CC BY
225
УДК 616-002.1-092:616.155.34-091.818:577.152.1
ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ СТРЕСС В МОДУЛЯЦИИ АПОПТОЗА НЕЙТРОФИЛОВ В ПАТОГЕНЕЗЕ ОСТРЫХ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
Наталья Владимировна РЯЗАНЦЕВА1, Татьяна Васильевна ЖАВОРОНОК1,
Елена Алексеевна СТЕПОВАЯ1, Юрий Витальевич СТАРИКОВ1, Татьяна Сергеевна АГЕЕВА2, Виктор Яковлевич МИТАСОВ3, Евгений Георгиевич СОКОЛОВИЧ1
1ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Росздрава 634050, г. Томск, Московский тракт, 2
2ФГОУВПО Томский военно-медицинский институт МО РФ 634041, г. Томск, пр. Кирова, 49
3ММЛПУГородская больница № 1 634029, г. Томск, ул. Красноармейская, 14
Проведено исследование апоптоза нейтрофилов крови, полученных у пациентов с острыми воспалительными заболеваниями (внебольничная пневмония, острый аппендицит). Установлено повышение количества аннексин-положительных клеток, содержания белка Вах и продукции активных форм кислорода в нейтрофилах при остром воспалении разного генеза, сопоставимое с увеличением этих показателей при окислительном стрессе in vitro (в условиях инкубации нейтрофилов здоровых доноров с 5 мМ Н2О2). Приводятся данные об участии ключевых белков-регуляторов семейства Bcl-2 и основных элементов системы сигнальной трансдукции в опосредованной прооксидантами модуляции апоптоза эффекторных клеток острого воспаления. Показано, что в регуляцию апоптоза нейтрофилов при остром воспалении существенный вклад вносят цГМФ-зависимые механизмы, сопряженные с повышением синтеза оксида азота (NO), а в условиях окислительного стресса in vitro — Са2+- и цАМФ-зависимые процессы регуляции танатогенной программы.
Ключевые слова: нейтрофилы, апоптоз, острое воспаление, окислительный стресс.
Основное внимание при изучении патогенеза острых воспалительных заболеваний уделяется реакциям сосудистой системы и состоянию нейтро-фильных лейкоцитов, которые активно эмигрируют из крови в область повреждения, являясь эффекторами и модуляторами острой фазы воспаления. Патогенез острого воспаления во многом зависит от функциональной активности нейтрофилов, выполняющих микробицидные функции посредством фагоцитоза и продукции активных форм кислорода (АФК). Нейтрофилы становятся главным источником избытка АФК не только в клетках окружающих тканей. Гиперпродукция АФК в самих ней-трофильных гранулоцитах [1] может приводить к нарушению функций, повреждению и гибели клеток вследствие развития окислительного стресса (ОС) [2, 3]. Апоптоз нейтрофилов выступает доминирующим звеном патогенеза острых воспалительных заболеваний, поскольку быстро развивающаяся спонтанная и активированная элиминация
эффекторных клеток обеспечивает сдерживающий механизм поражения тканей и разрешение процесса воспаления [1, 4]. Регуляция апоптоза нейтро-филов опосредована внутриклеточными сигнальными системами (Са2+, цАМФ, цГМФ) и балансом ключевых про- и антиапоптотических белков [1, 5], особенно в ситуациях, связанных с нарушением редокс-метаболизма клетки [6]. Одним из ведущих факторов, участвующих как в формировании ОС, так и в развитии апоптоза, выступает оксид азота (N0). При этом описаны диаметрально противоположные эффекты N0 на развитие программы клеточной гибели [7—10]. Установление молекулярных механизмов регуляции продолжительности жизни нейтрофильных лейкоцитов необходимо для создания селективных технологий управления воспалительным процессом.
Целью настоящей работы была идентификация редокс-опосредованных молекулярных мишеней, участвующих в механизмах регуляции программи-
Рязанцева Н.В. — д.м.н., проф., зав. кафедрой фундаментальных основ клинической медицины, е-таИ: ryazan@mail.tomsknet.ru
Жаворонок Т.В. — к.м.н., доцент кафедры биохимии и молекулярной биологии, е-таИ: tavaza@ngs.ru Степовая Е.А. — д.м.н., проф. кафедры биохимии и молекулярной биологии, е-mail: muir@mail.ru Стариков Ю.В. — к.м.н., ст. лаборант кафедры фундаментальных основ клинической медицины, е-mail: cnil@mail.ru
Агеева Т.С. — к.м.н., доцент, зав. кафедрой терапии и усовершенствования врачей, е-mail: ts.ageeva@mail.ru Митасов В.Я. — к.м.н., зав. хирургическим отделением, е-mail: mitasov1960@mail.ru Соколович Е.Г. — д.м.н., проф. кафедры госпитальной хирургии, е-mail: sokole@vtomske.ru
рованной гибели нейтрофилов нри остром воспалительном процессе.
Материал и методы
Mатериалом для исследования служили нейтрофилы венозной крови, полученной у 54 пациентов с острыми воспалительными заболеваниями (30 мужчин и 24 женщины) в возрасте от 18 до 50 лет (32,0 ± 3,0 лет), в том числе 29 больных внебольничной пневмонией средней степени тяжести (13 мужчин и 16 женщин) и 25 лиц с острым катаральным или флегмонозным аппендицитом (17 мужчин и 8 женщин). Все пациенты поступали в стационар в порядке скорой медицинской помощи, после получения информированного согласия до проведения терапии у них забирали кровь с использованием стандартных вакуумных систем BD VACUTAINER™ с гепарином лития. ^тролем служили интактные нейтрофилы, полученные у 32 здоровых доноров (18 мужчин и 14 женщин) в возрасте от 18 до 45 лет (25,0 ± 5,4 лет). Исследования одобрены этическим комитетом ГОУ ВПО CибГMУ Росздрава, протокол № 23 от 15.11.2004.
^п^офильные лейкоциты выделяли на двойном градиенте плотности Ficoll-Paque (1,077 г/см3) (GE Healthcare, Швеция) и фиколл-урографин (1,095 г/см3) (фиколл — GE Healthcare, Швеция; уро-графин — Шеринг, Россия). Суспензию нейтрофилов трижды отмывали в среде RPMI-1640 (Вектор-Бест, Россия), количество клеток стандартизовали до 2 x 10 6 в 1 мл среды. Жизнеспособность ней-трофилов в тесте с 0,5% трипановым синим (Serva, CШA) составляла 95 %. Выделенные клетки культивировали в течение 18 ч в присутствии 5 % СО2 нри 37 °С в полной питательной среде RPMI-1640, содержащей 0,3 мг/мл L-глутамина, 100 мкг/мл ген-тамицина, 2 мM HEPES (Flow, Великобритания), 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (Биолот, Россия), инактивированной нри 56 °С в течение 30 мин. Праймированные нейтрофилы нри остром воспалении по многим характеристикам отличны от нестимулированных клеток в здоровом организме. С целью стандартизации исследований проводили контрольный эксперимент in vitro по моделированию ОС в нейтрофилах, полученных у здоровых доноров, для чего в клеточные культуры добавляли H^2 в конечной концентрации 5 мM, способной вызывать апоптоз максимального возможного числа клеток без активации процессов некроза [7].
В культурах нейтрофилов оценивали число клеток, вступивших в апоптоз, внутриклеточное содержание AФK и Са2+ методом лазерной проточной цитометрии с использованием цитофлуориметра Epics XL (Beckman Coulter, Франция). Для оценки раннего апоптоза нейтрофилы инкубировали 10 мин с FITC-меченным аннексином V (Beckman Coulter, Франция), связывающимся с фосфатидилсерином на внешней поверхности плазмалеммы [11]. Результат выражали в числе (%) клеток, вступивших в анонтоз. Продукцию AФK в нейтрофилах онреде-ляли, инкубируя клетки в течение 20 мин в присутствии дихлорфлюоресцеина диацетата (Sigma
Aldrich, CШA) [12] — красителя, который начинает флуоресцировать носле реакции с H^2. Содержание кальция в нейтрофилах определяли методом [13], инкубируя клетки 10 мин с липофильным зондом Fluo 3 AM (MP Biomedicals, СШД), способным флуоресцировать носле связывания с ионами Са2+. В обоих случаях результат представляли в условных единицах (у.е.), что было равно отношению интенсивности флуоресценции дихлорфлюоресцеина диацетата или, соответственно, Fluo 3 AM к общему числу клеток (интенсивность свечения на клетку).
Hаличие ключевых белков-регуляторов апопто-за Bax и Bcl-2 в нейтрофилах определяли методом вестерн-блоттинга. Kлеточные экстракты получали путем лизиса нейтрофилов в фосфатно-солевом буфере, содержащем 50 мЫ трис-HCl буфера ^H 6,5), 100 мЫ дитиотреитола (Helikon, СШЛ), 2 % додецилсульфата натрия (Helikon, CШA), 0,1 % бромфенолового синего, 15 % глицерола (Helikon, CШA), смесь протеазных ингибиторов (Sigma Aldrich, CШA). Белки разделяли по молекулярной массе под действием электрического поля в течение 60 мин при напряжении 120 В, затем электрофоретически переносили на нитроцеллюлоз-ную мембрану в течение 90 мин при силе тока 60 мA. Hитроцеллюлозные блоты блокировали 5% обезжиренным сухим молоком в фосфатно-солевом буфере, инкубировали с первичными антителами к белкам Bax или Bcl-2 (Biosource, CШA) (разведение 1:200 — 1:400), добавляли вторичные антитела с пероксидазной меткой (Biosource, CШA), визуализировали результаты с помощью преципитирующего субстрата пероксида-зы. В качестве стандарта и внутреннего контроля использовали глицеро-3-фосфат-дегидрогеназу (антитела фирмы Chemicon, CШA), выражая результат как соотношение сигнала определяемого белка и сигнала глицеро-3-фосфат-дегидрогеназы.
Содержание циклических нуклеотидов (цAMФ и цГMФ) в нейтрофилах оценивали методом конкурентного твердофазного радиоиммунного анализа с иснользованием наборов «RIA AMPc/cAMP» и «RIA сGMP» (Immunotech, Франция). В среде инкубации нейтрофилов определяли количество метаболитов NO методом, основанным на цветной реакции с реактивом Грисса, содержащим 1 % сульфаниламида (MP Biomedicals, CШA) и 0,1 % нафтилендиамина (MP Biomedicals, CШA), разведенных в 12% уксусной кислоте [14]; неред определением восстанавливали имеющиеся в среде нитраты до нитритов, иснользуя омедненный кадмиевый редуктор. Ke-либровочную кривую строили по нитриту натрия в дианазоне концентраций от 0 до 150 мкM.
Полученные данные обрабатывали методами вариационной статистики и представляли в виде медианы ^е), верхнего и нижнего квартилей (Qj—Q3). ^рмальность распределения полученных результатов оценивали с помощью критерия ^лмогорова — Смирнова, достоверность различий средних величин — с помощью непараметрического критерия Mанна — Уитни. Различия считали достоверными при уровне значимости р < 0,05.
Результаты и обсуждение
На первом этапе работы определяли признаки формирования ОС и активации программы гибели нейтрофилов при острых воспалительных заболеваниях разного генеза — внебольничной пневмонии и остром аппендиците. Было обнаружено, что внутриклеточная продукция АФК, проапоптотическо-го белка Вах в нейтрофильных лейкоцитах и число аннексин-положительных клеток значимо превышали контрольные величины (р < 0,05) и статистически не отличались в обеих подгруппах (р > 0,05) (табл. 1, рис.). В нейтрофилах не был обнаружен антиапоптотический протеин Вс1-2, что согласуется с данными литературы [4].
Обращало на себя внимание отсутствие значимых различий в значениях показателей у больных острым аппендицитом и у пациентов с внебольничной пневмонией. Данный фактический материал может быть свидетельством формирования при острых воспалительных заболеваниях разной локализации типовых реакций клеток на ОС, обеспечивающих, в частности, элиминацию нейтрофилов, в том числе путем апоптоза. Это позволило объединить обе обследован-
ные категории больных в одну клиническую группу (табл. 1), далее в работе для сравнительного анализа использовали данные объединенной группы.
Одной из основных мишеней АФК являются митохондрии, которым принадлежит ключевая роль в реализации внутреннего пути клеточной гибели. АФК вызывают открытие пор в митохондриальной мембране с последующим выходом в цитозоль проапоптотических белков (цитохром с, АЩ Smac, прокаспаза 9, эндонуклеаза G и др.) и ионов кальция [1, 3]. В свою очередь, высвобождение цитохрома с приводит к резкому повышению продукции АФК в клетках и активации каспазного каскада. АФК также могут влиять на жизнеспособность клетки, меняя экспрессию ряда генов за счет активации факторов транскрипции — р53, NF-кB, АР-1 [2]. Вероятно, формирование ОС в эффекторных клетках острого воспаления изменяет функционирование редокс-чувствительных сигнальных систем, внося существенный вклад в индукцию танатоген-ной программы нейтрофилов и определяя активацию синтеза проапоптотических белков семейства Вс1-2, в том числе белка Вах.
Таблица 1
Количество аннексин-положительных и некротических клеток, содержание метаболитов N0 в среде инкубации и внутриклеточная продукция активных форм кислорода в культурах нейтрофилов крови при остром воспалительном процессе и экспериментальном окислительном стрессе (Ме(Q1—Q3))
Группы обследованных Количество аннексин-положительных клеток, % Количество нейтрофилов, окрашенных трипановым синим, % Содержание метаболитов N0 в среде инкубации, мкМ Продукция АФК, у.е. (интенсивность свечения на клетку)
Здоровые доноры Интактные нейтрофилы (контроль), п = 32 49,25 (45,03-58,13) 3,20 (2,70-3,90) 0Д08 (0Д06-0ДЮ) 0,240 (0,224 - 0,259)
Нейтрофилы, инкубированные с 5 мМ Н2О2, п = 32 61,10 (57,80-67,50) р1 < 0,05 4,30 (3,50-5,60) р2 > 0,05 0,Ш (0Д20-0Д32) р2 < 0,05 0,678 (0,596-0,705) р2 < 0,05
Пациенты с острыми воспалительными заболеваниями Нейтрофилы пациентов с острыми воспалительными заболеваниями, п = 54 61,75 (56,93-65,80) р1 < 0,05 р2 > 0,05 055 ,0 ,0 ,0 70 -6, 0, 0, ^ А> 0,257 (0Д53-0,Ш) р2 < 0,05 р2 < 0,05 0,659 (0,568-0,698) р2 < 0,05 р2 > 0,05
Нейтрофилы пациентов с внебольничной пневмонией, п = 29 62,37 (54,25-69,20) р2 < 0,05 р2 > 0,05 5,50 (4,30-6,50) р2 < 0,05 р2 > 0,05 0,Ш (0Д36-0Д50) р2 < 0,05 р2 < 0,05 0,653 (0,574-0,728) р2 < 0,05 р2 > 0,05
Нейтрофилы пациентов с острым аппендицитом, п = 25 57,40 (51,37-62,37) р2 < 0,05 р2 > 0,05 р3 > 0,05 4,20 (3,80-5,70) р2 < 0,05 р2 > 0,05 р3 > 0,05 0,258 (0Д49-0Д63) р2 < 0,05 р2 < 0,05 р3 > 0,05 0,673 (0,562-0,690) р2 < 0,05 р2 > 0,05 р3 > 0,05
Примечание: здесь и в табл. 2: р1 — достоверность отличия показателя от значения, полученного у здоровых доноров (контроль); р2 — достоверность отличия показателя от значения в условиях экспериментального окислительного стресса (культивирование нейтрофилов с 5 мМ Н2О2); р3 — достоверность отличия показателя от значения, полученного у пациентов с внебольничной пневмонией; п — количество обследованных в группе.
Рис. Содержание белка Вах в культурах нейтрофилов при острых воспалительных заболеваниях и окислительном стрессе in vitro (по отношению к сигналу белка глицеро-3-фосфат-дегидрогеназы, используемого при вестерн-блот анализе в качестве стандарта и внутреннего контроля).
К — интактная культура клеток здоровых доноров (показатель принят за 100 %); ОС — клетки здоровых доноров, культивированные с 5 мМ Н2О2; ВП — культуры клеток, полученных у больных внебольничной пневмонией; ОА — культуры клеток, полученных у больных острым аппендицитом;
* — отличие от контроля достоверно при p < 0,05
При инкубации клеток, полученных у здоровых доноров, с 5 мМ Н2О2 в нейтрофилах оценивали те же параметры, что и при острых воспалительных заболеваниях (табл. 1, рис.). Пероксид водорода индуцировал в нейтрофилах экспериментальный ОС, сопровождающийся выраженной активацией апоп-тоза, и способствовал достижению показателей, сравнимых с выявленными при остром воспалении. Эти факты свидетельствуют о соответствии используемой нами модели ОС и выбранной концентрации Н2О2 задаче имитации поведения нейтрофилов при вхождении в апоптоз в ходе острых воспалительных заболеваний.
В условиях ОС in vitro усиление генерации АФК в нейтрофилах приводило к росту проницаемости мембран митохондрий, на что указывало увеличение
концентрации Са2+ в цитозоле клеток по сравнению с контролем (р < 0,05) (табл. 2). Принимая во внимание, что митохондрии являются резервуаром ионов кальция и проапоптотических факторов, изменение проницаемости мембран этих органелл критично для адекватной регуляции гомеостаза клетки. В низких концентрациях ионы кальция в качестве внутриклеточных мессенджеров опосредуют регуляцию метаболизма клетки. Поступление в цитоплазму высоких концентраций Са2+, равно как и цитохрома с, приводит к запуску программированной клеточной гибели [3]. Проницаемость мембран митохондрий во многом определяется экспрессией белков семейства Bcl-2. Зарегистрированные нами активация апоптоза нейтрофилов с увеличением уровня белка Вах и рост концентрации ионов кальция в цитоплазме клеток указывают на участие данного белка в образовании пор, обеспечивающих выход Са2+ из матрикса и апоптоз-индуцирующих протеинов из межмем-бранного пространства митохондрий. Под действием стрессовых стимулов Вах может олигомеризоваться и за счет изменений конформации образовывать поры в мембранах [15]. Олигомерные комплексы белка Вах также способны участвовать в активации митохондриального пути регуляции апоптоза и активировать поры пермеабилизационного перехода, образованные VDAC (потенциал-зависимый анионный канал), ANT (транслоказа адениловых нуклеотидов) и циклофилином D, тем самым дополнительно содействуя выходу из митохондрий Са2+ и апоптоз-индуцирующих протеинов.
Однако на фоне острого воспаления количество ионов Са2+ в цитоплазме нейтрофильных грануло-цитов было достоверно ниже аналогичного показателя при индукции ОС in vitro (р < 0,05) и регистрировалось на уровне значений контроля (р > 0,05). Ограничение выхода Са2+ в цитозоль нейтрофилов может быть обусловлено действием цитокинов и редокс-регуляцией компонентов кальциевого гомеостаза. Это необходимо для оптимизации передачи сигналов в клетке посредством Ca2+, их направлен-
Таблица 2
Внутриклеточная концентрация ионов кальция и циклических нуклеотидов в культурах нейтрофилов, полученных у больных острыми воспалительными заболеваниями и в условиях окислительного стресса in vitro (Mе(Q—Q3))
Группы обследованных Содержание цАМФ, нМ/106 клеток Содержание цГМФ, нМ/106кл цАМФ/ цГМФ Содержание Са2+, у.е.
Нейтрофилы здоровых доноров (контроль), п = 32 114,13 (101,96-120,55) 12,25 (10,48-17,04) 9,32 0,220 (0,114-0,234)
Нейтрофилы здоровых доноров, инкубированные с 5 мМ Н2О2, п = 32 134,97 (117,36-139,39) p1 < 0,05 4,16 (3,91-7,88) p1 < 0,05 32,44 0,444 (0,403-0,489) p1 < 0,05
Нейтрофилы пациентов с острыми воспалительными заболеваниями, п = 54 88,58 (67,42-121,71) p2 < 0,05 р21 < 0,05 4,06 (3,48-5,79) p2 < 0,05 р21 > 0,05 21,82 0,231 (0,211-0,263) р1 > 0,05 р21 < 0,05
ности и эффективности с целью поддержания адекватности функционирования и длительности жизни эффекторных клеток в условиях острого воспаления. В частности, нейтрофилам для выброса бактерицидного содержимого из вторичных или азурофильных гранул требуется рост концентрации внутриклеточного Ca2+ лишь в небольших пределах.
Важнейший вклад в развитие ОС вносит оксид азота, который одновременно является медиатором клеточного метаболизма. Нами отмечен значимый рост содержания метаболитов NO в среде инкубации нейтрофилов относительно контрольных величин как в случае острого воспаления (р < 0,05), так и при ОС in vitro (р < 0,05) (табл. 1). Однако значения данного показателя у пациентов с воспалительными заболеваниями были выше таковых при моделировании ОС (р < 0,05). Это может быть обусловлено необходимостью дополнительного образования NO с целью дилатации стенок сосудов в условиях гипоксии, сопутствующей острому воспалению. В нейтрофилах, стимулированных при остром воспалении флогоге-ном и цитокинами (TNFa, IL-8 и др.), активируется индуцибельная NO-синтаза, которая не нуждается в Са2+ и может поддерживать высокую активность несколько дней [1, 2]. При развитии ишемии в ходе воспаления стационарные концентрации NO достигают микромолярных значений, что резко увеличивает вероятность взаимодействия молекул NO с образованием NO 2, который является более сильным прооксидантом и нитрозилирующим агентом [10], а также появления других активных метаболитов — пе-роксинитрита ONOO-, ионов нитрозония NO+, ни-троксила NO- и др. Такое разнообразие метаболитов повышает возможность участия в регуляции апоп-тоза молекул NO, которые способны проявлять как антиапоптотические [2, 8, 9], так и проапоптотиче-ские эффекты [4, 8].
Основной мишенью NO в клетке является растворимая гуанилатциклаза, которая в ответ на стимул продуцирует внутриклеточный мессенджер цГМФ, активирующий систему G-киназ Са2+-каналов эндо-плазматического ретикулума и снижение концентрации внутриклеточного кальция [10]. В связи с этим одним из механизмов ограничения фатального выхода Са2+ в цитозоль нейтрофилов при остром воспалении могло стать поддержание на более низком уровне индекса цАМФ/цГМФ — 21,82, который в условиях ОС in vitro составил 32,44 (табл. 2). Известно, что в регуляцию апоптоза нейтрофилов весомый вклад вносит сеть цАМФ-опосредованных сигналов [5]. В нашем исследовании цАМФ-зависимые механизмы были более актуальны при развитии апоптоза нейтрофилов в условиях ОС in vitro, чем в случае программированной гибели праймированных нейтрофилов, испытывающих редокс-дисбаланс при остром воспалении.
Заключение
Культивирование нейтрофилов, полученных у здоровых лиц, с 5 мМ Н2О2 приводит к повышению внутриклеточного уровня АФК и развитию ОС, сопряженного с активацией апоптотической программы, что
сопоставимо с ситуацией при остром воспалительном процессе. Развитие апоптоза нейтрофилов при остром воспалении в клинике внутренних болезней и при экспериментальном ОС сопровождается ростом содержания в клетках проапоптотического протеина Вах и отсутствием экспрессии антиапоптотического белка Bcl-2. Реализация летальной программы нейтрофилов при ОС in vitro в большей мере связана с выходом в цитозоль Са2+ и ростом уровня цАМФ, чем в случае нарушения окислительно-восстановительного гомеостаза этих клеток при остром воспалении, когда более существенным становится вклад NO/цГМФ-опосредованных механизмов. Следовательно, для эффективного функционирования и оптимизации срока жизни в условиях острого воспаления нейтрофилы нуждаются в поддержании редокс-статуса, зависящего от соотношения и выраженности продукции активных форм кислорода и азота, индуцирующих разнонаправленные каскады регуляторных сигналов в отношении клеточных мишеней, опосредующих развитие/блокирование апоптоза. Дизрегуляция апоптоза нейтрофилов, вовлеченных в процесс острого воспаления в различных тканях, может приводить к пролонгации и хронизации воспалительного процесса.
Благодарности
Работа выполнена в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научнотехнологического комплекса России на 2007— 2012 годы» (ГК № 02.740.11.0311, ГК № 02.740.11.5031) и при финансовой поддержке РФФИ 2009—2010 гг. (гранты 09-04-99026-р_офи, 09-04-99025-р_офи).
Список литературы
1. Maianski N.A., Maianski A.N., Kuijpers T.W., Roos D. Apoptosis of neutrophils // Acta Haematol. 2004. 111. 56—66.
2. Меньщикова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков Н.К. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. М.: Слово, 2006. 556 с.
Men’shchikova E.B., Lankin V.Z., Zenkov N.K. Oxidative stress. Pro-oxidants and anti-oxidants. M.: Slovo, 2006. 556p.
3. Tiwari B.S., Belenghi B., Levine A. Oxidative stress increased respiration and generation of reactive oxygen species, resulting in ATP depletion, opening of mitochondrial permeability transition, and programmed cell death // Plant Physiol. 2002. 128. 1271—1281.
4. Regulation of neutrophil apoptosis / S.W. Edward , D.A. Moulding, M. Derouet, R. Moots // J. Chem Immunol Allergy.2003. Vol. 83. P. 204—224.
5. Krakstad C. cAMP protects neutrophils against TNF-alpha-induced apoptosis by activation of cAMP-dependent protein kinase, independently of exchange protein directly activated by cAMP (Epac) // C. Krakstad, A.E. Christensen, S.O. Daskeland // J. Leukoc. Biol. 2004. Vol. 76. P. 641—647.
6. Melley D.D., Evans T. W., Quinlan G.J. Redox regulation of neutrophil apoptosis and the systemic inflammatory response syndrome // Clin. Sci. 2005. 108. 413—424.
7. Степовая Е.А., Жаворонок Т.В., Стариков Ю.В. и др. Регуляторная роль оксида азота в апоптозе нейтрофилов // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 2008. 146. (12). б4б—650.
Stepovaya E.A., Zhavoronok T.V., Starikov Yu.V. et al. Regulatory role of nitric oxide in neutrophil apoptosis // Bul. eksperim. biologii i mediciny. 2008. 146. (12). 646-650.
8. Bruene B., Knethen V.A., Sandau K. Nitric oxide (NO): an effector of apoptosis // Cell Death Differ. 1999. 6. 969-975.
9. Choi B.M., Pae H.O., Jang S.I., Chung H.T. Nitric oxide as a pro-apoptotic as well as anti-apop-totic modulator // J. Biochem. Mol. Biol. 2002. 35. 116-126.
10. Tuteja N., Chandra M., Tuteja R., Misra M. Nitric oxide as a unique bioactive signaling messenger in physiology and pathophysiology // J. Biomed. Biotech. 2004. 24. 227-237.
11. Van Engeland M., Nieland L.J.W., Ramaek-ers F. C. et al. Annexin V-affinity assay: a review on an
apoptosis detection system based on phosphatidylserine exposure // Cytometry. 1998. 31. 1—9.
12. Bass D.A., Parce J.W., Dechatelet L.R. et al. Flow cytometric studies of oxidative product formation by neutrophils: A graded response to membrane stimulation // Immunol. 1983. 130. 1910-1917.
13. Merritt J.E., Mc Carthy S.A., Davies M.P., Moores K.E. Use of fluo-3 to measure cytosolic Ca2+ in platelets and neutrophils. Loading cells with the dye, calibration of traces, measurements in the presence of plasma, and buffering of cytosolic Ca2+ // J. Biochem. 1990. 269. 513-519.
14. Голиков П.П. Оксид азота в клинике неотложных заболеваний. M., 2004. 180 с.
Golikov P.P. Nitric oxide in clinical picture of emergency diseases. M., 2004. 180 p.
15. Mikhailov V., Mikhailova M., Degenhardt K. et al. Association of Bax and Bak homo-oligomers in mitochondria. Bax requirement for Bak reorganization and cytochrome c release // J. Biol. Chem. 2003. 278. 5367-5376.
OXIDATIVE STRESS IN NEUTROPHIL CELL DEATH MODULATION DURING PATHOGENESIS OF ACUTE INFLAMMATORY DISEASES
Natal’ya Vladimirovna RYAZANTSEVA1, Tat’yana Vasil’evna ZHAVORONOK1,
Elena Alekseevna STEPOVAYA1, Yurii Vital’evich STARIKOV1, Tat’yana Sergeevna AGEEVA2,
Viktor Yakovlevich MITASOV3, Evgenii Georgievich SOKOLOVICH1
1Siberian State Medical University 634050, Tomsk, Moskovskii tract, 2
2Tomsk Military Medical Institute 634041, Tomsk, Kirov av., 49
3City Hospital № 1
634029, Tomsk, Krasnoarmeiskaya st., 14
The research of blood neutrophils taken from patients with acute inflammatory diseases (community-acquired pneumonia and acute appendicitis) has been conducted. The increase in annexin-positive cells amount, protein Bax content and oxygen active forms production in neutrophils at acute inflammation of various genesis comparable to the increase of these indices at oxidative stress in vitro (in conditions of neutrophils of healthy donors incubating with 5 iwM H2O2) has been determined. The data on participation of key protein-regulators of family Bcl-2 and signal transduction system basic elements in oxidant-mediated modulation of acute inflammation effector cells apoptosis are given. It has been revealed that cGMP-dependent mechanisms (connected with the increased NO content) contribute greatly to neutrophil cell death regulation during acute inflammation, and during oxidative stress in vitro Ca2+- and cAMP-dependent processes of thanatogenic program regulation.
Key words: neutrophils, apoptosis, oxidative stress, acute inflammation.
Ryazantseva N.V. — doctor of medical sciences, head of the chair for fundamental and clinical medicine, e-mail: ryazan@mail.tomsknet.ru
Zhavoronok T.V. — candidate of medical sciences, assistant professor of the chair for biochemistry and molecular biology, e-mail: tavaza@ngs.ru
Stepovaya E.A. — doctor of medical sciences, professor of the chair for biochemistry and molecular biology, e-mail: muir@mail.ru
Starikov Yu.V. — candidate of medical sciences, senior laboratory assistant of the chair for fundamental basis of clinical medicine, cnil@mail.ru
Ageeva T.S. — candidate of medical sciences, assistant professor of the chair for therapy and physician advanced training, e-mail: ts.ageeva@mail.ru
Mitasov V.Ya. — candidate of medical sciences, head of the surgical department, e-mail: mitasov19б0@mail.ru Sokolovich E.G. — doctor of medical sciences, professor of the chair for hospital surgery, e-mail: sokole@vtomske.ru
