CC BY
6
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
УДК 615.777.25-099-014.3
МИКРОЭКСПРЕСС-МЕТОД ФЕРМЕНТНОГО ОБНАРУЖЕНИЯ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ
ИНСЕКТИЦИДОВ
Проф. А. А. Покровский, Л. Г. Пономарева
9
Лаборатория клинической энзимологии Института питания АМН СССР, Москва
Фосфорорганические инсектициды приобретают все более широкое распространение в борьбе с сельскохозяйственными вредителями (Л. И. Медведь, С. Голиков и В. Розенгарт и др.). Вместе с тем нет описания достаточно простых, но надежных средств для обнаружения минимальных концентраций фосфорсодержащих инсектицидов в воде, продуктах питания и других объектах внешней среды в полевых условиях. В связи с этим мы поставили перед собой задачу разработки микроэкспресс-метода и портативного набора для установления минимального количества фосфорсодержащих инсектицидов в воде и пище, а также разработки приемов использования холинэстеразного теста для их количественного определения и идентификации химической природы.
Обнаружение фосфорсодержащих инсектицидов с помощью холин-эстеразной реакции основано на сравнительной оценке скорости гидролиза эфиров холина (бутирилхолина или ацетилхолина) стандартными растворами сыворотки до и после контактирования с инсектицидами,
тормозящими активность фермента. При этом степень угнетения активности холинэстеразы тем больше, чем выше концентрация инсектицида в растворе. Его концентрацию определяют по соответствующим стандартным кривым, отражающим взаимоотношение между содержанием инсектицида в растворе и степенью угнетения холинэстеразы.
В предлагаемом методе судят об активности холинэстеразы по скорости освобождения определенного количества кислоты при гидролизе эфиров холина, что приводит к понижению рН и изменению цвета бром-тимолового синего в индикаторно-буферном растворе (от синего к желто-зеленому). Колориметрические сравнения проводят визуально с помощью стандартных растворов, соответствующих исходной (I стандарт) и конечной (II стандарт) окраскам исследуемых проб, или спект-рофотометрически. При визуальной колориметрии за II цветовой стандарт принимают окраску реакционной смеси после внесения в нее кислоты в количестве, соответствующем гидролизу половины взятого в систему эфира холина. Заключение о токсичности исследуемого материала делают на основании сопоставления времени уравнивания контрольной и исследуемых проб со II колориметрическим стандартом.
С помощью данного метода мы изучали антихолинэстеразное действие ряда наиболее важных фосфорсодержащих инсектицидов и построили калибровочные кривые для определения их микроколичества, находящегося в водных растворах.
В исследованиях использована техника микроэкспрессного определения холинэстеразной активности в пластмассовых компараторах и дозирования реактивов полуавтоматическими микропипетками, а также
тарированными капельницами. Количественную оценку реакции производят с помощью визуальной колориметрии и спектрофотометрии на авторегистрирующем спектрофотометре СФ-10.
Методика исследования такова. В гнезда плавающего компаратора вносят равные объемы (по 0,04 мл) 2% раствора сухой лошадиной сыворотки (служащей ферментным препаратом) и исследуемой жидкости или (при построении калибровочных кривых) водных растворов инсектицида постепенно убывающей концентрации. Содержание каждого гнезда перемешивают стеклянными палочками и оставляют на 15 мин. при комнатной температуре для взаимодействия фермента с ингибитором.
50
о
1 I
I 1
40
I
4
400 20 40 60 80 500 20 40 60 80 600 20 40 60 80 700 20 750
Длины Волн (6 ммк)
Рис. 1. Спектральная характеристика реакционных смесей при определении активности холинэстеразы сыворотки.
Кривые 1—ХП — спектры поглощения реакционной смеси непосредственно
после внесения бутирилхолина.
В контрольные пробы вместо раствора инсектицида добавляют равный объем дистиллированной воды. Затем определяют активность холинэстеразы в опытных и контрольных пробах и рассчитывают процент угнетения фермента.
Для определения активности холинэстеразы непосредственно в гнезда добавляют по 0,04 мл индикаторно-буферного раствора и 0,04 мл раствора бутирилхолина (или ацетилхолина).
При спектрофотометрическом варианте метода определяют оптическую плотность реакционной смеси в начале реакции и через определенное время от момента ее начала. Спектрофотометрические характеристики изменения цвета реакционной смеси, полученные с помощью микрокювет и оптической приставки, разработанной нами к отечественному авторегистрирующему спектрофотометру СФ-10, показаны на рис. 1.
Кривая I на этом рисунке отражает спектр поглощения реакционной смеси непосредственно после внесения бутирилхолина. При этом максимальная величина пика при 616 ммк соответствует синей окраске раствора. Последующие кривые (II—XII) отражают спектральную характеристику того же раствора через различные сроки после.внесения субстрата: кривая II через 1 мин. и последующие через каждые 2 мин. Хорошо видно постепенное снижение пика при 616 ммк, соответствующее процессам освобождения кислоты и превращения синей формы индикатора в желтую.
Было изучено антихолинэстеразное действие водных растворов 6 инсектицидов. Наиболее достоверные данные получены с хлорофосом и ацетофосом, обнаружившими удовлетворительную растворимость
123456789 10 \
мкг/мл
20 30 СО 50 60 70. #0 90 100 мхг/мя
\
12 3 4 5 6 7 8 9 10
мы г/мл
10 20 30 ¿0 50 60 70 80 90 100
миг/мл
%
в
10 20 30 40 50 СО 70 80 90 100
мкг/мл
Рис. 2. Калибровочная кривая, отражающая степень угнетения активности холинэстеразы в зависимости от концентраций.
Л — хлорофос; б — ацетофос; в — карбофос; г — метилнитрофос; д — метафос; е — метилэтилтиофос
в воде. Для получения растворов метилэтилтиофоса, метафоса, метил-нитрофоса и карбофоса их предварительно опускали в метиловый спирт; затем расчетные количества этого раствора (не более 1 % по объему) переносили в воду и быстро размешивали до образования тонкой суспензии, которая использовалась для дальнейших исследований. На основании полученных данных были построены стандартные калибровочные кривые для разных веществ (рис. 2), где на оси абсцисс отложены концентрации инсектицидов (в микрог.раммах на 1 мл), а на оси ординат— процент угнетения холинэстера-зы. Полученные результаты свидетельствуют о возможности обнаружения весьма незначительного количества фосфорорга-нических инсектицидов в пробе. Так, ацетофос достоверно мог быть обнаружен в количестве 0,5 мкг/мл, хлорофос— 1 мкг/мл.
При изучении кинетики антихолин-эстеразного действия было выявлено, что водные растворы хлорофоса постепенно наращивают величину своего антихолин-эстеразного действия. Это увеличение антихолинэстеразной активности было выраженным при растворении инсектицида в буферных растворах с рН 7,4 (рис. 3) и особенно при активирующем воздействии вытяжек из растений. Растительные вытяжки (а также окислители) могут найти применение в качестве активаторов увеличивающих антихолинэстеразную активность ряда фосфорсодержащих инсектицидов в целях повышения чувствительности метода. Приведенные кривые могут быть непосредственно использованы для определения концентрации инсектицидов в воде.
Таким образом, преимуществами холинэстераз-ного метода обнаружения фосфорсодержащих инсектицидов следует считать его высокую чувствительность и
удовлетворительную специфичность.
В связи с этим мы
20 4<0 60 80 100 7го 110160 780200
время ( 0 мин.)
Рис. 3. Изменение во времени антихолинэстеразного действия буферных растворов хлорофоса
при рН 7,4.
Рис. 4. Общий вид набора.
так и
предлагаем усовершенствованный вариант методики,
пригодной для использования как в лабораторных, условиях, а также портативный набор1 для осуществления (рис. 4). В набор включены компаратор из органического стекла с 12 гнездами: 6 пипеток-капельниц, тарированных на одну и ту же величину капли (около */4о мл2)\ 10 ампул с лошадиной сывороткой крови, высу-
полевых метода
1 В конструктивном оформлении набора принимал участие инженер А. Г. Три-полов, которому мы выражаем благодарность.
2 Использование подобных капельниц позволяет получать сравнительно высокую точность дозировки микрообъемов реактивов.
шенной лиофильным методом, расфасованной по 20 мг в ампуле; пробирка с кристаллическим бутирилхолиниодидом (0,200 г); склянка с ин-дикаторно-буферным раствором1; пробирка с 0,1 н. раствором НС1 и склянка с дистиллированной водой (15 мл). Все реактивы, включенные в набор, стойки при хранении в течение года.
Для подготовки набора к работе непосредственно в ампулах готовят 2,0% раствор сыворотки крови, бутирилхолина и кислоты, а затем
в гнездах компаратора — исследуемые и контрольные пробы. Для этого вскрывают одну из ампул с сухой сывороткой и наполняют ее водой до метки. Отдельно готовят примерно 0,3% раствор бутирилхолина и 0,005 н. раствор HCl.
Для определения остаточного количества
Состав проб при исследовании воды
Количество капель при приготовлении проб
• . Реактив опытных контрольных
I стандарт исходный II стандарт конечный опытная проба I стандарт исходный 11 стандарт конечный контрольная проба
2% сыворотка..... 2 .2 2 2 2 2
Исследуемая вода . . . 2 2 2 - - -
Чистая вода ...... 2 - — 4 2 2
И ндикаторно-буферный 2
раствор ...... , 2 2 2 2 2
HCl 0,005 н..... — 2 — — 2 -
Бутирилхолиниодид . . . 9 —— — 2 — — 2
инсектицидов в водных растворах в 6 гнезд компаратора вносят по 2 капли раствора сыворотки. Три первых гнезда оставляют для стандартных растворов и контрольных
проб; в последующие гнезда для контактирования инсектицида с ферментом прибавляют по 2 капли исследуемых образцов воды и содержимое гнезд перемешивают. Если раствор при этом примет окраску, резко отличающуюся от I стандарта (желтую или темно-синюю), то это означает, что испытуемая вода содержит большое количество кислых или щелочных примесей. Такую воду следует разбавлять 5—10 раз водой, заведомо не содержащей инсектицидов, или подтитровать кислотой или щелочью до нейтральной реакции и вновь повторить определения2.
Состав смесей в стандартах, контрольных и опытных пробах указан в таблице.
Через 15 мин. после добавления исследуемых образцов воды во все гнезда вносят по 2 капли индикаторно-буферного раствора и определяют активность фермента. Для этого в гнезда с контрольными и исследуемыми пробами прибавляют по 2 капли бутирилхолиниодида, содержимое гнезд перемешивают и устанавливают время (в минутах), необходимое для уравнивания цвета контрольных и исследуемых проб со II стандартом. Если в воде нет фосфорсодержащих инсектицидов, то активность холинэстеразы не меняется и время уравнивания контрольных и исследуемых проб со II стандартом совпадает. При содержании
1 Индикаторно-буферный раствор готовят следующим образом: 200 мг индикатора бромтимолового синего растирают в ступке с 4 мл 0,1 н. раствора ЫаОН, раствор из ступки переносят в мерную колбу на 500 мл, ступку споласкивают несколько раз небольшим количеством воды, свободной от СОг, которую также переливают в мерную колбу. Сюда же добавляют 16 мл 0,1 н. раствора N3014 и 50 мл 0,1 М раствора борной кислоты (в 0,1 М растворе хлористого калия), содержимое колбы доводят до метки дистиллированной водой (без СОг). Полученный раствор имеех насыщенный синий цвет и рН 8,65—8,7. При хранении стоек.
2 Предварительное разведение, разумеется, следует учитывать при расчете концентрации инсектицида в исследуемой жидкости.
инсектицида в воде наблюдается отставание во времени опытных проб от контрольных; процент угнетения вычисляют по следующей формуле:
У — юо— 8 контр' ' 100
В опыт.
где у — процент угнетения активности холинэстеразы; В контр. — время уравнивания со II стандартом контрольной пробы (в минутах); вопыт. — время уравнивания со II стандартом опытной пробы (в минутах).
Количественную оценку реакции проводят на основании приведенных выше калибровочных кривых. Метод обусловливает хорошую воспроизводимость результатов и точность в пределах ±5%.
Та же методика применена нами для определения остаточного количества инсектицидов в пищевых продуктах. Инсектициды с этой целью должны быть предварительно экстрагированы из продуктов и переведены в водный раствор. Для экстракции можно использовать различные органические растворители: бензол, петролейный эфир, спирт и др. Выбор растворителей, метода экстракции и перевода инсектицида в водный раствор определяют качеством продуктов и задачами исследования. Процедура экстракции, равно как и перевод инсектицида из органической в водную фазу, многократно описана в литературе (Metcal; Gunther и Blinn и др.).
Для быстрого полуколичественного определения фосфорсодержащих инсектицидов в большинстве продуктов заслуживает внимания разработанный нами метод водных смывов. Относительно большое количество плодов или листьев, подозреваемых на заражение фосфорсодержащими инсектицидами, обмывают водой в стеклянной или эмалированной посуде. Затем по описанной ранее методике проводят определение анти-холинэстеразной активности полученных смывов. При этом возможны некоторое окрашивание воды и изменения ее pH. Поэтому колориметрические стандарты необходимо готовить с прибавлением тех же смывов. Если в смывы попадают кислые или щелочные продукты, то это обнаруживают по изменению цвета I и II стандартов. В последнем случае смывы следует предварительно подтитровать с помощью 0,01 н. растворов щелочи или кислоты.
Выгодная сторона метода водных смывов состоит в его быстроте и возможности одновременного обследования больших масс продуктов, что в значительной степени повышает достоверность экспертизы.
Таким образом, предлагаемый вариант холинэстеразного метода весьма удобен как для ориентировочных тестов на присутствие инсектицидов в пищевых продуктах, так и для количественного их определения в воде и водных экстрактах. До какой степени специфична холинэсте-разная реакция? Любое вещество, обладающее выраженным антихо-линэстеразным действием, может считаться сильным ядом для теплокровных. К соединениям, которые обладают резким антихолинэстераз-ным эффектом, помимо фосфорсодержащих инсектицидов, следует отнести группу структурных аналогов ацетилхолина: прозерин, эзерин и т. п., группу фосфорсодержащих отравляющих веществ и другие производные фтор- и цианфосфорной кислоты и т. п. Из веществ, встречающихся в пищевых продуктах, отметит соланины (А. А. Покровский, J956), антихолинэстеразное действие которых было впервые установлено в нашей лаборатории; менее выражено антихолинэстеразное действие некоторых алкалоидов, содержащихся в составе белого клевера.
Наличие всех этих веществ в пищевых продуктах и в воде в значительных концентрациях должно немедленно привлекать внимание гигиенистов и санитарных врачей, так как это связано с определенной опасностью для человека и животных. В этом отношении использование холинэстеразной реакции в качестве ориентировочного теста полностью
адекватно поставленной задаче. В то же время мы хотели бы подчеркнуть целесообразность применения антихолинэстеразной реакции и для определения химической природы инсектицида. Правда, в большинстве случаев эта задача имеет менее существенное значение. Дело в том, что обстоятельства, связанные с применением инсектицида, обычно позволяют установить его конкретную природу и для количественного определения можно пользоваться определенной калибровочной кривой. В ряде случаев для целей экспертизы значительный интерес представляет установление вида инсектицида, который обнаружен в воде, воздухе или в пищевых продуктах.
Мы попытались сочетать методы хроматографического анализа с использованием холинэстеразной реакции для обнаружения локализации инсектицида на хроматограммах.
%
Рис. 5. Результаты одномерной бумажной хроматографии ацетофоса.
Хроматографирование проведено восходящим методом, в качестве подвижного растворителя использовали толуол, насыщенный этиленгликолем, и четыреххлори-
стый углерод (1 : 1).
Методика подобных исследований также сравнительно проста. На стартовую линию хроматографической бумаги, особым образом пропитанной в зависимости от природы исследуемого инсектицида, наносят исследуемый материал и затем пропускают подвижную фазу растворителя. Для ацетофоса пригоден толуол, насыщенный этиленгликолем, и четыреххлористый углерод, для хлорофоса — ацетон, вода и т. п. При правильном подборе растворителя инсектицид передвигают на определенное расстояние. Заключительная стадия анализа сводится к удалению растворителей путем высушивания хроматограммы, опрыскиванию ее препаратом холинэстеразы, легкому подсушиванию и использованию для проявления индикаторно-буферного субстратного раствора. На хро-матограмме соответственно локализации инсектицида в результате локального подавления холинэстеразной реакции обнаруживают пятно синего цвета на желто-зеленом фоне (рис. 5). Как и при других методах хроматографии, ИГ-пятна соответствуют химической природе инсектицида. Выбор наиболее благоприятных условий для хроматографии ряда инсектицидов требует дальнейших исследований.
Таким образом, для внедрения в практику могут быть рекомендованы и микрометод, и портативный набор, позволяющие обнаруживать в различных объектах внешней среды минимально токсические количества фосфорсодержащих инсектицидов и других антихолинэстеразных агентов. Этот набор позволяет, во-первых, давать быстрый сигнал, предупреждающий об опасности (при сносе волны инсектицидного аэрозоля) попадания инсектицидов в воду водоемов или загрязнения ими близлежащих пастбищ, во-вторых, производить быструю предварительную экспертизу зараженности воды, пищевых продуктов и других объектов внешней среды. Для более детальной экспертизы целесообразно сочетать групповой холинэстеразный тест с данными химического анализа на индивидуальные инсектициды. . Доказана принципиальная
возможность использования для тех же целей более сложного варианта холинэстеразного метода.
НИ
шшш
Выводы
Разработан простой высокочувствительный групповой метод обнаружения фосфорсодержащих инсектицидов в различных объектах внешней среды, основанный на свойственном им антихолинэстеразном действии.
Для осуществления этого метода сконструирован портативный набор, содержащий стойкие при хранении ампулированные реактивы. Набор включает реактивы, необходимые для проведения 100 анализов. Определение инсектицидов может быть проведено в полевых условиях.
Предварительное суждение о загрязнении продукта инсектицидами может быть получено в течение 10—20 мин.
Изучен антихолинэстеразный эффект 6 важнейших инсектицидов и построены калибровочные кривые для их определения. Метод (без предварительной активации) позволяет определить от 1 до 100 мкг инсектицидов в 1 мл.
Установлено, что антихолинэстеразная активность хлорофоса при растворении его в буферных растворах при pH 7,4 и под влиянием вытяжек из растений постепенно возрастает. Это объясняется, по-видимому, трансформацией инсектицида в соединение, обладающее большим антихолинэстеразным действием.
Показана принципиальная возможность использования сочетания приемов фроматографии на бумаге с антихолинэстеразной реакцией в целях идентификации химической природы фосфорсодержащих инсектицидов.
ЛИТЕРАТУРА
_ ф в
Голиков С. Н., Розенгарт В. И. Фармакология и токсикология фосфор-органических соединений Л., I960. — Каган Ю. С. Токсикология фосфорорганиче-ских инсектицидов и гигиена груда при их применении. М., 1963. — Медведь Л. И. В кн.: Гигиена, токсикология и клиника новых инсектофунгицидов. М., 1959, стр. 5.— Покровский А. А. Биохимия, 1956, в. 6, стр. 683. — Gunther F. А., В 1 i n п R. С., J. agrie. Food Chem., 1953, v. 1, p. 325. — Idem, Analysis of Insecticides and Acari-cides. New York, 1955 —Mete alf R.# L., J. econ. Entomol., 1951, v. 44, p. 883.— Me tea If R. L., Organic Insecticides, New York, 1955.
Поступила 16/1 1964 r.
