. 25369-25376.
28. Stapelberg M., Tomasetti M., Alleva R., Gellert N., Procopio A., Neuzil J. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. V. 318. № 3. P. 636-641.
29. Neuzil J., Zhao M., Ostermann G., Sticha M., Gellert N., Weber C., Eaton J.W., Brunk U.T. // Biochem. J. 2002. V. 362.
P. 709-715.
30. Rama B.N., Prasad K.N. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1983.
V. 174. № 2. P. 302-307.
31. Swettenham E., Witting P.K., Salvatore B.A., Neuzil J. // J. Neurochem. 2005. V. 94. № 5. P. 1448-1456.
32. Wu K., Zhao Y., Liu B.H., Li Y., Liu F., Guo J., Yu W.P. // World J. Gastroenterol. 2002. V. 8. № 1. P. 26-30.
33. Zu K., Hawthorn L., Ip C. // Mol. Cancer Ther. 2005. V. 4.
№ 1. P. 43-50.
34. Bellezza J., Tucci A., Galli F., Grottelli S., Mierla A.L., Polol-li F., Minelli A. // J. Nutr. Biochem. 2012. (Epub. ahead of print.)
35. Neuzil J., Tomasetti M., Zhao Y., Dong L.F., Birringer M., Wang X.F., Low P., Wu K., Salvatore B.A., Ralph S.J. // Mol. Pharmacol. 2007. V. 71. № 5. P. 1185-1199.
36. Wang X.F., Witting P.K., Salvatore B.A., Neuzil J. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005. V. 326. № 2. P. 282-289.
37. Petrova G.V. // Ukr. Biokhim. Zh. 2006. V. 78. № 4. P. 104-111.
38. Dong L.F., Low P., Dyason J.C., Wang X.F., Prochazka L., Witting P.K., Freeman R., Swettenham E., Valis K., Liu J., et al. // Oncogene. 2008. V. 27. № 31. P. 4324-4335.
39. Kang Y.H., Lee E., Choi M.K., Ku J.L., Kim S.H., Park Y.G., Lim S.J. // Int. J. Cancer. 2004. V. 112. № 3. P. 385-392.
40. Gu X., Song X., Dong Y., Cai H., Walters E., Zhang R., Pang X., Xie T., Guo Y., Sridhar R., et al. // Clin. Cancer Res. 2008.
V. 14. № 6. P. 1840-1848.
41. Dos Santos G.A., Abreu E., Lima R.S., Pestana C.R., Lima A.S., Scheucher P.S., Thome C.H., Gimenes-Teixeira H.L., Santana-Lemos B.A., Lucena-Araujo A.R., et al. // Leukemia. 2012. V. 26. № 3. P. 451-460.
42. Neuzil J., Wang X.F., Dong L.F., Low P., Ralph S.J. // FEBS Lett. 2006. V. 580. № 22. P. 5125-5129.
43. Dong L.F., Freeman R., Liu J., Zobalova R., Marin-Hernan-dez A., Stantic M., Rohlena J., Valis K., Rodriguez-Enriquez S., Butcher B., et al. // Clin. Cancer Res. 2009. V. 15. № 5.
P. 1593-1600.
44. D'Alessio M., De Nicola M., Coppola S., Gualandi G., Pugliese L., Cerella C., Cristofanon S., Civitareale P., Ciriolo M.R., Ber-gamaschi A., et al. // FASEB J. 2005. V. 19. № 11. P. 1504-1506.
