CC BY
35Органический синтез и биотехнология
УДК 547.241: 661.12.091.547 В.И. Крутиков1, А.В.Еркин2, В.В.Крутикова3
Специалистам в области биоорганической химии хорошо известен факт, что многие фосфорорга-нические соединения (ФОС) проявляют ярко выраженное антиферментное, чаще всего антихолинэ-стеразное, действие. Это обстоятельство нередко обусловливает их опасные для человека физиологические свойства. Однако однозначно оценивать подобные ФОС только как ядовитые вещества абсолютно неверно. Многие соединения этого класса обладают рядом уникальных физиологических свойств, важность которых, к сожалению, часто нивелируется из-за высокой токсичности веществ. Биологическое действие ФОС, впервые примененных в качестве инсектицидов, дефолиантов, а также в некоторых других областях, связано с их антихо-линэстеразной активностью. ФОС, оказывающие холинэргическое действие, используются и в качестве лекарственных препаратов [1, 2], в частности, в офтальмологии и акушерстве. Наряду с этим изучалось и неантихолинэстеразное действие многих фосфорорганических веществ. В медицине получили признание фосфорсодержащие лекарственные препараты, которые обладают маловыраженной анти-холинэстеразной активностью и принципиально отличаются от ранее внедренных лекарств, как по химической структуре, так и по механизму действия. Широко применяются фосфорсодержащие витамины, препараты для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, нейротропные, антибактериальные,
1-ГИДРОКСИФОСФИНАТЫ: ЗАВИСИМОСТЬ «СТРУКТУРА -БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ» И ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ
Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет) 190013, Санкт-Петербург, Московский пр., д. 26
Антихолинэстеразная активность 1-гидрокси-2,2,2-
трихлорэтилалкил- и -фенилфосфинатов значительно превышает таковую для известных соединений аналогичной структуры. Высокая ингибирующая активность целевых продуктов по отношению к эстеразе, выделенной из штамма Bacillus subtllls, при их низкой токсичности позволит расширить ассортимент антибактериальных средств. Кроме того, изучение антиэстеразной активности полифторалкоксильных производных фосфоновых и фосфорной кислот показало, что наиболее существенный вклад в уровень ингибирования ферментов вносят именно эфирные полифторсодержащие фрагменты. Обнаружение в исследуемом ряду фосфорорганических веществ обратимых ингибиторов эстераз открывает перспективы использования их в качестве малотоксичных антидотов.
Ключевые слова: гидроксифосфонаты, неферментное дегидрохлорирование, бактериальные ферменты, обратимые ингибиторы эстераз, полифторалкоксильные радикалы.
антигельминтные, гормональные препараты и другие.
Таким образом, снижение острой и хронической токсичности ФОС in vivo при сохранении их полезных для человека свойств является актуальной задачей, решение которой требует серьезных усилий.
В последние два десятилетия многие исследователи проявляют интерес к методам синтеза и обнаружения биологической активности фосфоно-вых (то есть содержащих, по крайней мере, одну связь фосфор-углерод) кислот и их производных, которые могут рассматриваться в качестве аналогов природных фосфатов. Особую группу ФОС, обладающих физиологической активностью, представляют 1-гидроксифосфонаты. Химические и биологические свойства 1-гидроксифосфонатов, впервые синтезированных еще полвека тому назад, с точки зрения их практического применения весьма интересны. Реакционная способность гидроксильной группы и ферментативная устойчивость связи фосфор-углерод позволяют предположить высокую вероятность проявления подобными соединениями биологической активности. Диметил-(1-гидрокси-2,2,2-трихлорэтил)фосфонат - уникальное соединение, нашедшее в прошлом веке свое применение и в качестве одного из эффективнейших инсектицидов (.хлорофос), и в офтальмологии - в качестве миоти-ческого средства для понижения внутриглазного давления при глаукоме (под синонимом хлороф-
1 Крутиков Виктор Иосифович, д-р хим. наук, профессор каф. химии и технологии синтетических билогически активных веществ, e-mail: [email protected]
2 Еркин Андрей Викторович, канд. хим. наук, доцент каф. химии и технологии синтетических билогически активных веществ, e-mail: [email protected]
3 Крутикова Вера Валентиновна, мл. научн. сотр. каф. химии и технологии синтетических билогически активных веществ, e-mail: [email protected]
тальм). В настоящее время из-за достаточно высокой хронической (но не острой!) токсичности хлорофос не производится и не используется в бытовой практике. Исключен из номенклатуры лекарственных средств и хлорофтальм. Однако недавно в научной литературе появились сведения о том, что для лечения болезни Альцгеймера предприняты попытки использовать ФОС - необратимые ингибиторы холинэстеразы [3]. Примером такого препарата может служить метрифонат (он же хлорофос!), разработанный фирмой Bayer. Все вышесказанное определяет актуальность исследований в области синтеза эфиров 1-гидроксиалкилфосфоновых и -фосфиновых кислот, при этом решение проблемы снижения токсичности подобных веществ далеко до своего завершения.
Нами предложен синтез полифторалкильных эфиров (1-гидрокси-2,2,2-трихлорэтил)алкил- и фе-нилфосфиновых кислот (1).
(rü)2p
/Я
(CF2CFAH
он
1а-ч
Известно, что активность ингибитора холинэ-стераз зависит от электрофильной фосфорилирую-щей способности ингибитора, склонности к гидрофобной сорбции на поверхности фермента и комплемента рности молекулы ингибитора системе «гидрофобный участок - эстеразный центр» [4]. Такие закономерности проявления антихолинэстераз-ной активности были выведены, исходя из структур «традиционных» ингибиторов (зарин, фосфорилтио-холины и т.п.). Однако большой синтетический материал по необратимым и обратимым ингибиторам эстераз, накопленный за последние годы, требует переосмысления подхода к созданию оптимальной структуры ингибитора. Основная идея проведенных нами исследований заключалась в синтезе новых
соединений с более эффективным по сравнению с хлорофосом антиэстеразным действием при сохранении низкой токсичности in vivo, что позволит в значительной степени снизить эффективную концентрацию действия препаратов. Это может быть достигнуто следующими путями. Во-первых, сохранением структурного остова 1-гидроксифосфонатов с возможным дегидрохлорированием в условиях организма, что обусловливает их превращение в диалкилдихлорвинилфосфаты (структурные аналоги дихлофоса). Во-вторых, введением дополнительной связи фосфор-углерод, что обеспечит ферментативную устойчивость целевых соединений in vivo. В-третьих, увеличением липофильности алкоксильных радикалов за счет введения в них атомов фтора, что способствует более прочной фиксации ФОС на гидрофобных участках поверхности фермента.
Впервые эфиры 1-гидрокси-2,2,2-трихлорэтилфосфоновой кислоты были получены по реакции Абрамова действием хлораля на неполные эфиры кислот трехвалентного фосфора [5, 6]. Мы получали полифторалкильные эфиры (1-гидрокси-2,2,2-трихлорэтил)алкил- и фенилфосфиновой кислот (1) реакцией соответствующих полных алкил- и арилфосфонитов с хлоральгидратом:
RjP(üR2)2 + CCl3CH(OH)2
1 + ROH
В результате реакции были выделены два типа продуктов: эфиры (1) и в незначительном количестве кристаллические алкил- или арил-1-гидрокси-2,2,2-трихлорэтилфосфиновые кислоты: ^Р(0)(0Н)СН(0Н)Са3 2
Исходные фосфониты ^Р(0^)2 синтезировали по традиционной реакции дихлорангидридов ал-кил- и фенилфосфонистых кислот с соответствующим спиртом [7]. Необходимо, однако, подчеркнуть, что фенилфосфониты с полифторалкоксильными радикалами, в отличие от традиционного метода,
Таблица 1. Антиэстеразная активность 1-гидрокси-2,2,2-трихлорэтилполифтор-алкилфосфинатов
и -фосфонатов 1 и их физико-химические характеристики
№ соед. Ri R2 Константы ингибирования фермента, kn, л/моль- мин lg p qP V, Ä3
БуХЭ ЭБв
1а CeH5 CH2CF2CF2H 6.50-10 6 3.40-105 3.08 0.159 829
1б CeH5 CH2(CF2CF2)3H 3.50-107 4.20-105 6.41 0.159 1097
1в CeH5 CH2C3F7 4.30-106 1.80-105 4.63 0.159 899
1г CeH5 C3H7 6.20-106 3.30-105 2.80 0.159 804
1д CeH5 C2H5 2.20-10 6 2.70-105 2.33 0.159 729
1е CCÍ3 CH3 1.10-103 3.10-105 4.06 0.198 652
1ж CH3 CH2(CF2CF2)4H 5.10-103 1.31-105 7.35 0.148 1118
1з OC2H5 C2H5 2.75-103 4.06-102 3.86 0.267 682
1и OC6H13 C6H13 4.20-103 1.80-107 7.17 0.267 1102
1к CH3a CH2(CF2CF2)2H 2.50-10 6 5.00-105 4.01 0.148 841
1л CH3 CH2(CF2CF2)3H 6.20-10 6 3.88-106 5.68 0.148 990
1м C2H5 CH2(CF2CF2)2H 6.07-10 6 1.37-107 4.35 0.151 903
1н CH3 CH2CF2CF2H 1.80-106 3.45-106 2.34 0.148 703
1о C6H5 CH2(CF2CF2)2H 3.20-107 4.70-105 4.74 0.159 955
1п CH3 C8H17 1.55-103 - 4.04 0.148 931
1р C6H5 CH2CF3 2.20-10 6 2.90-105 2.96 0.159 768
1с C6H5 C4H9 4.20-10 6 1.70-105 3.19 0.159 851
1т OC4H9 C4H9 1.16-10 4 1.13-103 5.59 0.267 879
1у изоОС,^ изоC4H9 1.16-10 4 1.13-103 5.60 0.267 904
1ф (ClCH2)2CHO (ClCH2)2CH 2.58-10 4 1.35-10 4 6.13 0.267 940
1х OCH2CF2CF2H CH2CF2CF2H 4.07-107 1.80-107 5.35 0.267 890
1ц изоОС^у изоC3H7 8.21-103 - 4.68 0.267 770
1ч OCH3 CH3 4.00-103 3.2 -105 3.17 0.266 576
2а CH3 OH 5.1103 1.31105 2.64 0.173 467
получали без применения акцептора хлористого водорода.
Целевые соединения (1) представляют собой вязкие медленно кристаллизующиеся жидкости. Образование кристаллических продуктов (2) объясняется взаимодействием примесных кислых фосфо-нитов в исходных реагентах с хлоральгидратом.
Дериватограммы синтезированных веществ (1) показали их термическую устойчивость до 150-180°С. При нагревании веществ выше указанных температур происходил отрыв алкоксильных радикалов.
Данные антиэстеразной активности 1-гидрокси-2,2,2-трихлорэтилфосфонатов и -фосфинатов (1) (таблица 1) показывают, что все соединения проявили in vitro высокую ингибирую-щую способность по отношению к бутирилхолинэ-стеразе (БуХЭ, КФ 3.1.1.8) из сыворотки крови лошади и эстеразе, выделенной из штамма грамполо-жительной почвенной бактерии Bacillussubtilis (BBS).
Подавляющее большинство работ по исследованию строения и свойств эстераз относится к эстеразам животного происхождения, играющих центральную роль в универсальном и биологически важном процессе передачи нервного импульса. БуХЭ является резервным ферментом, восполняющим недостаток ацетилхолинэстеразы в экстремальных условиях. По некоторым предположениям, БуХЭ расщепляет остатки органических макромолекул, накапливающиеся в процессе жизнедеятельности. Не исключено участие БуХЭ в процессах детоксика-ции ксенобиотиков. Растительные и микробные эс-теразы изучены в меньшей степени. Известно, что мицелиальные грибы продуцируют эстеразы, характеризующиеся низкой чувствительностью к действию ФОС и карбаматов. Микробные эфиролитиче-ские ферменты определены и в продуцентах бактерий различных родов [8].
Анализ уровня биологической активности целевых продуктов показал, что замена алкоксильных радикалов полифторалкоксильными в них усилило антиэстеразное действие в 100-1000 раз по сравнению с хлорофосом (1ч). Оценку антиэстеразной активности in vitro проводили по методике, основанной на сопоставлении скоростей ферментативного гидролиза хромогенного субстрата индофенилацета-та [4]. Принимали, что лимитирующей стадией процесса ингибирования является реакция псевдопервого порядка. Истинная константа ингибирования фермента kn определена по формуле:
kii = In (Vo/Vt) / т ■ [In], (1)
где v0 и vT - скорости ферментативного гидролиза до и после контакта фермента с ингибитором при времени инкубации (т) от 1 до 10 минут; [In] -концентрация ингибитора фермента (~ 10-4 моль/л).
Для установления фактора, ответственного за повышение биологической активности, мы использовали метод многомерного регрессионного анализа (модель Ганча) связи между структурой и ингиби-торной активностью исследуемых соединений по отношению к БуХЭ и BBs.
Самой распространенной системой констант, характеризующих индуктивное и резонансное влияние заместителей у атома фосфора, по праву является система корреляционных констант Кабачника, однако при ее использовании часто не удается од-
нозначно решить проблему ортогонализации индуктивного и резонансного влияния заместителей. Поэтому в настоящей работе величину электронной плотности на атоме фосфора мы рассчитывали квантово-химическим методом (см. ниже).
Известно, что гидрофобные взаимодействия играют весьма существенную роль при ингибирова-нии эстераз [9]. Для оценки гидрофобности соединений (!) нами применен параметр липофильности lgP, характеризующий равновесное распределение вещества в системе липид-вода.
Роль стерического фактора при взаимодействии ингибиторов с эстеразами проявляется уже на первой стадии фосфорилирования фермента. Именно поэтому, учитывая особенности строения эстераз [10], в качестве параметра, характеризующего сте-рический фактор, мы использовали величину объема молекулы ингибитора V.
Величины электронной плотности на атоме фосфора, объем молекулы и параметр липофильно-сти lgP целевых соединений рассчитывались с использованием пакета программ HyperChem™ Release 7.52 for Windows Molecular Modeling System после геометрической оптимизации структуры по методу Флетчера-Ривза. Ниже представлены параметры корреляционных уравнений, характеризующих особенности ингибирования различных эстераз соединениями (!) (уравнения 2-9, таблица 2). Обращают на себя внимание высокие коэффициенты всех корреляций при большом числе степеней свободы (520).
Анализ полученных корреляционных зависимостей позволяет выявить некоторые закономерности взаимодействия 1-гидрокси-2,2,2-трихлоралкил-и -фенилфосфинатов с эстеразами животного и бактериального происхождения. Во-первых, свободный член (ао) во всех уравнениях близок к нулю, что свидетельствует об адекватности эксперименту полученных математических моделей. Действительно, при равенстве нулю всех членов корреляций (2-9), что становится возможным в отсутствие ингибитора, константа ингибирования фермента должна равняться 1. С учетом концентрации ингибитора такой случай реализуется при равенстве величин v0 и vT, (уравнение 1), то есть как раз в отсутствие ингибирования фермента.
Во-вторых, наиболее существенную роль в полученных корреляциях играет параметр липо-фильности lgP. Вместе с тем, оптимальное значение этого параметра для ингибиторов БуХЭ и BBs различны. Если приравнять нулю первые производные функций (5) и (9) (таблица 2), то величины lgPonT составляют 5.4 и 11.4 соответственно. Это указывает на большую чувствительность BBs к ингибиторам с гидрофобными фрагментами.
Таким образом, изучение свойств 1-гидрокси-2,2,2-трихлорэтилалкил- и -фенилфосфинатов показало, что их антиэстеразная активность значительно превышает таковую для известных соединений аналогичной структуры. Это обеспечивает снижение эффективной концентрации препарата в сотни раз. Высокая ингибирующая активность целевых продуктов по отношению к эстеразе из штамма Bacillus subtilis при их низкой токсичности позволит расширить ассортимент в ряду антибактериальных средств.
Таблица 2. Параметры корреляционных уравнений lg kn = ao + ajg P + a2 (lg Pf + a3tf + a4V
Фермент Ингиби-торы ao ai a2 аз а4 r s n № уравнения
1а-ч, 2а -0.0102 0.265 -0.129 -5.15 0.00949 0.969 0.70 24 2
БуХЭ 1а-ж, кс, 2а 0.00047 - 0.176 -0.083 -0.767 0.00976 0.976 0.58 16 3
1а-ч, 2а -0.0044 - 2.40 - 0.019 - 0.0206 0.966 0.39 8 4
1а-ч, 2а -0.0027 1.71 - 0.159 - - 0.962 0.41 8 5
1а-ч, 2а 0.0190 0.442 - 0.104 - 0.975 0.00690 0.964 0.72 22 6
1а-ж, кс, 2а 0.00441 0.872 - 0.119 10.8 0.00313 0.993 0.29 15 7
1а-ч, 2а 0.00234 - 12.7 0.438 - 0.0691 0.962 0.43 7 8
1а-ч, 2а 0.00711 1.16 - 0.051 - - 0.925 0.59 7 9
Высокий уровень антиэстеразной активности эфиров (1-гидрокси-2,2,2-трихлорэтил)алкил- и фенилфосфиновых кислот (1) во многом обусловлен неферментативным дегидрохлорированием этих соединений в дихлорвинилфосфаты и -фосфонаты:
о
4'
Ч O
Р °н
R2O
CCL
R\ о
Р
/5 -5 + Р^ O
R^
CCL
т
он
CCl,
(R3CO)2O
O
r2o
'Г
CCl
OC(O)R, 3а-ж
r2o
n
Ч/
Cl
CCl
Cl
Подобная перегруппировка облегчена сильным отрицательным индуктивным влиянием полиф-торалкоксильных радикалов на атом фосфора. Кроме того, введение гидрофобных групп в отщепляемую или неотщепляемую часть молекулы ингибитора усиливает его необратимое ингибирующее действие по отношению к эстеразам [4]. В связи с этим представляется интересным выяснить, какой фактор влияния полифторалкоксильнных групп на уровень антиферментной активности более весом. Решение подобной задачи может быть осуществлено двумя основными способами. Во-первых, оценкой биологической активности соединений с защищенной гидро-ксильной группой. Во-вторых, заменой трихлорме-тильной группы на радикал, не способный к дегид-рогалогенированию.
Нами синтезирован ряд 1-ацилокси-2,2,2-трихлорэтилфосфонатов и -фосфинатов общей формулы (3). Целевые соединения получали взаимодействием 1-гидрокси-2,2,2-трихлорэтилфосфо-натов с ангидридами или хлорангидридами полига-логенкарбоновых кислот:
Использование в качестве ацилирующих агентов производных полигалогенкарбоновых кислот диктуется необходимостью максимально затруднить процессы высвобождения гидроксильной группы соединений (3) in vitro и их последующего дегидрохлорирования.
Соединения (3) испытаны на биологическую активность in vitro по отношению к БуХЭ, BBs и аце-тилхолинэстеразе (АХЭ, КФ 3.1.1.7) из эритроцитов крови человека. Обращает на себя внимание значительно более высокий уровень антиферментной активности полифторсодержащих ацилоксипроизвод-ных (3а-г) (таблица 3) по сравнению с нефториро-ванными аналогами. При этом следует подчеркнуть, что константы ингибирования фермента kn практически совпадают с таковыми для 1-гидроксипроизводных (1). Интересно также, что «полифторацилированные хлорофосы» 3 е, ж, и на 1-2 порядка активнее самого хлорофоса. Отмеченные факты позволяют сделать вывод о том, что неферментативное дегидрохлорирование не является единственной и главной причиной высокой антиэстеразной активности 1-гидроксифосфонатов и -фосфинатов. Вероятнее всего рост величины kn обусловлен главным образом усилением гидрофобной сорбции ингибитора на поверхности фермента.
Корреляционный анализ с применением параметра липофильности lgP и величины объема молекулы V позволил нам получить зависимость для угнетения БуХЭ соединениями (3):
lg kn = - 2.85 + 0.940 lg P -- 0.137 (lg P)2 + 0.00759 V (10)
r 0.975 s 0.36 При этом значение оптимальной величины lgP для этой группы ингибиторов составило 3.43, что
R
R
+ R3COOH
R2O
№ соед. Ri R2 R3 Ig P V, Ä3 Константа ингибирования фермента, кп, л/мольмин
АХЭ БуХЭ ЭББ
3а C6H5 OCH2CF2CF2H CCI3 3.11 1022 - 4.57-10 6 2.00-105
3б C6H5 OCH2(CF2CF2)2H CCI3 4.78 1162 - 2.57-107 4.47-105
3в C6H5 OCH2(CF2CF2)3H CCI3 6.45 1297 - 2.82-107 3.98-105
3г C6H5 OCH2CF3 CCI3 2.99 1028 - 1.70-10 6 1.78-105
3д OCH3 OCH3 CF3 2.65 758 2.51-10 4 3.98-10 4 -
3е OCH3 OCH3 CF2CF2H 2.76 808 3.24-105 2.51-105 -
3ж OCH3 OCH3 C3Fr 4.31 830 3.02-10 4 3.98-10 4 -
3з a OC6H5 OC6H5 CH3 3.00 913 - 3.55-105 4.47-10 4
3и OCH3 OCH3 CH3 1.53 753 6.03-103 6.03-103 -
lg P
V, Ä3
Константа ингибирования фермен та,
_кц, л/мольмин_
АХЭ
БуХЭ
4.57-106
тг
ЭББ
2.00-105 4.47-105
№ соед. Константа ингибирования фермента, кп, л/мольмин Ig P V, Ä3
АХЭ БуХЭ
4а 4.00-10 2 2.00-10 3 6.35 878
4б 2.30-10 2 1.80-10 6 6.58 1004
4в 5.00-10 "4 2.50-10 "4 13.3 1510
CCh
3.11
1022
са
4.78
1162
2.57
10
ЮГ ЮГ
3.98-105 1.78-105
CCl
6.45
1297
2.82
ССК
2.99
1028
1.70
CF,
2.65
758
2.51-10
3.98
10
3.24-105
~2CF2l
2.76
808
2.51
10
3ж
OCH
ОСН
C3Fr
4.31
830
3.0210
3.98
10
ЮГ
юг
3з
ОСбН
■6П5
ОСбН
6П5
CH
3.00
913
3.55
4.47-10
3и
ОСН
ОСН
CH
1.53
753
6.03-10
6.03
Примечание. а - соединения 3з и 3и- афос и ацетилдиптерекс соответственно.
Таблица 4. Биологическая активность 1-гидроксиоктафторпентилфосфонатов 4
№ соед.
Константа ингибирования фермента, кп, л/мольмин
АХЭ
БуХЭ
lg P
V, Ä3
4а
4.00-10
2.00-10
6.35
878
4б
2.30-10
1.80-10
6.58
1004
4в
5.00-10
2.50-10
13.3
1510
значительно меньше аналогичных параметров для 1-гидроксифосфинатов (1). Объясняется это, скорее всего, дополнительным и существенным влиянием величины объема молекулы ингибитора на уровень биологической активности. Сказанное подтверждается достаточно строгой зависимостью 1д кп - V (рисунок 1), при этом повышение эффективности необратимого угнетения эстеразы на 2-3 порядка может быть объяснено увеличением объема молекулы ингибитора. Отмеченный факт подтверждает важность сорбции соединений 3 на гидрофобной области между имидазольным кольцом гистидина и гидро-ксильной группой серина эстеразного центра фермента.
Рис. 1. Влияние объема молекулы ацилокси-2,2,2-трихлорэтилфосфонатов и -фосфинатов на уровень анти-бутирилхолинэстеразной активности
Для угнетения ЭБб препаратами (3) обнаружены достаточно большие величины кп, по крайней мере, на порядок превышающие данные для афоса (таблица 3) Однако уровень необратимого антиэсте-разного действия практически не зависит от структурных особенностей ингибиторов. Обусловлено это, во-первых, ферментативной устойчивостью связи фосфор-углерод для объемных фенильных радикалов соединений (3). Во-вторых, заметным отличием
геометрических размеров «кармана» бактериальной эстеразы, содержащего активные центры, от таковых для БуХЭ.
Для ответа на вопрос, поставленного в начале настоящего сообщения, мы синтезировали ряд 1-гидроксифосфонатов, содержащих не трихлорме-тильную, а октафторбутильную группировку (4). При этом становится невозможным отщепление протона от гидроксильной группы и тем самым исключается метаболическое превращение фосфонатов в винилфосфаты.
Соединения (4 а-в) получали по известной реакции [11, 12]:
(RfO)3P
H(CF2CF2)2CHO • H2O
O
(RfO)2^ .(CF2CF2)2H
RfOH
он 4
Биологическая активность гидроксифосфонатов (4) представлена в таблице 4.
1-Гидроксифосфонаты и -фосфинаты (4) являются слабыми ингибиторами холинэстераз. При этом необходимо отметить неожиданное обратимое ингибирование холинэстераз полифтора л коксифос-фонатом
/у
O
(RO)„P
(CF-CFAH
OH
Объяснить подобное явление можно следующим образом. Известно, что в ряде случаев возможно комбинированное ингибирование холинэстераз фосфорорганическими соединениями [4]:
Е1г Е + Тп - -
ЕТп
ЕТп
где E - фермент, In - ингибитор, Ein - комплекс Михаэлиса-Ментен, Ein' - фосфорилированный фер-
R
3
3
3
2
3
2
6
мент, EIr - ингибиторный комплекс, не способный к превращению в Ein'.
Подобная схема часто встречается при изучении кинетики реакций с равновесным образованием промежуточного продукта. При этом обычными приемами изучения кинетики часто не удается определить, лежит ли промежуточный продукт на маршруте реакции или образуется параллельно [13]. В нашем случае изменение концентрации ингибитора не привело к снижению его активности, что подтверждает образование именно комплекса EIr. Комбинированное ингибирование холинэстераз проявляется не только при наличии у атома фосфора объемных гидрофобных радикалов. Этот эффект выявляется в тех случаях, когда у атома фосфора находятся две алкоксильные группы, причем обратимая составляющая в большей степени выражена у БуХЭ, чем у АХЭ [4]. Однако в нашем случае обратимый характер ингибирования наблюдается для обоих ферментов. Обусловлено это введением в молекулу субстрата гидрофобных групп, что приводит к ослаблению антихолинэстеразной активности и появлению обратимой компоненты. Особо следует отметить, что обратимый ингибитор эстераз обладает очень высокой гидрофобностью и большим объемом молекулы (таблица 4). В связи с этим представляет интерес оценить биологическую активность соединений с легко отщепляющимися гидрофобными радикалами. Для такой роли больше всего подходят полифторалкилфосфаты.
При проведении реакции гидрата 5-гидрооктафторпентаналя с триметилфосфитом конечными продуктами являются соответствующие смешанные фосфаты, образующиеся в результате фосфоно-фосфатной перегруппировки 1-гидрокси-фосфонатов [12]:
ингибирование эстераз, особенно АХЭ. При этом найдены следующие корреляционные зависимости:
для АХЭ - 1д кп = - 3.30 - 0.671 1д Р -
- 0.056 (1д Р)2 + 0.0122 V (11)
г 0.916 Б 0.46 для БуХЭ - 1д кп = 1.46 + 4.88 1д Р -
- 0.350 (1д Р)2 - 0.0124 V (12)
г 0.998 Б 0.12 Параметры корреляций (11) и (12, рисунок 2) однозначно указывают на важность учета гидрофобных и стерических параметров при оценке инги-биторной активности полифторалкилфосфатов. Кроме того, наблюдается совпадение основных параметров корреляционных уравнений с таковыми для 1-гидрокси-2,2,2-трихлорэтилфосфонатов. В частности, величина 1дРопт составила 5.09 (из расчета максимума функции (9)), что хорошо согласуется с величиной, полученной для соединений (1)
Рис. 2. Влияние параметра липофильности фосфатов (5) на константу ингибирования БуХЭ
(СНзО)зР + H(CF2CF2)2CHO • H2O
-- (CH3O)2P(O)OCH2(CF2CF2)2H+ ROH
5 а, б
Остальные смешанные фосфаты и фосфонаты получали по реакции Тодда-Атертона с неполными фосфитами или фосфонитами:
R,(R7O)P(O)H + R3OH
NEt3, CCl4 R O
/P^OR3 R,O ^
5 в-ж
+ CHCl3 + NEt3 ■ HCl
Данные о биологической активности полифто-рал кил фосфатах представлены в таблице 5. Анализ этих данных показывает неэффективное необратимое
Нами также обнаружено обратимое угнетение АХЭ и БуХЭ ди(1,1,5-тригидрооктафтор-пентил)этилфосфонатом (5ж), причем концентрация субстрата, обеспечивающая 50%-ное ингибирование фермента, на два порядка ниже, чем для фосфоната (4 в).
Таким образом, изучение антиэстеразной активности полифторалкоксильных производных фос-фоновых и фосфорной кислот показывает, что наиболее существенный вклад в уровень ингибирова-ния ферментов вносят именно эфирные полифтор-содержащие фрагменты. При этом эстераза микробного происхождения более чувствительна к гидрофобным субстратам. Появление в исследуемом ряду фосфорорганических веществ обратимых ингибиторов эстераз открывает перспективы использования их в качестве малотоксичных антидотов.
Таблица 5. Антихолинэстеразная активность смешанныхполифторалкилфосфатов и -фосфонатов 5
№ соед
Константа ингибирования фермента, kn, л/моль-мин
АХЭ
БуХЭ
lg p
v, ä:
5а
СНзО
СНз
CH2(CF2CF2)2H
4.30*102
4.79*10'
3.31
724
5б
СНО
СН
CH2(CF2CF2)3H
2.00*10
1.51*10
4.98
879
5в
C2H5O
CH
CH2(CF2CF2)2H
2.20*10:
3.98*10!
4.00
799
5г
изо&^О
изо^^
CH2CF2CF2H
4.30*10:
2.53*10:
3.16
805
5д
изо&^О
изо^7
ch2(cf2cf2)Bh
2.00*104
7.94*10:
6.49
1170
5е
CH
CH2CF3
CH CF
8.00*10
4.27*10
2.27
658
5жа
C2H5
CH2CF2CF2H
CH2CF2CF2H
2.00 *10"
2.00 *10"
5.84
1137
Примечание. а - для соединения 5ж приведены значения мольной концентрации вещества /С™, вызывающей 50%-ное обратимое угнетение фермента.
R
R
R
2
Литература
1. Вельтищев Ю.Е., Юрьева Э.А.Кудрин А.М. Биологически активные фосфоновые кислоты и их производные //Хим.-фарм. журн. 1983. Т. 17. № 3. С. 282-290.
2. Юделевич В.И., Комаров Е.В., Ионин Б.И. Фосфорорганические лекарственные препараты // Хим.-фарм. журн. 1985. Т. 19. № 6. С. 668-685.
3. Cummings J.L. Cholinesterase Inhibitors: A New Class of Psychotropic Compounds // Am. J. of Psychiatry. 2000. Vol. 157. N 1. P. 4-21
4. Бресткин А.П., Годовиков Н.Н. Комбинированный вид ингибирования холинэстераз фосфорор-ганическими соединениями // Усп. хим. 1978. Т. 47. Вып. 9. С. 1609-1626.
5. Абрамов В.С., Каширский М.И. О взаимодействии арил(алкил)фосфинистых кислот с альдегидами и кетонами. Эфиры а-оксиалкилфенилфосфиновых кислот // Ж.общей химии. 1958. Т. 28. Вып. 11. С. 3059-3062.
6. Барабанов В.И., Абрамов В.С. О взаимодействии фосфинистых кислот с альдегидами и кетонами // Ж.общей химии. 1965. Т. 35. Вып. 12. С. 22252228.
7. Крутиков В.И., Семенова Е.С., Масленников И.Г., Лаврентьев А.Н. Синтез полифторалкильных эфиров трихлорметилфосфоновой и фосфиновых кислот // Ж.общей химии. 1983. Т. 53. Вып. 7. С. 1557-1560.
8. Михайлова Р.В., Лобанок А.Г., Захаренко И.Н. Специфические эстеразы грибов рода Aspergilius и Flisanum // Прикл. биохимия и микробиология. 1997. Т. 33. Вып. 5. С. 492-494.
9. Абдувахабов А.А., Михайлов С. С., Щербак И.Г. Антиферментное действие и детоксикация фос-форорганических ингибиторов эстераз. Ташкент: Фан, 1989. 184 с.
10. Мусил Я., Новакова О., Кунц К. Современная биохимия в схемах. М.: Мир, 1984. 216 с.
11. Фокин А.В., Студнев Ю.Н., Рапкин А.И., [и др.]. Взаимодействие а,а,ю-тригидроперфтор-алкиловых эфиров фосфористой кислоты с полиф-торкарбонильными соединениями // Изв. АН СССР. сер хим. 1981. С. 1655-1658.
12. Алейников С.Ф., Крутиков В.И., Масленников И.Г., [и др.]. Взаимодействие эфиров кислот P(III) с гидратом 1,5-дигидроперфторпентаналя. Кинетика реакций // Ж.общей химии. 1983. Т. 53. Вып. 7. С. 1537-1541..
13. Гаммет Л. Основы физической органической химии. М.: Мир. 1972. 534 с.
14. Алейников С.Ф., Крутиков В.И., Микишева Л.И., Лаврентьев А.Н. Взаимодействие эфиров кислот P(III) с гидратом 1,5-дигидроперфторпентаналя III. Триалкилфосфиты // Ж.общей химии. 1984. Т. 54. Вып. 4. С. 968.
