CC BY
83
УДК 576.32/.36
Роль дигидрооротатдегидрогеназы в индукции апоптоза при ингибировании III комплекса дыхательной цепи митохондрий
А. А. Хуторненко1, А. А. Далина3, Б. В. Черняк1, П. М. Чумаков3, А. Г. Евстафьева1,2* Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119992, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 40
2Факультет биоинженерии и биоинформатики Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119992, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 73
3Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, 119991, Москва, ул. Вавилова, 32 *E-mail: Evstaf@genebee.msu.ru Поступила в редакцию 12.08.2013
РЕФЕРАТ Изучен механизм включения программируемой клеточной смерти (апоптоза) при нарушении функционирования дыхательной цепи митохондрий. Ранее мы обнаружили, что ингибирование митохондриального цитохрома Ьс1 (комплекса III дыхательной цепи) приводит к повышению уровня и активности опухолевого супрессора р53 и индукции апоптоза. С дыхательной цепью сопряжен путь биосинтеза пири-мидинов de novo через митохондриальную дигидрооротатдегидрогеназу (ДГОДГ). Нами показано, что причиной активации р53 при ингибировании комплекса III дыхательной цепи митохондрий служит нарушение работы ДГОДГ и биосинтеза пиримидинов de novo. Однако является ли подавление функционирования ДГОДГ основной причиной включения апоптотической программы клетки при ингибировании комплекса III дыхательной цепи, оставалось не выясненным. В настоящей работе установлено, что апоптотическую гибель клеток рака толстого кишечника человека при действии миксотиазола - ингибитора комплекса III дыхательной цепи митохондрий - предотвращают уридин и оротат (продукт реакции, катализируемой ДГОДГ), но не дигидрооротат (субстрат ДГОДГ). Следовательно, индукция апоптоза при нарушении работы комплекса III обусловлена ингибированием ДГОДГ и, как следствие, биосинтеза пиримидинов de novo. Этот вывод подтвержден результатами опытов по подавлению экспрессии ДГОДГ с помощью РНК-интерференции. Оказалось, что нокдаун ДГОДГ приводит к аккумуляции опухолевого супрессора р53 и способствует программируемой клеточной смерти.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА апоптоз, биосинтез пиримидинов de novo, дигидрооротатдегидрогеназа, дыхательная цепь митохондрий, опухолевый супрессор р53.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ДГОДГ - дигидрооротатдегидрогеназа; ДЦМ - дыхательная цепь митохондрий; ДСН - додецилсульфат натрия; ПААГ - полиакриламидный гель; shRNA - малые шпилечные РНК; PrI -йодид пропидия; FITC - флуоресцеинизотиоцианат.
ВВЕДЕНИЕ
Митохондрии играют центральную роль в гомеостазе эукариотической клетки. Они не только снабжают клетку энергией за счет окислительного фосфори-лирования, но и служат важными медиаторами программируемой клеточной смерти, а также внутриклеточных сигнальных каскадов, опосредуемых ионами кальция и активными формами кислорода [1]. Дыхательная цепь митохондрий (ДЦМ) состоит из интегрированных во внутреннюю митохондриальную мембрану мультикомпонентных белковых комплек-
сов I-IV, которые катализируют перенос электронов от NADH на молекулярный кислород. Это приводит к образованию электрохимического протонного градиента на внутренней мембране митохондрий, который является движущей силой синтеза АТР с помощью АТР-синтазы (комплекс V).
Установлено, что многие заболевания человека связаны с нарушениями функций митохондрий, причем так называемые «митохондриальные болезни» обусловлены, как правило, дефектами дыхательной цепи этих органелл [2]. Отклонения в работе мито-
хондрий вовлечены в процесс старения [3]. С возрастом в митохондриальной ДНК млекопитающих увеличивается число мутаций и наблюдается нарушение функций дыхательной цепи. Клетки с дефектами в ДЦМ склонны к апоптозу, и усиленная потеря клеток является важным следствием митохондриальной дисфункции. В данной работе мы обратились к механизму включения апоптотической программы при нарушении функционирования ДЦМ.
Опухолевый супрессор р53 - это ключевой регуляторный белок, от которого во многих случаях зависит поведение клетки при разных видах стресса: произойдет ли арест клеточного цикла, сопровождающийся репарацией повреждений, или включатся механизмы программируемой клеточной смерти, направленные на удаление клеток с нерепарируемыми повреждениями [4]. Ранее мы обнаружили, что ингибирование комплекса III ДЦМ приводит к повышению уровня р53 и его активности, к включению программируемой смерти раковых клеток человека [5]. Оказалось, что к активации р53 приводит не ингибирование ДЦМ само по себе, а нарушение функционирования именно комплекса III (комплекс цитохрома Ьс1), который переносит электроны от восстановленного убихинона (убихинола) на цитохром с. С ДЦМ сопряжен один из важнейших метаболических путей в клетке - биосинтез пиримидинов de novo [6]. Единственный митохондриальный фермент этого пути -это дигидрооротатдегидрогеназа (ДГОДГ), окисляющая дигидрооротат до оротата и использующая убихинон в качестве акцептора электронов [6]. Нарушение работы комплекса III ДЦМ приводит к переходу убихинона в восстановленное состояние, что, в свою очередь, может ингибировать работу ДГОДГ и вести к нарушению биосинтеза пиримидинов. Нам действительно удалось показать, что возрастание уровня и активности р53 при ингибировании комплекса III ДЦМ обусловлено нарушением работы ДГОДГ и биосинтеза пиримидинов de novo [5]. Однако служит ли подавление функционирования ДГОДГ основной причиной включения апоптотической программы клетки при ингибировании комплекса III ДЦМ, оставалось не выясненным.
В настоящей работе показано, что нарушение работы ДГОДГ и, как следствие, биосинтеза пирими-динов de novo служит причиной индукции апоптоза в клетках рака толстого кишечника человека при ингибировании комплекса III ДЦМ.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Условия выращивания и обработки клеток
Клетки RKO и НСТ116 рака толстого кишечника человека выращивали на среде DMEM, содержавшей
10% телячьей эмбриональной сыворотки (HyClone), при 370С и 5% СО2 до состояния 50-70% конфлюэнт-ности. После этого клетки инкубировали в течение 12 ч для определения уровня р53 и в течение 20-2б ч для анализа апоптоза в присутствии 200 нМ миксоти-азола (Sigma-Aldrich Inc.). В некоторых опытах в среду добавляли уридин до конечной концентрации 50 мкг/мл, оротат или дигидрооротат (Sigma-Aldrich Inc.) до конечной концентрации 1 мМ.
Оценка апоптоза методом проточной цитофлуориметрии
Клетки снимали с подложки трипсинолизом, промывали раствором фосфатно-солевого буфера (PBS, 0.14 M NaCl; 2.7 мM KCl; 10 мМ Na2HPO4; 1.8 мМ КН2Р04, рН 7.3) и суспендировали в 100 мкл аннек-синового буфера (10 мМ HEPES; 140 мМ NaCl; 2.5 мМ CaCl2, pH 7.4). Затем к клеткам добавляли 7.5 мкл аннексина V, конъюгированного с FITC (Invitrogen), и йодид пропидия (Clontech) до конечной концентрации 100 мкг/мл, инкубировали в течение 15 мин в темноте. После этого добавляли еще 500 мкл аннек-синового буфера, суспензию клеток фильтровали через фильтр с диаметром пор 30 мкм и анализировали с помощью проточного цитометра Partec PASIII.
Иммуноблотинг
Клетки лизировали в буфере RLB (Promega Inc.). Одинаковые количества белковых экстрактов (50-100 мкг) фракционировали электрофорезом в 12% ДСН-ПААГ, затем осуществляли электроперенос белков на нитроцеллюлозную мембрану и обработку мембраны как описано ранее [7]. Мембрану инкубировали с моноклональными мышиными антителами к ДГОДГ ^Ь54б21, Abcam), к р53 (DO-1) или актину (С-2) (Santa Cruz Biotechnology Inc.), разведенными в соотношении 1 : 500 буфером TBST (20 мМ Трис-HCl, pH 7.5; 140 мМ NaCl; 0.05% Tвин-20) в течение 2 ч. С целью контроля нагрузки мембраны инкубировали с антителами к актину. Детекцию проводили с помощью вторичных антимышиных антител овцы, конъюгированных с пероксидазой хрена (GE Healthcare), и усиленной хемилюминесценции по стандартной методике (Western Lightning Chemi-luminescence Reagent, Perkin Elmer Life Sciences).
Получение клеточных линий с пониженным уровнем ДГОДГ
Лентивирусные векторы на основе плазмиды pLKO.1-puro (Sigma-Aldrich Inc.) содержали гены коротких шпилечных РНК к ДГОДГ со следующими последовательностями: si21 - CCGGTC-CGGGATTTATCAACTCAAACTCGAGTTTGA GTT-GATAAATCCCGGATTTTT, si32 - CCGGCGGACTT-
TATAAGATGGGCTTCTCGA GAAGCCCATCT-TATAAAGTCCG TTTTT.
Для каждого из лентивирусных векторов, pLKO-si21 и pLKO-si32, были получены вирусные стоки. Для этого клетки эмбриональной почки человека HEK293T на 10-см чашках Петри трансфицировали соответствующим лентивирусным вектором и набором упаковочных плазмид [8] с помощью реагента LipofectAMIN 2000 (Invitrogen) по методике производителя. Использовали смесь четырех плазмид: З мкг лентивирусного вектора, 12 мкг плазмиды pRev2, экспрессирующей белок Rev, б мкг плазмиды pGag1, экспрессирующей белки Pol и Gag, и З мкг плазмиды pVSV-G, экспрессирующей гликопротеин G вируса везикулярного стоматита (всего 24 мкг ДНК). Разведенную средой DMEM cмесь плазмид смешивали с разведенным реагентом LipofectAMIN 2000 (б0 мкл), интенсивно перемешивали, инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре и раскапывали на чашку с клетками. На следующий день среду заменяли на 10 мл DMEM, содержащей 2% телячьей эмбриональной сыворотки.
Спустя 2 дня после трансфекции собирали секре-тируемые вирусные частицы: 10 мл среды от трансфицированных клеток фильтровали через фильтр с низкой сорбцией белков (Durapore membrane, Millex-HV, Millipore) с порами 0.45 мкм, и аликвоты объемом 1 мл хранили при -70°C.
Клетки RKO инфицировали вирусными частицами, несущими два разных варианта гена короткой шпилечной РНК к ДГОДГ (si82 и si21), а также контрольными вирусами, не содержащими короткой шпилечной РНК (pLS-Lpw). Для этого к клеткам, росшим на З5-мм чашках, добавляли 1 мл вирусных частиц, разбавленных 1 мл свежей среды, и 5-8 мкг поли-брена (Hexadimethrine bromide, Sigma-Aldrich Inc.). Клетки растили в присутствии уридина (50 мкг/мл). Спустя З дня добавляли пуромицин (1 мкг/мл) и вели селекцию в течение еще З дней. Затем клетки лизи-ровали, и определяли уровень ДГОДГ с помощью им-муноблотинга.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Роль нарушения биосинтеза пиримидинов в индукции апоптоза при ингибировании комплекса III дыхательной цепи митохондрий
Нами показано, что действие ингибиторов комплекса III ДЦМ приводит к остановке роста ряда линий клеток эпителиальных опухолей и их массовой гибели. Цитометрический анализ окрашенных FITC-аннексином V и йодидом пропидия (PrI) клеток RKO рака толстого кишечника человека, обработанных миксотиазолом, ингибитором ком-
плекса III ДЦМ, выявил значительную популяцию апоптотических клеток (рис. 1). В целом наблюдали три популяции клеток: нормальные клетки (аннек-син V-отрицательные, PrI-отрицательные); апоп-тотические клетки (аннексин V-положительные, PrI-отрицательные, примерно 20% от всех клеток) и третья, небольшая популяция мертвых клеток (аннексин V-положительные, PrI-положительные, доля которых составляла примерно З%). Размер последней популяции был больше, когда клетки собирали не только с подложки, но и из среды (данные не приведены), и эти клетки рассматривали как некротические или позднеапоптотические.
Поскольку с дыхательной цепью митохондрий функционально связан путь биосинтеза пиримидинов de novo через встроенную в митохондриальную мембрану дигидрооротатдегидрогеназу [б], мы решили проверить как влияет восполнение пула пиримиди-нов на апоптоз, вызываемый миксотиазолом. С этой целью после обработки клеток RKO миксотиазолом в присутствии уридина проводили цитометрический анализ. Оказалось, что уридин, предшественник как уридиловых, так и цитидиловых нуклеотидов, практически полностью предотвращает накопление апоптотических аннексин V-положительных, PrI-отрицательных клеток, вызванное обработкой миксо-тиазолом (рис. 1). Это указывает на то, что причиной индукции апоптоза служит нарушение биосинтеза пиримидинов de novo, предположительно за счет ингибирования ДГОДГ.
Чтобы прямо оценить роль ДГОДГ, клетки RKO обрабатывали миксотиазолом в присутствии субстрата или продукта катализируемой ДГОДГ реакции, и анализировали уровень апоптоза методом проточной цитометрии. Оказалось, что дигидрооротат (субстрат ДГОДГ) не влияет на индуцированный миксо-тиазолом апоптоз (рис. 1), а оротат (продукт реакции, катализируемой ДГОДГ) его в значительной степени предотвращает (количество апоптотических клеток в 4 раза ниже, чем при индукции апоптоза под действием миксотиазола, рис. 1).
Аналогичные результаты получены и для другой линии клеток рака толстого кишечника человека, HC^^ (не показано).
Полученные данные свидетельствуют о том, что индукция апоптоза при ингибировании комплекса III ДЦМ в существенной степени обусловлена ингибированием ДГОДГ и нарушением биосинтеза пи-римидинов de novo. Для более полной уверенности в этом молекулярном механизме было решено провести обратный эксперимент и проверить, действительно ли нарушение работы ДГОДГ вызывает апоп-тотическую гибель клеток подобно ингибированию комплекса III ДЦМ.
А
Gate: R1 Q1: 0.27% Q2: 2.05%
Q3: 9З.50% Q4: 4.18%
Gate: R1 Q1: 0.11% Q2: 2.73%
Q3: 78.05% Q4: 19.11% У
0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 FL1 FL1
Контроль Миксотиазол
Gate: R1 Q1: 0.02% Q2: 2.84%
Q3: 74.56% Q4: 22.59% */
1000
Gate: R1 Q1: 0.16% Q2: 1.06%
Q3: 93.05% Q4: 5.72%
Ч 10
Gate: R1 Q1: 0.10% Q2: 0.87%
Q3: 95.91% Q4: 5.12%
0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0 FL1 FL1
1 10 100 1000 FL1
M + ДГО
М + О
М + У
1.40
1.20
■3 Ф 1.00
I 1- 0 0.80
CO 0 0.60
с 0 с < 0.40 0.20
0.00
Рис. 1. Уридин и оротат, но не ди-гидрооротат, защищают клетки RKO от вызываемого миксо-тиазолом апоптоза. Уровень апоптоза клеток RKO, окрашенных FITC-аннексином V и Рг1, определен методом проточной цитофлуориметрии. А - репрезентативная 2D-диаграмма распределения клеток по интенсивности флуоресценции в каналах FL2 (Рг1) и РЬ1 ^ІТС-аннексин V). Клетки анализировали спустя 26 ч после обработки 200 нМ миксо-тиазола отдельно (Миксотиазол, М) или совместно с 1 мМ диги-дрооротата (М + ДГО), 1 мМ оротата (М + О), 1 мМ уридина (М + У). Контроль - необработанные клетки. Б - статистическая обработка результатов. Процент апоптотических (ан-нексин V-положительных, Рг1-отрицательных) клеток в каждом образце после вычитания контрольных значений был нормирован на процент клеток, в которых апоптоз был индуцирован миксо-тиазолом без добавок. На диаграмме приведены средние значения относительного уровня апоптоза и SD на основании трех независимых опытов
М М + О М + У М + ДГО
Б
Влияние нокдауна дигидрооротатдегидрогеназы на опухолевый супрессор р53 и программируемую клеточную смерть
Действительно ли нарушение работы ДГОДГ вызывает апоптотическую гибель клеток подобно ингибированию комплекса III ДЦМ? Чтобы выяснить это, решено было получить линию клеток ИКО, в которой экспрессия ДГОДГ подавлена с помощью РНК-интерференции. Для эффективной доставки кассеты, экспрессирующей короткие интерферирующие РНК, использовали лентивирусную систему. Клетки ИКО инфицировали лентивирусными частицами, несущими два разных варианта гена короткой шпилечной РНК к ДГОДГ ^32 и si21), а также контрольными вирусами, не содержащими эти гены (pLS-Lpw), и растили в присутствии уридина. Клетки с интегрированными в хромосому экспрессионными кассета-
ми отбирали с помощью пуромицина, лизировали и определяли уровень ДГОДГ с помощью иммуно-блотинга (рис. 2).
Таким образом, было выяснено, что в клетках, экспрессирующих две разных коротких шпилечных РНК к ДГОДГ, уровень ДГОДГ значительно ниже, чем в клетках, инфицированных вирусными частицами на основе «пустого» вектора (рис. 2).
Ранее мы показали, что при ингибировании комплекса III ДЦМ происходит активация опухолевого супрессора р53 за счет нарушения работы ДГОДГ [5]. Чтобы проверить, вызывает ли нокдаун ДГОДГ аккумуляцию р53, методом иммуноблотинга сравнили уровень р53 в контрольных клетках и в клетках со специфичной к ДГОДГ интерференцией РНК, культивируемых в отсутствие внешнего источника ури-дина. Оказалось, что в клетках с нокдауном ДГОДГ
si32 si21 Lpw
ДГОДГ
Актин
Рис. 2. Оценка эффективности РНК-интерференции ДГОДГ. Иммуноблот лизатов клеток RKO, инфицированных pLKO-si21 (зї21), или pLKO-si32 (si32), или пустым вектором pLS-Lpw (Lpw). Верхняя панель -с антителами к ДГОДГ, нижняя панель - с антителами к Р-актину, используемыми в качестве контроля нанесения. Звездочкой (*) отмечена неспецифическая полоса, которая также может служить контролем нанесения образцов
Lpw si32 si21
М
р53 . Актин
р53
Актин
Рис. 3. Интерференция ДГОДГ в клетках RKO приводит к индукции р53 аналогично действию миксотиазола, ингибитора комплекса III ДЦМ. Иммуноблот лизатов клеток RKO, инфицированных pLKO-si21 (зї21), pLKO-si32 ^І32) или пустым вектором pLS-Lpw (Lpw). Клетки культивировали в отсутствие уридина в течение 24 ч. Справа для сравнения приведен иммуноблот лизатов клеток RKO, не обработанных (К) или обработанных 200 нМ миксотиазолом (М) в течение 12 ч. Верхняя панель - с антителами к р53, нижняя панель - с антителами к Р-актину
Lpw si32 si32 Уридин - - +
Актин
Рис. 4. Уридин предотвращает индукцию р53 в клетках со специфичной к ДГОДГ интерференцией РНК. Иммуноблот лизатов клеток RKO, инфицированных pLKO-si32 ^І32) или пустым вектором pLS-Lpw (Lpw). Клетки культивировали в отсутствие (-) или в присутствии (+) уридина в течение 24 ч. Верхняя панель -с антителами к р53, нижняя - с антителами к Р-актину
уровень р53 возрастает так же, как при ингибировании комплекса III ДЦМ (рис. 3).
Добавление уридина предотвращало накопление р53 в клетках со специфичной к ДГОДГ интерференцией РНК (рис. 4). Следовательно, наиболее вероятной причиной повышения уровня р53 в этих клетках можно считать нарушение биосинтеза пиримидинов de novo.
Далее проводили цитометрический анализ окрашенных FITC-аннексином V и йодидом пропидия клеток со специфичной к ДГОДГ интерференцией РНК, культивируемых в отсутствие внешнего источника уридина. Оказалось, что функциональным следствием подавления экспрессии ДГОДГ и стабилизации р53 является возрастание доли апоптотических аннексин V-положительных, PrI-отрицательных клеток (рис. 5). Добавление в ростовую среду уриди-на снижало процент апоптотических клеток до контрольного уровня, что свидетельствует о специфичности наблюдаемого эффекта.
Таким образом, с помощью подавления экспрессии ДГОДГ методом РНК-интерференции показано, что как нарушение работы ДГОДГ, так и ингибирование комплекса III ДЦМ приводят к повышению внутриклеточного уровня опухолевого супрессора р53 и возрастанию уровня программируемой клеточной смерти - апоптоза. Эти результаты подтверждают нашу модель, в соответствии с которой индукция апоптоза при ингибировании комплекса III ДЦМ, так же как и стабилизация и активация р53, происходят за счет ингибирования ДГОДГ и нарушения биосинтеза пиримидинов de novo.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Митохондрии - это «энергетические станции» клетки, являющиеся одновременно медиаторами ряда регуляторных путей, включая индукцию апоптоза [1]. Ранее мы показали, что ингибирование комплекса III ДЦМ приводит к активации опухолевого супрессора р53 и включению программы клеточной смерти [5]. Оказалось, что к активации р53 приводит не само ингибирование цепи переноса электронов, а нарушение функционирования именно комплекса цитохрома Ьс1. Было показано, что это происходит вследствие ингибирования дигидрооротатдегидрогеназы, единственного митохондриального фермента пути биосинтеза пиримидинов de novo. Однако оставалось не известным, служит ли ингибирование ДГОДГ единственной причиной включения программируемой клеточной смерти при ингибировании комплекса III ДЦМ.
ДГОДГ - это флавопротеин, встроенный во внутреннюю мембрану митохондрий. ДГОДГ окисляет дигидрооротат до оротата и использует убихинон в качестве акцептора электронов [6]. В настоящей ра-
К
Lpw
si32
si32 + уридин
Gate: R1 OI:0L»4 02.035*
ost taicrs, O* *450% r
Gate: R1 Ot CL1IT4 07-
Q±T2A9\ fttTnicn. /
Gate: R1 OLOCOb до.алу»
03: 01,3 ?\ Oi: 14UT4 J .. \
1 10 100 1000 0.-FL1
1 10 100 1000 FL1
1 10 100 1000 FL1
Апоптоз, % 13.5 +/-4.2
24.0+/-3.1
13.3+/-1.8
Рис. 5. Уридин защищает клетки RKO с нокдауном ДГОДГ от апоптоза. Уровень апоптоза клеток RKO контрольных (Lpw) или со специфичной к ДГОДГ интерференцией РНК, культивируемых в отсутствие внешнего источника уридина ^32) или в присутствии уридина ^32 + уридин), оцененный методом проточной цитофлуориметрии. Результаты представлены в виде репрезентативной 2D-диаграммы распределения клеток по интенсивности флуоресценции в каналах FL2 (Рг1) и FL1 ^1ТС-аннексин V). Внизу приведен процент апоптотических (аннексии V-положительных, Рг1-отрицательных) клеток (среднее значение +/- SD на основании трех независимых опытов)
боте показано, что апоптотическую гибель клеток, индуцируемую миксотиазолом, ингибитором комплекса III ДЦМ, полностью предотвращает уридин - предшественник биосинтеза уридиловых и цитидиловых нуклеотидов, и в значительной степени - оротат, продукт реакции, катализируемой дигидрооротат-дегидрогеназой. В то же время дигидрооротат, субстрат ДГОДГ, таким свойством не обладает. Из этих данных следует, что апоптотическая гибель клеток при ингибировании комплекса III ДЦМ действительно обусловлена ингибированием ДГОДГ, митохондриального фермента пути биосинтеза пиримиди-нов de novo. Этот вывод подтвержден результатами опытов по подавлению экспрессии ДГОДГ с помощью РНК-интерференции. Оказалось, что нокдаун ДГОДГ приводит к аккумуляции опухолевого супрессора р53 и увеличению уровня программируемой клеточной смерти - апоптоза.
На рис. 6 приведена предполагаемая схема событий, приводящих к апоптозу, при ингибировании комплекса III ДЦМ. В нормальных условиях уби-хинон принимает электроны от комплекса I, комплекса II и дигидрооротатдегидрогеназы. При этом убихинон восстанавливается до убихинола, который затем отдает электроны через комплекс III на цитохром с (рис. 6А). Ингибирование комплекса III ДЦМ под действием миксотиазола приводит к блокированию окисления убихинола, убихинон переходит в полностью восстановленное состояние, после чего теряет способность акцептировать электроны
в процессе окисления дигидрооротата. Это приводит к нарушению работы ДГОДГ и, как следствие, нарушению биосинтеза пиримидинов de novo, стабилизации и активации опухолевого супрессора р53 и индукции программируемой клеточной смерти (рис. 6Б). Значимость регенерации убихинона в дыхательной цепи для биосинтеза пиримидинов de novo подтверждается тем, что, как установлено недавно, малярийный паразит Plasmodium falciparum, по-видимому, поддерживает активную митохондриальную электрон-транспортную цепь исключительно для этой цели [9].
Полученные нами результаты хорошо согласуются с данными о том, что ингибитор ДГОДГ лефлю-номид/терифлюномид вызывает апоптоз в ряде раковых клеточных линий человека [10-12]. Однако, согласно работе [12], трансформированные кератино-циты с мутантным геном р53, в которых отсутствует транскрипционно активный р53, более чувствительны к апоптозу, вызванному терифлюномидом, чем нормальные кератиноциты с р53 дикого типа. Длительная обработка нормальных кератиноцитов NHEK терифлюномидом вызывала задержку клеточного цикла в фазе G0/G:, что коррелирует с индукцией экспрессии ингибитора циклинзависимых киназ р21, гена-мишени р53 и свидетельствует о цитопротек-торной роли р53 при индуцированном терифлюноми-дом апоптозе [12]. Обработка фибробластов человека PALA, другим ингибитором биосинтеза пиримидинов (N-phosphonacetyl-L-aspartate, ингибитор транскар-
А
UMP
NADH + H+
О2 Н2О
Сукцинат
Нарушение биосинтеза „ пиримидинов UMP
Активация
р53
Апоптоз
UMPS CAD
dho
Внешняя митохондриальная мембрана
NADH + H+
Сукцинат
Рис. 6. Схема индукции р53-зависимого апоптоза в ответ на ингибирование комплекса III ДЦМ через блокирование работы ДГОДГ. I, II, III, IV - комплексы ДЦМ; Q - убихинон; QH2 - убихинол; cyt с - цитохром с; ДГОДГ - дигидрооротатдегидрогеназа; dho - диги-дрооротат; oa - оротат; CAD - многофункциональный фермент, катализирующий начальные ступени биосинтеза пиримидинов (карбамоилфосфатсинтаза, аспартат-транскарбамилаза, дигидрооротаза); UMP -уридинмонофосфат; UMPS - уридилмонофосфат-синтаза. Электроны показаны как e. А - контрольные клетки, Б - клетки после обработки миксотиазолом. Объяснения в тексте статьи
бамилазы) приводила к обратимой задержке клеточного цикла и выживанию клеток, экспрессирующих транскрипционно активный р53, и к апоптотической гибели клеток в отсутствие р53 [13-15]. Предполагается, что в условиях подавленного биосинтеза пиримидинов цитопротекторные свойства р53, способствующие выживанию нормальных клеток с р53 дикого типа и гибели раковых клеток с инактивированным р53, могут стать основой для противоопухолевой терапии c использованием соответствующих ингибиторов [12].
В противоположность приведенным данным [1215] в настоящей работе показано, что подавление функционирования ДГОДГ и нарушение биосинтеза пиримидинов de novo приводит к индукции апоптоза в клетках рака толстого кишечника человека, экспрессирующих транскрипционно активный р53. Более того, ранее мы показали, что в клетках НСТ116 р53-/-, в которых отсутствует р53, наблюдается значительное подавление апоптоза по сравнению с клетками НСТ116 дикого типа [5]. Следовательно, в использованных нами опухолевых клетках р53 выполняет не цитопротекторную функцию, а, наоборот, способствует индукции апоптоза при нарушении биосинтеза пиримидинов de novo. Расхождение наших результатов с результатами работ [12-15] может быть следствием тканеспецифических вариаций и требует дальнейшего изучения.
Наши данные, как одно из следствий, указывают на возможность использования ингибиторов биосинтеза пиримидинов при экспрессирующих р53 дикого типа злокачественных опухолях толстого кишечника человека.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Исследован механизм включения программируемой клеточной смерти при нарушении функционирования дыхательной цепи митохондрий. Показано, что причиной индукции апоптоза в клетках рака толстого кишечника человека при ингибировании комплекса III дыхательной цепи митохондрий является нарушение работы митохондриального фермента дигидрооротатдегидрогеназы, ведущее к блокированию пути биосинтеза пиримидинов de novo, активации опухолевого супрессора р53 и, как следствие, индукции р53-зависимого апоптоза.
Наши результаты не согласуются с опубликованными ранее данными, согласно которым в кератино-цитах и фибробластах человека опухолевый супрессор р53 играет цитопротекторную роль и защищает клетки от апоптоза, индуцированного ингибиторами биосинтеза пиримидинов. Мы показали, что подавление функционирования ДГОДГ и нарушение биосинтеза пиримидинов de novo приводит к индукции
Б
апоптоза в клетках рака толстого кишечника человека, экспрессирующих транскрипционно активный р53. В использованных нами клеточных линиях, напротив, р53 способствует индукции апоптоза при нарушении биосинтеза пиримидинов de novo. Расхождение наших и ранее опубликованных результатов может быть следствием тканеспецифических вариаций и требует дальнейшего изучения. Полученные нами данные указывают на возможность использо-
вания ингибиторов биосинтеза пиримидинов при экспрессирующих р53 дикого типа опухолях толстого кишечника человека. •
Работа поддержана РФФИ (гранты № 12-0401444, 12-04-00538 и 12-04-32131-мол_а), а также ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (государственный контракт П334, 2010-2012 г.).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. McBride H.M., Neuspiel M., Wasiak S. // Curr. Biol. 2006. V. 16. № 5. Р 551-560.
2. Meunier B., Fisher N., Ransac S., Mazat J.P, Brasseur G. // Biochim. Biophys. Acta. 2013. V. 1827. № 11-12. P. 1346-1361.
3. Trifunovic A., Larsson N.-G. // J. Intern. Med. 2008. V. 263.
№ 2. Р 167-178.
4. Чумаков П.М. // Успехи биол. химии. 2007. Т. 47. № 1.
С. 3-52.
5. Khutornenko A.A., Roudko V.V., Chernyak B.V., Vartapetian A.B., Chumakov P.M., Evstafieva A.G. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010. V. 107. № 29. Р 12828-12833.
6. Evans D.R., Guy H.I. // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. № 32.
Р 33035-33038.
7. Sukhacheva E.A., Evstafieva A.G., Fateeva T.V., Shakulov V.R., Efimova N.A., Karapetian R.N., Rubtsov Y.P, Vartapetian A.B. // J. Immunol. Meth. 2002. V. 266. № 1-2. Р 185-196.
8. Гурьянова О.А., Маханов М., Ченчик А.А., Чумаков П.М., Фролова Е.И. // Молекуляр. биология. 2006. Т. 40. № 4.
С. 448-45 9.
9. Painter H.J., Morrisey J.M., Mather M.W., Vaidya A.B. // Nature. 2007. V. 446. № 1. P 88-91.
10. Baumann P., Mandl-Weber S., Volkl A., Adam C., Bumeder I., Oduncu F., Schmidmaier R. // Mol. Cancer Ther. 2009. V. 8. № 3. P. 366-375.
11. Hail N.Jr., Chen P, Bushman L.R. // Neoplasia. 2010. V. 12.
№ 4. P 464-475.
12. Hail N.Jr., Chen P., Kepa J.J., Bushman L.R. // Apoptosis. 2012. V. 17. № 2. P. 258-268.
13. Agarwal M.L., Agarwal A., Taylor W.R., Chernova O., Sharma Y., Stark G.R. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. № 25. P 14775-14780.
14. Agarwal M.K., Hastak K., Jackson M.W., Breit S.N., Stark G.R., Agarwal M.L. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V. 103. № 44. P. 16278-16283.
15. Hastak K., Paul R.K., Agarwal M.K., Thakur V.S., Amin A.R., Agrawal S., Sramkoski R.M., Jacobberger J.W., Jackson M.W., Stark G.R., Agarwal M.L. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008. V. 105. № 17. P 6314-6319.
