CC BY
30
Орипнальш досл1дження Original Researches ■ < ■ | ГАСТРОЕНТЕРОЛОПЯ GASTROENTEROLOGY
Патолопя печшки i жовчовив^ноТ системи / Pathology of Liver and Biliary Excretion System
УДК 616.36-003.826+616.36-036.8
СТЕПАНОВ Ю.М., ГАЙДАР Ю.А., Д1ДЕНКО В.1., ГАЛЕНКО О.П., ОШМЯНСЬКА Н.Ю.
ДУ «1нститутгастроентерологн НАМН Украни», м. Днпропетровськ, Украна
МкРОСТРУКТУРЫ ЗМШИ ГЕПАТОЦИПВ ПРИ ФiБРОЗУВАННi ПЕЧШКИ У ХВОРИХ НА ХРОЫЧЫ ДИФУЗНi ЗАХВОРЮВАННЯ ПЕЧiНКИ
Резюме. Проведено морфолопчний анал'з мкроструктурних змiн гепатоцилв у хворих на хрончний в':русний гепатит С, розподлу маркерiв апоптозу та б'тк!в цитоскелета на материал! 41 пунк^йно! б'ю-псПпечiнки. За допомогою 'шунопстох'ш! та комп'ютерно!морфометрП проанал'зовано мкроструктурн! змiни, що супроводжують прогресування ф 'брозу, вивчено особливост механизму апоптозу гепатоцилв, локалiзацií цитохрому С, змiни системи мiкрофiламентiв / скорочувальних властивостей актину з пара-лельною актива^ею процеав регенерацИ.
Ключовi слова: хрончний гепатит С, цитохром С, стелатнi клтини печiнки.
Вступ
При пошкоджент печшково! паренхiми на тл1 хро-тчних дифузних захворювань печшки (ХДЗП) спосте-р1гаеться поступове розростання або ущтьнення спо-лучно! тканини, що представлена екстрацелюлярним матриксом печiнки (ЕМП). ЕМП — це бюлопчно активна пластична спец1ал1зована субстанцiя, що здатна швидко змiнювати свiй склад у вщповщь на дiю рiзних фiзiологiчних чинниюв [3].
Ряд дослiджень доводить роль екстрацелюлярного матриксу в розвитку фiброзу багатьох органiв [2]. Про-вiдну роль як у синтез1, так i в деградаци компонент1в ЕМП вiдiграють стелатнi клiтинi (СК) печшки. У нор-мальнiй печшщ СК знаходяться в станi покою, постш-но експресуючи певну кшьысть ЕМП, а також кiлька тишв металопротешаз, якi беруть участь у його деградаци (протеолiзi), що забезпечуе нормальний кшьыс-ний i якiсний склад компонентiв у перисинусо!дально-му просторi [5, 8].
Активащя СК супроводжуеться суттевим порушен-ням !х структури i функцiй, включаючи втрату нако-пичення ретинощв, трансформацш в мiофiбробласти, пролiферацiю, мiграцiю в зони запалення i некрозу ге-
патоцитiв, а також збiльшення продукци цими клггана-ми компонентiв ЕМП [1, 11, 12, 14].
Маркером активаци i трансформаций СК у мюфь бробласти е експрес1я гладком'язового а-актину (що е необхщним для морфогенезу i руху клiтин), поява або збтьшення на !х поверхш числа рецепторiв до фактора росту, шших цитокiнiв та ендотелш, а також молекул клггинно! адгези [7, 9, 13]. Важливу роль у регуля-ци функцш СК печшки в1д1грають циток1ни, бтьшють з яких стимулюе продукцш компонент1в ЕМП. У свою чергу, активоваш СК продукують ряд хемок1н1в, що шд-силюють м1грац1ю мононуклеар1в 1 нейтрофшв у зони ушкодження печшки [6, 10].
При патологи печшки спостер1гаються суттев1 зм1ни ЕМП, характер яких залежить в1д етюлоги 1 тривалосл дц шк1дливого чинника [5, 10]. При гострих ураженнях печшки розвиваеться типовий процес репаративно! ре-генераци, властивий загоенню ушкодження еттеталь-
© Степанов Ю.М., Гайдар Ю.А., Дiденко В.1., Галенко О.П.,
Ошмянська Н.Ю., 2016 © «Гастроентеролопя», 2016 © Заславський О.Ю., 2016
но!' тканини, з розвитком спочатку запально!' шфтьтраци та подальшою активацieю СК i трансформащею ix у мю-фiбробласти, формуванням у зонах некрозу i запалення фiбрилярного матриксу.
Надалi включаються мехашзми, спрямованi на дегра-дацiю фiбрилярного матриксу та вщновлення нормального складу ЕМП, а також регенерацш ештелш.
Пiсля припинення дц етюлопчного чинника у зонах пошкодження зменшуеться кшьтсть мiофiбробластiв у результатi ix апоптозу або зворотно! трансформацй' у сте-латнi кпiтини [6].
З огляду на це метою нашо! роботи було дослщити мiкрострукгурнi змши гепатоцитiв при фiброзуваннi пе-чiнки, зокрема розподл маркерiв апоптозу та бттв цито-скелета.
Матерiали i методи
Обстежений 41 хворий, ят проходили лiкування у вщ-дтенш захворювань печiнки та пщшлунково!' залози ДУ «1нститут гастроентерологй' НАМН Укра!ни» з приводу xронiчного вiрусного гепатиту, асоцшованого з вiрусом С (ХВГС).
Шункцшт бiоптати печiнки фiксували в 10% форма-лiнi, проводили через ряд спиртав, помiщали в парафш Гiстологiчнi зрiзи товщиною 3—5 мкм забарвлювали гема-токсилiном та еозином, а також за методом Маллорi в мо-дифшаци Слiнченка. Для морфометричного аналiзу було наведено 2 чи 3 стовпчики тканини, що мiсгять вщ 4 до 6 портальних трактiв. Iмуногiстоxiмiчне (1ГХ) виявлення PCNA (1 : 200) (ядерний антиген пролiферуючиx клпин), Вт-567 (1 : 200) (мюзин, бток цитоскелета), цитохрому С (1 : 100) (фермент класу оксидоредуктаз), актину (1 : 100) (бток цитоскелета) проводили на депарафшованих псто-логiчниx зрiзаx печiнки.
Iмуногiстоxiмiчнi дослщження з використанням мо-ноклональних антитт виконувалися в парафшових зрiзаx тканини печiнки. Шюля депарафшаци зрiзiв пригтчува-ли активнють пероксидази 3% розчином перекису водню на 30 хв. Пiсля блокування пероксидази препарати про-мивали i перемiщали в забуферений фiзiологiчний розчин (рН 7,2—7,4) на 5—10 хв. Потам на зрiзи наносили розчин специфiчниx антитт (Chemicon, Santa Cruz, Abcam, USA) з 1% бичачого сироваткового альбумiну i залишали на тч, при +4 °C у вологш камерi.
На другий день зрiзи промивали i наносили вторин-нi антитiла, мiченi бiотином (1 : 50). Шсля завершення шкубаци вторинними антитiлами залишки реагентiв, яы не прореагували, змивали буфером. Шсля проми-вання на зрiзи наносили розчин кон'югату стрептавь дину (1 : 150).
Шсля шкубаци зрiзи промивали у буферi i виявля-ли розчином 3,3'-дiамiнобензидину тетрапдрохлориду (0,01%) (DAB) з перекисом водню (0,06%). Шд час реак-цй' пероксидази з DAB у мюцях локатзаци виявленого антигену утворювався продукт iмуногiсгоxiмiчноi реакцй' темно-коричневого кольору. Препарати дозабарвлювали гематоксилiном та монтували на предметш скельця.
Комп'ютерна морфометрiя використовувалась як до-датковий метод об'eктивiзацii морфолопчного дослщжен-
ня. Зрiзи, 3a6apBneHÍ за методом Маллорi в модифшаци Слшченка, фотографувалися при збiльшеннi 40 i 100 свгт-лового мшроскопа XSP-139TP (Ulab, Украша) фотоапа-ратом Canon PowerShot A630 (Япония). Д]лянка паренх^ми та фiбpoзу була видлена i вимipянa за допомогою про-грамного забезпечення ImageJ 1.45S (National Institutes of Health, США). Шсля вимipу проводився розрахунок комп'ютерного iндекcу фiбpoзу (К1Ф) — в^дношення фi-бpoзнoi тканини до зaгaльнoi плoщi бюптату. При oцiн-цi pезупьтaтiв 1ГХ клiтини, що прореагували позитивно, пщраховувалися, а результат виражався в ктькосл клiтин/мм2 видимoi плoщi або на велике поле зору.
Для статистичного aнaлiзу отриманого числового ма-теpiaлу використовували дескриптивну статистику та ко-pеляцiйний aнaлiз за Шрсоном (для даних, що виpaженi в штервальнш шкaлi) та Спipменoм (для даних, що вира-женi в нештервальних шкалах). Вipoгiднicть вiдмiннocтей мiж групами aнaлiзувaлacя за допомогою тесту Mann — Whitney U та критерш хьквадрат. Вipoгiдним вважалося значення р < 0,05.
Результати досл^ження
У першу групу увiйшли хвopi з iнiцiaльнoю cтaдieю фi-брозу (58,33 % уах випад^в). Групу пopiвняння (група II) становили хвopi з прогресуванням викликаних фiбpoзoм структурних змiн печiнки (41,67 %).
1з числа хворих I групи перша cтaдiя фiбpoзу за шкалою METAVIR cпocтеpiгaлacь у 35,71 %, повна вщсут-нicть будь-яких фiбpoзних змiн — у 7,14 % (одиничний випадок). Сполучна тканина являла собою перипорталь-нi вузли невеликого poзмipу навколо незначно розши-рених портальних тракпв, на тлi пoмipнoi ЛШ1 перипор-тально! зони (рис. 1А); К1Ф становив (0,0370 ± 0,0119) (в1д 0 до 8,4 %). У 57,14 % пащентав cпocтеpiгaлacь друга cтaдiя фiбpoзу за шкалою METAVIR, що характеризува-лась початком формування неповних портопортальних септ. У цьому paзi перипортальна дтянка являла собою скупчення щiльнoi сполучно'1' тканини, iнфiльтpoвaнoi лiмфoцитaми та плазматичними клiтинaми (рис. 1Б); К1Ф становив (0,0620 ± 0,0013) (в1д 3,2 до 11,8 %).
Серед хворих групи II, з прогресуванням викликаних фiбpoзoм структурних змш печiнки, у 60,0 % випад-тв було дiaгнocтoвaнo третю стадаю фiбpoзу за шкалою METAVIR з характерним поширенням перигепатоцелю-лярного фiбpoзу, скупченням сполучно'1' тканини навколо портальних тракпв i центpaльнoi вени, повними та непо-вними портопортальними i портоцентральними септами (рис. 2А). При цьому портальш тракти були пoмipнo роз-шиpенi, iнфiльтpoвaнi лiмфoцитaми i плазматичними кль тинами, в окремих випадках cпocтеpiгaлиcя некроз i фi-броз гепатоципв пoгpaничнoi пластинки. КIФ становив (0,1930 ± 0,0318) (7,6-19,3 %).
I, нapештi, у 40,0 % випадтв було встановлено цироз печiнки або четверту cтaдiю фiбpoзу за шкалою METAVIR (рис. 2Б). При цьому часточкова будова печшки була помино порушена, вщзначалися повш портопортальш i пopтoцентpaльнi септи з утворенням мiкpo- i макроноду-лярних структур (вузлiв). КIФ становив (0,2640 ± 0,0204) (20,4-29,2 %).
Рисунок 1 — 1н1ц1альн1 стадп ф'брозування при гепатит, асоцйованому з в'русом С. А — стадя F1 за METAVIR. Поширена зерниста дистроф'я, м1н1мальний перипортальний ф'броз без септ. Забарвлення за Маллор'1 в модифкаци Слнченка. Зб. х 100. Б — стад'т F2 за METAVIR. Перипортальний ф'броз з одиничними неповними септами. Забарвлення за Маллор '1 в модифкацп Слнченка. Зб. х 100
При порiвняннi структурних змш печшки на шщь альних стадиях фiброзу (група I) i при його подальшому прогресуванш (група II) не було встановлено вiрогiдних вщмшностей в активносл гепатиту (р = 0,266), а також характер i поширенють дистрофй гепатоцитав (р = 0,412). Як видно з табл. 1, хоча i спостериаеться деяке зрос-тання пстолопчно! активностi гепатиту i поширеностi дистрофiчних змiн печiнки, ттьки розрахунок К1Ф е об'ективним методом оцiнки поширеносп фiброзних змiн. Так, у I груш К1Ф становив (0,051 ± 0,008), а у дру-гiй — (0,223 ± 0,029), з пщтвердженою статистично вiро-гiдною рiзницею м1ж групами (р = 0,001).
Таким чином, основною мшроскошчною ознакою активаци фiброзу в циротично змшенш печiнцi було збiльшення кiлькостi дрiбних i тонких фiброзних септ у часточках i псевдочасточках печiнки, поява сегментарного перисинусо!дального фiброзу, а також по-ширення перипортального фiброзу. Для подальшого уточнення процесiв, що лежать в основi структурно! перебудови печшки при прогресуванш ХВГС, було
проведено iмуногiстохiмiчне дослщження. У гепато-цитах, жовчних протоках, ендотелiальних клггинах си-нусощв було проаналiзовано особливост локалiзацii цитохрому С, регенерацiйний потенщал i дифузний розподiл актину та мюзину.
У поодиноких гепатоцитах спостериалась транслока-ця цитохрому С iз цитоплазми в ядро клiтин, що демон-струвалось iнтенсивною реакцiею в ядрах, яка свщчить про апоптичний стан клiтин (рис. 3А). В ядрах кштин поодиноких гепатоцитiв та ядрах клгтин жовчних проток спостерталась експрешя PCNA (рис. 3Б).
Цитохром С — це бток iз подвiйною функщею. Вiн виступае одноелектронним переносником, втьно пов'язаним iз внутрiшньою мембраною мгтохондрш, та необхщним компонентом дихального ланцюга, але за певних умов може вщ'еднуватися вщ мембрани, вть-но збиратися у м1жмембранному просторi мгтохондрш та активувати апоптоз [12]. Його накопичення у великих к^лькостях при розвитку ХГВС вказуе на активацш кас-пазного механiзму апоптозу.
Рисунок 2 — Прогресування ф'брозу при гепатит, асоцйованому з в'русом С. А — стад/я F3 за METAVIR. Численн1 повн1 септи без цирозу. Забарвлення за Маллор '1 в модифкаци Стнченка. Зб. х 40. Б — стадя F4 за METAVIR. Цироз. Забарвлення за Маллор '1 в модифкаци Сл1нченка. Зб. х 40
З шшого боку, збшьшення к1лькост1 PCNA-позитивних клггин вказуе на те, що при ХГС акти-вуеться механ1зм репаративно! регенерацИ печ1нки. К1льк1сть кл1тин у сташ регенерацИ досить широко р1зниться, тому можна припустити, що в деяких ви-падках регенерац1йний потенщал може досить дов-го забезпечувати вщновлення структури печ1нки, у той час як в шших превалюкш механ1зми загибел1 швидко ведуть до дистроф1чних зм1н.
У б1льшост1 випадшв (69,23 %) при стандартному морфолопчному досл1дженн1 в1дзначалася б1лкова дистроф1я гепатоцит1в р1зного ступеня ви-раженосп, яка охоплювала в1д дек1лькох кштин до великих зливних пол1в. При 1муног1стох1м1чному досл1дженн1 експрес1я м1озину спостер1галась в ус1х гепатоцитах (рис. 4А), у той час як актин мав вигляд гранулярних включень у цитоплазм! поодиноких гепатоципв, що перебували саме у сташ бшково! дистрофИ (рис. 4Б).
Таблиця 1 — Структуры! зм1ни печнки на ¡нщ1альних стадях та при прогресуванн ф'брозу у хворих на хрошчний гепатит, асоцйований з в'русом С
1група (n = 14) II група (n = 10) Значен-ня р
К1Ф 0,051 ± 0,008 0,223 ± 0,029 0,001*
1ндекс пстапопчно!' активносп А1 21,42 20,0 0,266
А2 71,43 40,0
А3 7,14 40,0
Вираженють дистрофiчних змш 0 14,28 20,0 0,412
1 14,28 0
2 35,71 20,0
3 35,71 60,0
>4» , I™
ii* V
Рисунок 3 — ХГВС. А — цитохром С, м1тохондр1альний фермент класу оксидоредуктаз. Непряма '¡мунопероксидазна реакц1я. Пдзабарвлення гематоксилном, зб. х 1000. Б — PCNA виявляеться в ядрах гепатоцитв. Непряма iмунопероксидазна реак^я. Пщзабарвлення гематоксил'шом, зб. х 400
Рисунок 4 — ХГВС. А — Вт-567 (мозин) виявляеться в цитоплазм'1 гепатоцит'в (1) та в еп'тел 'юцитах жовчних проток (2). Б — скорочувальний блок цитоскелета актин у вигляд'1 гранулярних включень у гепатоцитах, схильних до дистрофИ'. Непряма iмунопероксидазна реак^я. Пщзабарвлення гематоксил'шом, зб. х 1000
Система «актин — мюзин» е основою мкрофтамен-тав, що пронизують цитоплазму гепатоцитiв i служать опорним скелетом клiтини.
У змшених дистрофiею гепатоцитах актин набувае вигляду гранулярних включень i визначае прогресування зернисто! дистроф!! при розвитку ХГВС.
Висновки
1. Розвиток фiброзування печiнки у хворих на ХДЗП супроводжуеться iнфiльтрацiею навколо-портальних тракпв (р = 0,076), точковими штрачас-точковими та перипортальними некрозами (р = 0,073) i крайовим стоянням лiмфоцитiв у синусо!дах (0,011). Крiм того, хоча не виявлено прямого зв'язку мiж сту-пенем пстолопчно! активност та стадiею фiброзу (г = 0,35; р = 0,09), для вираженого фiброзу характерна супутня висока актившсть гепатиту (р = 0,042).
2. Ядерна локалiзацiя цитохрому С як маркера апоп-тозу клгтин спостерiгаеться в поодиноких гепатоцитах печшкових часточок, що вказуе на активацiю каспазного механiзму апоптозу при прогресуванш розвитку ХВГС.
3. Виявлення поодиноких PCNA-позитивних гепато-цитав у печiнкових часточках свщчить про активацш ре-паративно! регенерацй печшки при ХВГС.
4. У змшених дистрофiею гепатоцитах актин набувае вигляду гранулярних включень в цитоплазм^ що пояс-нюе втрату актином сво!х скорочувальних властивостей при ХВГС.
Список лггератури
1. Таврилюк А.О. Клинико-морфологическая характеристика последствий леченого хронического вирусного гепатита В, С и В + С/Таврилюк А.О., Туманський В.О., Пентюк Н.О.//Всник проблем бтлоги i медицини. — 2012. — Т. 2, № 3. — С. 183-186.
2. Ивашкин В.Т. Процессы апоптоза и пролиферации при патологии желудочно-кишечного тракта и печени/В.Т. Ивашкин, Т.Л. Лапина, О.Ю. Бондаренко и др. // Оригинальные исследования. — 2002. — Т. 6. — С. 33-38.
3. Assy N.I. Use of proliferating cell nuclear antigen as a marker of liver regeneration after partial hepatectomy in rats / Assy N.I., Gong Y, Zhang M. et al. // J. Lab. Clin. Med. — 1998 Mar. — Vol. 131(3). — P. 251-6.
4. Delhaye M. Hepatocyte proliferative activity in human liver cirrhosis/M. Delhaye, H. Louis, C. Degraef et al. // J. Hepatol. — 1999 Mar. — Vol. 30(3). — P. 461-71.
5. Kelman Z. PCNA: structure, functions and interactions / KelmanZ//Oncogene. — 1997Feb 13. — Vol. 14(6). — P. 629-40.
6. Lake-Bakaar G.I. Digital image analysis of the distribution of proliferating cell nuclear antigen in hepatitis C virus-related chronic hepatitis, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma. / Lake-Bakaar G. I., Mazzoccoli V., Ruffini L. // Dig. Dis. Sci. — 2002 Jul. — Vol. 47(7). — P. 1644-8.
7. Sarfraz, S. Altered expression of cell cycle and apoptotic proteins in chronic hepatitis C virus infection /S. Sarfraz, S. Hamid, A. Siddiqui et al. //BMC Microbiology. — 2008. — Vol. 8. — P. 133.
8. Theocharis S.E. Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) expression in regenerating rat liver after partial hepatectomy / Theocharis S.E., Skopelitou A.S., Margeli A.P. et al. // Dig. Dis. Sci. — 1994 Feb. — Vol. 39(2). — P. 245-52.
9. Guarino M. Direct contribution of epithelium to organ fibrosis: epithelial-mesenchymal transition / M. Guarino, A. Tosoni, M. Nebulini//Hum. Pathol. — 2009. — Vol. 40(10). — P. 1365-1376.
10. Henderson N.C. Liver fibrosis: cellular mechanisms of progression and resolution / Henderson N.C., Iredale J.P. // Clin. Sci. — 2007. — Vol. 112. — P. 265-80.
11. Nieto M.A. The SNAIL superfamily of zinc-finger transcription factors / M.A. Nieto // Molecular Cell Biology. — 2002. — Vol. 3. — P. 155-166.
12. Nieto M.A. Epithelial-Mesenchymal Transitions in development and disease: old views and new perspectives / M.A. Nieto//Int. J. Dev Biol. — 2008. — Vol. 52. — P. 1-7.
13. Konigshoff M. WNT-inducible signaling protein-1 mediates pulmonary fibrosis in mice and is upregulated in human with idiopathic pulmonary fibrosis / M. Konigshoff, M. Kramer, N. Balsara et al. // J. Clin. Invest. — 2009. — Vol. 119(4). — P. 772-787.
QmpuMana 25.02.16 ■
Степанов Ю.М., Гайдар Ю.А., Диденко В.И., Галенко А.П., Ошмянская Н.Ю. ГУ «Институт гастроэнтерологии НАМН Украины», г. Днепропетровск, Украина
МИКРОСТРУКТУРНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ГЕПАТОЦИТОВ ПРИ ФИБРОЗИРОВАНИИ ПЕЧЕНИ У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМИ ДИФФУЗНЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ ПЕЧЕНИ
Резюме. Проведен морфологический анализ микроструктурных изменений гепатоцитов у больных хроническим вирусным гепатитом С, распределения маркеров апоптоза и белков цито-скелета на материале 41 пункционной биопсии печени. С помощью иммуногистохимии и компьютерной морфометрии проанализированы микроструктурные изменения, которые
сопровождают прогрессирования фиброза, изучены особенности механизма апоптоза гепатоцитов, локализации цитохрома С, изменения микрофиламентов и сократительных свойств актина с параллельной активацией процессов регенерации.
Ключевые слова: хронический гепатит С, цитохром С, стел-латные клетки печени.
Stepanov Yu.M., Haidar Yu.A., Didenko V.I., Halenko O.P., Oshmyanska N. Yu. SI «Institute of Gastroenterology of NAMS of Ukraine», Dnipropetrovsk, Ukraine
MICROSTRUCTURAL CHANGES IN HEPATOCYTES AGAINST A BACKGROUND OF LIVER FIBROSIS IN PATIENTS WITH
CHRONIC DIFFUSE LIVER DISEASES
Summary. Morphological analysis of the microstructural changes of hepatocytes has been performed in patients with chronic C viral hepatitis; the distribution of apoptosis markers and cytoskeletal proteins has been analyzed on the material of 41 liver biopsies. Using immunohistochemical analysis and computer morphometry there have been investigated microstructural changes which accompany
the progression of fibrosis, particularly the mechanisms of hepatocytes apoptosis, localization of cytochrome C, microfilaments changes and contractile properties of actin with parallel activation of regeneration processes.
Key words: chronic C viral hepatitis, cytochrome C, hepatic stellate cells.
