CC BY
31УДК 543.553: 615:613.015.12
Определение холинэстераз крови с использованием высокочувствительного амперометрического биосенсора на основе фермент-полиэлектролитных нанопленок
Громова М.С., Крайнова Н. А., Торгонская А. А., Сиголаева Л.В., Рудакова Е.В., Махаева Г.Ф., Еременко А.В., Курочкин И.Н.
Химический факультет, Московский Государственный Университет,
Институт физиологически активных веществ Российской академии наук, г. Черноголовка
Разработан амперометрический планарный холинокси-
дазный биосенсор для высокочувствительного опреде- Ключевые слова: холиноксидаза, биосенсоры, анализ холи-
ления холина и активностей холинэстераз. C помощью нэстераз, кровь биосенсора измерены уровни активности ацетилхолинэстера-зы (АХЭ) и бутирилхолинэстеразы (БХЭ) в экспериментах по их селективному ингибированию in vitro в препаратах крови мышей, а также при дозозависимом ингибировании АХЭ и БХЭ после введения мышам модельного фосфорорганическо-го ингибитора. Биосенсорные измерения были валидизованы спектрофотометрически.
Введение. Определение активности ацетилхолинэстеразы эритроцитов (КФ 3.1.1.7, АХЭ) и бутиририлхолинэстеразы плазмы (КФ 3.1.1.8, БХЭ) является важной задачей как при проведении экспериментальных исследований в токсикологии, нейробиологии, фармакологии, так и в клинической практике - терапии, в т.ч. анестезиологии и клинической токсикологии. АХЭ эритроцитов и БХЭ плазмы используют в качестве чувствительных биомаркёров для детекции воздействия на организм фосфорорганических отравляющих веществ, пестицидов [1] и антихолинэстеразных лекарственных средств [2]. Уровень активности БХЭ определяет реакцию организма на введение миорелаксантов типа сукцинилхоли-на [3, 4], способность гидролизовать кокаин [5] и ряд лекарственных препаратов [6], характеризует защитные свойства организма при действии фосфорорганических токсикантов [7-9].
На сегодняшний день наиболее распространенным методом определения активности холинэстераз в крови является спектрофотометрия [10-13]. Развитие оптических методов достигло высокого уровня и позволяет осуществлять высокопроизводительный анализ холинэстераз в лабораторных условиях [14] Основной проблемой спектрофотометрического определения холинэстераз в цельной крови методом Эллмана является высокое базовое поглощение гемоглобина, приводящее к снижению чувствительности метода [12, 13]. В настоящее время растет потребность в определении этих ферментов в полевых условиях, что может быть достигнуто с использованием амперометрических биосенсоров за счет минимальной пробоподготовки и быстроты анализа в цельной крови, поскольку их принцип действия исключает влияние гемоглобина, и возможности миниатюризации конструкции [15-17]. Разработан большой спектр проводящих поверхностей для создания амперометрических биосенсоров. Среди них наиболее часто используемыми материалами для создания рабочих электродов являются графит (пасты, стержни, печатные электроды), платина, золото [18, 19].
Одним из простых, дешевых и удобных способов формирования сенсорных покрытий практически на любой поверхности является метод последовательной адсорбции полиэлектролитов и ферментов (LBL). Он заключается в чередующейся электростатической адсорбции на некоторую поверхность компонентов, несущих противоположный заряд. Эта технология была успешно использована для создания амперометриче-ских холиноксидазных биосенсоров [20-23]. Так, в статье [23] с помощью метода LBL на поверхности графитового стержня, покрытого медиатором оксидом марганца был сформирован бислой из холиноксидазы и полидиаллилдиметиламмоний хлорида (ПДДА) (в присутствии йодид-иона), чувствитель-
ность по холину составила 183,3 мАМ"1см"2. В работе [21] для создания биосенсора нанопленка (ПДДА/ХО)8/(ПВС/ПАА)3/ МСУНТ была нанесена на поверхность Pt-электрода, чувствительность по холину составила 176,5 мА- М~1-см~2. Таким образом, метод LBL позволяет создавать биосенсоры различной структуры и состава и в качестве подложки может быть использован широкий спектр материалов.
Широко используемым и технологичным методом изготовления амперометрических биосенсоров является метод трафаретной печати [24]. Технология трафаретной печати является быстрой, дешевой и простой процедурой изготовления электродов и в комбинации с технологией LBL может быть удачно использована для создания широкого спектра чувствительных биосенсоров. Вместе с тем, в литературе не описаны холиноксидазные сенсоры, изготовленные на основе планарных электродов и технологии LBL, и исследования их возможностей для анализа биологических образцов.
Таким образом, целью настоящей работы явилась разработка амперометрического холиноксидазного биосенсора, на основе нанопленок ПДДА и холиноксидазы, нанесенных на поверхность графитового электрода, изготовленного по технологии трафаретной печати и покрытого медиаторным слоем диоксида марганца. Была исследована возможность практического применения разработанного биосенсора для анализа холинэстераз в цельной крови, в том числе после воздействия ингибиторов холинэстераз в экспериментах in vitro и на целых животных. Проведена валидизация биосенсорного метода путем сравнения результатов биосенсорных измерений и стандартного спектрофотометрического определения активности холинэстераз.
Материалы и методы исследования. В настоящей работе были использованы следующие реактивы: холиноксидаза (Е.С. 1.1.3.17) из Alcaligenes sp. (13,5 Ед/мг), ацетилхоли-нэстераза (АХЭ, Е.С. 3.1.1.7) из эритроцитов человека (781,8 Ед/мг), бутирилхолинэстераза (БХЭ, Е.С. 3.1.18) из сыворотки крови лошади (264 Ед/мг) (Sigma); полидиаллилдиметилам-моний хлорид, 20% (масс.) (ПДДА, Mw = 400000-500000 г/ моль) (Aldrich); ацетилхолин (Sigma-Aldrich); 5,5'-дитиобис-2-нитробензойная кислота (ДТНБ), холин хлорид, ацетил-тиохолин хлорид (АТХ), S-бутирилтиохолинхлорид (БТХ) (Sigma); бутирилхолин (БХ, синтезирован в лаборатории органического синтеза каф. Химической энзимологии Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова); (-)-гуперзин А, диэтил-4-нитрофениловый эфир фосфорной кислоты (па-раоксон), тетрамоноизопропилпирофосфотетрамид (изо-ОМ-ПА) (Sigma); 4-аминоантипирин (Acros organics). Модельный дибутилфосфат синтезирован и любезно предоставлен в.н.с. Института физиологически активных веществ РАН к.х.н. Ак-
синенко А.Ю. Для изготовления планарных электродов использовалась проводящая графитовая паста (C2050517D1, Gwent).
Остальные реактивы были марки Х.Ч. и использовались без предварительной очистки. Все растворы готовились в де-ионизованной воде, полученной при помощи системы очистки воды Milli-Q (18,2 MD см).
Создание планарных графитовых электродов
Изготовление планарных электродов проводилось по методу трафаретной печати с использованием полуавтоматической машины Winon (модель WSC-160B). Графитовый слой наносили на поливинилхлоридные подложки толщиной 0,2 мм через трафарет с сеткой 200 меш. Затем электроды прогревали при температуре 600С в течение двух часов.
Формирование пероксидчувствительного слоя
Формирование пероксидчувствительного слоя проводили по методу, описанному в работе [25], путём нанесения капли (10 мкл) раствора коллоидных частиц оксида марганца (IV) на предварительно сформированную методом трафаретной печати поверхность. После полного высыхания капли электроды промывали деионизованной водой в течение 1 мин и выдерживали 1 час при Т=600С. Модифицированные электроды могли храниться при комнатной температуре в течение 3 месяцев.
Формирование холиноксидазного биосенсора
Перед нанесением полиэлектролитов рабочую поверхность электрода диаметром 2,5 мм ограничивали изолирующей плёнкой. Слой ПДДА наносили путем адсорбции из капли (5 мкл) 1 мг/мл раствора ПДДА в 50 мМ фосфатном буфере, рН 7,0 в течение 40 мин, после чего 1 минуту промывали дистиллированной водой, для удаления неспецифически адсорбировавшихся молекул. Полученный слой поликатиона высушивали в эксикаторе над силикагелем в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем наносили каплю (5 мкл) 0,75 мг/мл раствора ХО (pI 4,1) в 50 мМ Hepes, 30 мМ KCl, рН 7,5, выдерживали 10 мин и снова промывали водой 1 минуту. Нанесение всех компонентов проводилось в климатической камере при 25оС и относительной влажности воздуха 60%. После высушивания в течение 20 мин на открытом воздухе при комнатной температуре, готовые электроды использовали для измерений.
Готовые холиноксидазные биосенсоры хранили с осушителем при 4°С.
Измерение электрохимических откликов
Электрохимические исследования проводили на потенци-остате-гальваностате IPC-compact (Институт физической химии РАН, Москва, Россия). Амперометрические измерения холина проводили в 1 мл двухэлектродной ячейке с перемешиванием, снабженной Ag/AgCl электродом, относительно которого поддерживался заданный потенциал (+480 мВ) на рабочем электроде. В качестве рабочего электрода использовали графитовый планарный электрод с нанесёнными на них фермент-полиэлектролитными слоями. Рабочий электрод погружали в ячейку, заполненную буферным раствором (50 мМ Hepes, 30 мМ KCl, рН 7,5), и измеряли отклик электрода на добавление стандартной концентрации холина (10-4 М).
Эксперименты на животных
В экспериментах использовали самцов белых аутбредных мышей массой 25-30г. Дибутилфосфат растворяли в ДМСО и вводили в/бр в дозах 0,5+2000 мг/кг в объеме около 0,1 мл. Контрольные животные получали только ДМСО. Через 1 час после введения мышей декапитировали, кровь собирали в стеклянные стаканы, которые предварительно ополаскивали 3,8% цитратом натрия. В качестве антикоагулянта добавляли гепарин (20 ml раствора 500 Ед/мл). Затем кровь переносили в пластиковые пробирки, замораживали в жидком азоте и хранили при
-70oC до проведения измерений. Для постановки электрохимического метода определения холинэстераз в крови и исследований in vitro использовали кровь интактных животных.
Приготовление гемолизата крови для анализа
Замороженную и хранящуюся при -70°C кровь оттаивали на водяной бане со льдом. Затем готовили 1:100 гемолизаты путем разбавления 1 объема крови в 100 объемах охлажденного на водяной бане со льдом 0,1 М натрий фосфатного буфера, рН 7,5. После тщательного перемешивания аликво-тированные гемолизаты немедленно замораживали в жидком азоте и хранили при -70°C до проведения анализов. Непо-
средственно перед началом анализа образцы оттаивали при комнатной температуре.
Электрохимическое определение активности бутирилхо-линэстеразы
Активность БХЭ определяли путем детекции холина, выделяющегося после 30 мин инкубации гемолизата (или коммерческого препарата фермента) с 10 мМ бутирилхолином при комнатной температуре. Содержание гемолизата в инкубационной смеси составляло 50%. Далее электрохимическое определение накопившегося холина проводили в электрохимической ячейке при разбавлении аликвоты инкубационной смеси в 25 раз. При тех же условиях был измерен спонтанный гидролиз бутирилхолина и вычтено фоновое значение холина в субстрате. Коммерческий препарат БХЭ растворяли в 0,1 М натрий фосфатном буфере, содержащем 1 мг/мл БСА. рН 7,5.
Ингибирование активности бутирилхолинэстеразы в крови мышей изо-ОМПА
Для ингибирования активности БХЭ изо-ОМПА в инкубационную смесь добавляли водный раствор ингибитора в диапазоне концентраций 310-9 + 1,710-2 М. Смесь инкубировали с ингибитором в течение 10 минут при комнатной температуре, затем реакцию с ингибитором останавливали добавлением избытка бутирилхолина и определяли остаточную активность фермента. Конечная концентрация бутирилхолина в инкубационной смеси составляла 10 мМ, разведение гемоли-зата в инкубационной смеси в два раза. Смесь инкубировали с бутирилхолином 30 минут, далее проводили электрохимическое определение накопившегося холина (при разбавлении инкубационной смеси в 25 раз). При тех же условиях был измерен спонтанный гидролиз субстрата и контрольная проба без ингибитора. При расчете процента ингибирования из полученных значений откликов было вычтено фоновое значение холина в субстрате.
Электрохимическое определение активности ацетилхо-линэстеразы
Активность АХЭ определяли путем детекции холина, выделяющегося после 30 мин инкубации гемолизата (или коммерческого препарата фермента) с 3 мМ ацетилхолином при комнатной температуре. Для вычленения активности АХЭ осуществлялась 10 мин преинкубация гемолизата со специфическим ингибитором БХЭ изо-ОМПА (0,9 мМ) [26]. Разведение гемолизата в инкубационной смеси в два раза. Далее проводили электрохимическое определение накопившегося холина (разбавление инкубационной смеси в 25 раз). При тех же условиях был измерен спонтанный гидролиз ацетилхоли-на и вычтено фоновое значение холина в субстрате. Коммерческий препарат АХЭ растворяли в 0,1 М натрий фосфатном буфере, содержащем 1 мг/мл БСА, рН 7,5.
Ингибирование активности ацетилхолинэстеразы в крови мышей (-)-гуперзином А
Для ингибирования активности АХЭ гуперзином А в инкубационную смесь добавляли водные растворы изо-ОМПА (0,9 мМ) и (-)-гуперзина А в диапазоне концентраций 10-6 + 10-5 М. Смесь инкубировали с ингибиторами в течение 10 минут при комнатной температуре, затем реакцию с ингибитором останавливали добавлением избытка ацетилхолина и определяли остаточную активность фермента. Конечная концентрация ацетилхолина в инкубационной смеси составляла 3 мМ. Разведение гемолизата в инкубационной смеси в два раза. Смесь инкубировали 30 минут, далее проводили электрохимическое определение накопившегося холина при разбавлении аликвоты инкубационной смеси в электрохимической ячейке в 25 раз. При тех же условиях был измерен спонтанный гидролиз субстрата и контрольная проба без ингибитора. При расчете процента ингибирования из полученных значений откликов было вычтено фоновое значение холина в субстрате.
Ингибирование АХЭ и БХЭ активностей крови мышей специфическими ингибиторами в экспериментах in vitro (спектрофотометрический метод)
Для ингибирования активности БХЭ изо-ОМПА в лунки планшета раскапывались следующие растворы: 2 мкл раствора ингибитора в диапазоне концентраций 3,3510-9 - 210-3 М; 25 мкл гемолизата крови. Гемолизат инкубировали с ингибитором в течение 10 минут при комнатной температуре, затем туда же добавляли 150 мкл свежеприготовленной смеси, содержащей 0,47 мМ ДТНБ и 1,65 мМ БТХ в натрий фосфатном буфере рН 7,5 и определяли остаточную активность фер-
мента. При этом конечная концентрация бутирилтиохолина составила 1,4 мМ, а объемная доля гемолизата была равна 14,1 %. При тех же условиях измеряли спонтанный гидролиз субстрата и активность контрольной пробы, не содержащей ингибитор. Скорость образования окрашенного продукта определялась спектрофотометрически при длине волны 405 нм в кинетическом режиме на планшетном спектрофотометре BIO-RAD xMarkTM.
Для ингибирования активности АХЭ (-)-гуперзином А в лунки планшета раскапывались: 10 мкл изо-ОМПА (концентрация в инкубационной смеси 0,9 мМ), 5 мкл раствора (-)-гуперзина А (диапазон концентраций 10"6-10"10 М), 25 мкл гемолизата и 80 мкл натрий фосфатного буфера. Смесь инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре, затем туда же добавляли 7 мкл 12 мМ ДТНБ и 50 мкл 10 мМ АТХ и определяли остаточную активность фермента. Конечная концентрация АТХ в реакционной смеси составила 2,82 мМ, объемная доля гемолизата 14,1 %. При тех же условиях измерялись спонтанный гидролиз субстрата и контрольная проба без ингибитора. Скорость образования окрашенного продукта определялась спектрофотометрически при длине волны 405 нм в кинетическом режиме на планшетном спектрофотометре BIO-RAD xMarkTM.
Обработка данных
За величину аналитического сигнала биосенсора принимали разность величин стационарного тока до и после введения пробы. Данные представлялись как среднее ± SE на основании не менее трех измерений отклика биосенсора, полученных в одинаковых условиях.
Воспроизводимость изготовления биосенсоров (RSD, %) определяли как разброс значения отклика на введение стандартной концентрации холина 10-4 М для 10 электродов.
Операционную стабильность биосенсоров характеризовали величиной инкремента падения за одно измерение, которая рассчитывалась по тангенсу угла наклона зависимости отклика электрода от номера измерения по формуле: D=(tg/ ^>100%.
Для обработки данных использовали программный пакет OriginPro7.
Результаты и их обсуждение.
Холиноксидазный биосенсор
Холиноксидазные электроды получали с использованием метода послойного нанесения полиэлектролитов. Пленки ПДДА и ХО последовательно наносились на поверхность планарного графитового электрода, модифицированного медиатором диоксидом марганца, формируя бислойную структуру ПДДА/ХО. Схематическое изображение биосенсора и принципа его работы представлено на рис.1.
Электрохимическая активность биосенсора определяется скоростью ферментативного окисления добавляемого в систему холина, сопровождающаяся выделением двух молекул пероксида водорода. Пероксид водорода вступает в реакцию с медиатором MnO2, находящимся на поверхности электрода, приводя к образованию Mn2+/3+. Отклик биосенсора представляет собой величину тока электроокисления Mn2+/3+ до Mn4+, прямо пропорциональную концентрации выделяющегося пероксида водорода, которая в свою очередь определяется концентрацией вводимого холина.
При разработке биосенсора были подобраны оптимальные условия адсорбции (описанные в разделе «Материалы и методы исследования») фермента и полиэлектролита на поверхность электрода.
Зависимость отклика полученного биосенсора от концентрации холина в электрохимической ячейке приведена на рис.2.
Из полученной зависимости был рассчитан передел обнаружения по холину, который составил 110"7М (сигнал/ шум=3) и чувствительность биосенсора 340 мАМ"1см"2. Сенсор характеризуется широким линейным диапазоном измеряемых концентраций 210"7^410"4М. Эффективная константа Михаэлиса холиноксидазы, включенной в состав пленки, была рассчитана методом нелинейной регрессии и составила 0,75±0,4 мМ. Полученное значение KM* совпадает в пределах ошибки со значенем Км нативного фермента (1,03±0,3 мM).
Операционная стабильность биосенсоров, определенная по 10 последовательным измерениям, составила -0,1±0,1%. Воспроизводимость отклика от сенсора к сенсору составила 4,1%. Электроды сохраняют не менее 50% активности при
хранении с осушителем при 4°С в течение 5 месяцев.
Применение холиноксидазного биосенсора для анализа холинэстераз в крови
Исследована возможность использования разработанного биосенсора для электрохимического определения активности холинэстераз в крови.
Для стандартизации процедуры пробоподготовки была использована следующая схема. Свежая или оттаявшая после хранения при -70 оС цельная кровь разбавлялась буферной средой в 100 раз и быстро замораживалась при -70оС (или в жидком азоте) для разрушения форменных элементов. Подготовленные таким образом образцы крови (гемолизаты) могли храниться в течение нескольких месяцев при той же температуре до использования без заметного снижения активности целевых ферментов.
В настоящей работе была использована следующая схема определения активностей АХЭ и БХЭ (рис. 3). Для определения активности АХЭ требуемое количество гемолизата инкубируют с селективным ингибитором БХЭ в течение 10 минут, после чего туда же добавляют субстрат ацетилхолин и инкубируют в течение времени Для определения активности БХЭ гемолизат инкубируют с бутирилхолином в течение времени ^ (здесь и далее такую смесь, содержащую гемолизат, ингибитор, субстрат, будем называть инкубационной смесью.) Затем аликвоту инкубационной смеси переносят в электрохимическую ячейку с буфером. Как было показано в предварительных экспериментах, 25-ти кратное разбавление инкубационной смеси, происходящее в электрохимической ячейке, приводит к остановке ферментативного гидролиза. Далее измеряют количество холина, накопившегося к моменту остановки реакции разбавлением, используя холинок-сидазный биосенсор. Отклик биосенсора на образовавшийся в инкубационной смеси холин пропорционален активности соответствующего фермента в гемолизате.
Постановка биосенсорной методики анализа холинэстераз включала два основных этапа. Первый этап - оценка влияния гемолизата на определение холина, подбор оптимального содержания гемолизата в инкубационной смеси и времени инкубации с субстратами, концентраций субстратов. Второй этап представлял собой систему доказательства достоверности измеряемой ферментативной активности.
Для определения оптимального уровня содержания гемо-лизата в инкубационной смеси и в электрохимической ячейке учитывали два фактора: высокое содержание гемолизата в инкубационной смеси и, соответственно, в измерительной ячейке вызывает уменьшение активности датчика, но вместе с тем это позволяет накапливать большее количество продукта и таким образом увеличить чувствительность анализа. При исследовании влияния разбавления гемолизата в измерительной ячейке на отклик используемых сенсоров было показано, что разбавление гемолизата в электрохимической ячейке в 50 (и более) раз не оказывает заметного влияния на аналитические характеристики биосенсора. В связи с этим, разбавление гемолизата в инкубационной смеси в 2 раза и последующее 25-кратное разбавление в ячейке (50-кратное разбавление гемолизата) оказалось оптимальным и было использовано для дальнейших экспериментов.
Была исследована кинетика накопления холина в процессе ферментативного гидролиза больших и малых концентраций АХ и БХ в крови мышей. Данные представлены на рис. 4.
Как видно из графика, во всем исследуемом временном диапазоне и для разных концентраций субстратов наблюдается линейная зависимость отклика сенсора от времени инкубации (начальная скорость гидролиза). Чем больше время инкубации, тем выше чувствительность метода. Однако общая продолжительность процедуры определения активности ферментов должна быть максимально снижена. Для определения начальной скорости ферментативного гидролиза АХ и БХ было выбрано время 30 мин, находящееся на линейном участке.
Зависимости скоростей ферментативного гидролиза АХ и БХ под действием АХЭ и БХЭ крови от концентрации соответствующих субстратов представляют собой гиперболические кривые с насыщением (рис. 5). 90% отклика достигается при концентрациях АХ и БХ, соответственно 3 мМ и 10 мМ.
Таким образом, используя подобранные условия, можно измерять активности холинэстераз в формате «конечной точки» по количеству холина, накопившегося в инкубационной
смеси в течение фиксированного периода времени, и его последующей детекции с использованием холиноксидазного биосенсора.
Для оценки достоверности определения эстераз в крови с использованием нового амперометрического биосенсора были проведены следующие эксперименты. Был исследован эффект матрицы и получены калибровочные зависимости по концентрациям коммерческих препаратов ферментов в чистых буферных растворах и в присутствии гемолизата. Затем были проведены эксперименты по валидизации биосенсорных измерений активности холинэстераз с использованием стандартного спектрофотометрического метода в опытах по селективному in vitro ингибированию наблюдаемых активностей каждого фермента в цельной крови (гемолизате) и в экспериментах на животных (мышах) по измерению активностей эстераз, после введения возрастающих доз фосфорор-ганического ингибитора.
Зависимость активности коммерческих препаратов АХЭ эритроцитов человека и БХЭ сыворотки крови лошади от их концентрации в присутствии и в отсутствие гемолизата в инкубационной смеси представлены на рис. 6 и 7. Полученные зависимости представляют собой параллельные прямые, что свидетельствует о вкладе в отклик только собственной АХЭ или БХЭ активности гемолизата и отсутствии влияния матрицы на амперометрический сигнал.
Из полученных зависимостей откликов сенсоров от концентраций коммерческих препаратов ферментов в буферном растворе были рассчитаны пределы обнаружения этих ферментов на основании минимально определяемых концентраций холина, вычисленных при соотношении сигнал/шум = 3. Пределы обнаружения АХЭ и БХЭ составили 4,5 и 2 нмоль/ мин/мл, соответственно.
Селективное ингибирование in vitro активностей АХЭ и БХЭ в цельной крови проводили с использованием гемоли-зата крови мышей и следующих ингибиторов: изо-ОМПА для БХЭ и (-)-гуперзина А - для АХЭ [27]. Измерение остаточной активности эстераз в препаратах крови проводилось электрохимически в оптимальных условиях согласно разработанному формату анализа и спектрофотометрически по стандартным методикам. В спектрофотометрическом методе для определения активности АХЭ и БХЭ использовали ти-оаналоги субстратов - ацетилтиохолин и бутирилтиохолин.
Кривые титрования ферментативных активностей (зависимости % ингибирования от концентрации ингибитора), полученные биосенсорным и спектрофотометрическим методами, оказались достаточно близки, даже при условии использования разных субстратов (рис. 8). В обоих случаях наблюдалось практически 100% ингибирование активности целевого фермента соответствующим специфическим ингибитором.
В таблице 1 приведены величины IC для каждого фер-
мента, полученные двумя методами. Из таблицы видно, что сравниваемый аналитический параметр имеет близкие значения при испольАзовании спектрофотометрической и биосенсорной методик, что подтверждает достоверность и корректность определяемых активностей ферментов и является успешным результатом первого этапа валидизации разработанного формата анализа.
Для исследования возможности применения биосенсорного определения активностей АХЭ и БХЭ при отравлениях ФОС c использованием спектрофотометрической и биосенсорной методик было проведено измерение активностей АХЭ и БХЭ в крови мышей через 1 час после в/бр введения возрастающих доз модельного дибутилфосфата (C4H9O)2P(O) OCH(CF3)2 (ЛД50 > 2000 мг/кг) .
Результаты дозозависимого ингибирования БХЭ и АХЭ в крови мышей, полученные двумя методами, представлены на рис. 9 в виде % ингибирования эстераз (в сравнении с контролем) от дозы дибутилфосфата. Показано, что БХЭ является более чувствительным биомаркером по сравнению с АХЭ (ЕД = 26,4±2,4 и 132,5±8,7 мг/кг (N=6), соответственно). Наблюдается хорошее соответствие между результатами, полученными обоими методами: зависимости между величинами активностей АХЭ и БХЭ, измеренными спектрофотометрически и с использованием биосенсора, характеризуются высокими коэффициентоми корреляции -0,99 и 0,98, соответственно. Полученные данные подтверждают достоверность и валидность биосенсорных измерений и демонстрируют применимость нового биосенсора для биомониторинга воздействия ФОС на живые организмы, в том числе на человека.
Выводы. С использованием технологии LBL разработан высокочувствительный планарный холиноксидазный биосенсор на основе нанопленок ХО и ПДДА. Продемонстрировано его практическое использование на примере определения АХЭ и БХЭ в цельной крови мышей. Высокая чувствительность биосенсора позволяет определять холи-нэстеразы в низких концентрациях, что обуславливает использование малых количеств (несколько мкл) пробы для анализа. Показана применимость нового биосенсора для биомониторинга воздействия ФОС на живые организмы. Разработанный амперометрический биосенсор может быть использован в полевых условиях, а также в режиме «у постели больного» за счет минимальной пробоподготовки, быстроты анализа в цельной крови, низкой стоимости одного анализа и возможности миниатюризации конструкции.
Работа выполнена при финансовой поддержке Грантов РФФИ 11-08-01306-а и 10-08-00895-а и гранта НАТО sfp 984082.
Рис. 1. Схематическое изображение холиноксидазного биосенсора и принципа его работы.
Рис.2. Зависимость отклика биосенсора от концентрации холина в электрохимической ячейке. Концентрации холина 1*10-7+1*10-2М.
ингибирование ЧАХ БХЭ
гемолизат:
АХЭ, БХЭ и др. •ччБХ 12
гемолизат
1*6ХЭ —>
1 +АХ ,
Инкубационная смесь /
Разбавление в 25 раз в
гемолизат _^
+ 6Х
Разбавление а 25 раз в — ячейке
Биосенсорное -> определение -холина
Биосенсорное определение ■ холина
Анализ АХЭ
Анализ БХЭ
Рис. 3. Общая схема определения активностей ацетилхолинэстеразы и бутирилхолинэстеразы в крови. 1*БХЭ - заингибированная БХЭ
50 45 40
<
1 35 га"
о 30
0
1 25
0
Ю 20
1 15
I-
5 О
О 10 20 30 40 50 60 70
Время, мин
Рис. 4. Кинетические кривые накопления холина при ферментативном гидролизе бутирилхолина и ацетилхолина пода действием БХЭ и АХЭ в крови мышей. Условия для АХЭ: 20 мкл гемолизата, 0,9 мМ изо-ОМПА. Условия для БХЭ: 20 мкл гемолизата.
10 15 20
Концентрация субстрата, мМ
Рис. 5. Зависимость ферментативного гидролиза ацетилхолина (А) и бутирилхолина (•) под действием АХЭ и БХЭ крови. Условия для АХЭ: объем инкубационной смеси 40 мкл, 20 мкл гемолизата, 0,9 мМ изо-ОМПА, время преингибирования 10 мин, время инкубации с субстратом 30 минут, концентрация АХ 0,12-18,8 мМ. Условия для БХЭ: объем инкубационной смеси 40 мкл, 20 мкл гемолизата, время инкубации с субстратом 30 минут, концентрация БХ 3,3-40,0 мМ.
0,02 0,04 0,06 0,08
Концентрация АХЭ, мкг/мл
140
120
я 100
О.
о о
80
60
40
20
0,02 0,04 0,06 0,08 Концентрация БХЭ, мкг/мл
0,1
0,12
Рис. 6. Зависимость активности АХЭ, измеренной биосенсорным методом от концентрации коммерческого препарата АХЭ в чистом буферном растворе (% %) и в присутствии гемолизата
крови (3/4?3/4) , преинкубированного в течение 10 мин с изо-ОМПА (0,9 мМ). Условия: объем инкубационной смеси 40 мкл, 20 мкл гемолизата, 3 мМ ацетилхолина, время инкубации с субстратом 30 минут.
Рис. 7. Зависимость активности БХЭ, измеренной биосенсорным методом, от концентрации коммерческого препарата БХЭ в чистом буферном растворе (%?%) и в присутствии гемолизата
крови (%? /'i). Условия: объем инкубационной смеси 40 мкл, 20 мкл гемолизата, 10 мМ бути-рилхолина, время инкубации с субстратом 30 минут.
Концентрация (-)-гуперзина А, М
100
80
60
40
20
Б)
ны
Л.
ны-р=о /
6'Х
0 20 40 60 80 100
% ингибирования спектрофотометр ия
ТТТТТТ]-1—ГТТТТТТ]-1—ГТТТТТТ]-1—ГТТТТТТ]-1—ГТТТТП]-1 I I IIМ1|-11111111]-1—ГТТТТТТ]-1 I I I 1Ш|-1—I
1010 109 108 107 10"6 10-5 10"4 10-3 10'2
Концентрация ¡эо-ОМРА, М
Рис.8. Кривые титрования активности А) АХЭ (-)-гуперзином А, Б) БХЭ изо-ОМПА в крови мышей, полученные при использовании спектрофотометрической (•) и электрохимической (Д) методик. На вставке: корреляция между результатами измерения, полученными электрохимическим и спектрофотометрическим методами. Для АХЭ R = 0,999, для БХЭ R = 0,987.
Доза дибутилфосфата, мг/кг
Рис. 9. Доз-зависимое ингибирование БХЭ и АХЭ в крови мышей через 1 час после в/бр введения дибутилфлосфата (СдНдО)2Р(0)0СН(СРз)2, N=4-6. Активности эстераз в цельной крови определяли спек-трофотометрически (открытые символы) и биосенсорными методами (заштрихованные символы) и представляли в виде; %% ин гибирования активности соответствующей эстеразы у контрольных животных. Активности эстераз у контрольных животных (спектрофотометрия) в мкмоль/мин/мл крови, АХЭ - 0,83±0,04 (N=18), БХЭ - 0,63±0,03 (N=20). Активности у контрольных животных (биосенсорные методы) в мкмоль/мин/мл крови, АХЭ - 0,76±0,09 (N=5), БХЭ - 0,85±0,03 (N=5). На вставке представлена корреляция двух методов при определении БХЭ.
Таблица 1
Значения IC-. ингибирования in vitro специфическими ингибиторами АХЭ и БХЭ крови мышеи па результатам спектрофотометрическои и электрохимической методик.
Ю!0(АХЭ)±БЕ, M 1С5л(БХЭ)±8Е, M
Ингибитор (-)-гуперзин А изо-ОМПА
Спектрофотометрия (2,9±0,4)х10-> (1,4±0,1)х10-6
Электрохимия (0,8±0,06)х10-> (0,85±Л,Л5)х10-6
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Richardson R.J. Anticholinesterase insecticides. In: Comprehensive Toxicology, (McQueen C.A. Ed.) // Oxford: Academic Press, 2010, V. 13, P. 433-444.
2. Giacobini E. Cholinesterases: new roles in brain function and in Alzheimer's disease // Neurochem Res., 2003. - V. 28. - P. 515-22.
3. Lockridge O. Genetic variants of human serum cholinesterase influence metabolism of the muscle relaxant succinylcholine // Pharmacol. Therap., 1990. - V. 47. - P. 35-60.
4. Pirmohamed M., Park B.K. Genetic susceptibility to adverse drug reactions // Trends Pharmacol. Sci., 2001. - V. 22. - P. 298-305.
5. Zhan C.G., Zheng F., Landry D.W. Fundamental reaction mechanism for cocaine hydrolysis in human butyrylcholinesterase // J. Am. Chem. Soc., 2003. - V. 125. - №9. -P. 2462-2474.
6. Wierdl M., Morton C.L., Danks M.K. et al. Isolation and characterization of a cDNA encoding a horse liver butyrylcholinesterase: evidence for CPT-11 drug activation // Biochem. Pharmacol., 2000. - V. 59. - №7. - P. 773-81.
7. Makhaeva G.F., Rudakova E.V., Boltneva N.P. et al. Blood Esterases as a Complex Biomarker for Exposure to Organophosphorus Compounds. In: "Counteraction to Chemical and Biological Terrorism in the East Europe Countries", NATO for Peace and Security Series, (Dishovsky C. and Pivovarov A., Eds.) // Springer, 2009. - P. 177-194.
8. Masson P., Carletti E., Nachon F. Structure, activities and biomedical applications of human butyrylcholinesterase // Protein Pept. Lett., 2009. - V. 16. - P. 1215-1224.
9. Masson P., Nachon F., Broomfield C.A et al. A collaborative endeavor to design cholinesterase-based catalytic scavengers against toxic organophosphorus esters // Chem. Biol. Interact., 2008.
- V. 175. - № 1-3. - P. 273-280.
10. Ellman G.L., Courtney K.D., Andres V.J. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity // Biochem. Pharmacol., 1961. - V. 7. - P. 88-95.
11. Okabe H., Sagesaka K., Nakajima N. et al. New enzymatic assay of cholinesterase activity // Clin. Chim. Acta, 1977. - V. 80. - P. 87-94.
12. Worek F., Mast U., Kiderlen D. et al. Improved determination of acetylcholinesterase activity in human whole blood // Clin Chim Acta, 1999. - V. 288. - P. 73-90.
13. Рудакова Е.В., Болтнева Н.П., Махаева Г.Ф. Сравнительный анализ эстеразной активности крови человека, мыши и крысы // Бюл. Эксп. Биол. Мед, 2011. - Т. 152, - №7. - С. 80-83.
14. Haigh J.R., Lefkowitz LJ., Capacio B.R. et al. Advantages of the WRAIR whole blood cholinesterase assay: comparative analysis to the micro-Ellman, Test-mate ChE, and Michel (DeltapH) assays // Chem Biol Interact, 2008. - V.175. - P. 417-420.
15. Sigolaeva L., Makhaeva G., Rudakova E. et al. Biosensor analysis of blood esterases for organophosphorus compounds exposure assessment: approaches to simultaneous determination of several esterases // Chem Biol Interact., 2010. - V. 187. - P. 312-317.
16. Wilson G. S., Hu Y. Enzyme-based biosensors for in vivo measurements // Chem. Rev., 2000. - V. 100. - P. 2693-2704.
17. Pohanka M., Hrabinova M., Kuca K. Diagnosis of intoxication by the organophosphate VX: Comparison between an electrochemical sensor and Ellman's photometric method. Sensors, 2008. - V.8. - P. 5229-5237.
18. Chaubey A., Malhotra B. D. Mediated biosensors // Biosens. Bioelectron., 2002. - V. 17.
- P. 441-456.
19. Mehrvar M., Abdi M. Recent developments, characteristics, and potential applications of electrochemical biosensors // Anal. Sci., 2004. - V. 20. - P. 1113-1126.
20. Shi H., Song Z., Huang J. et al. Effects of the type of polycation on the amperometric response of choline biosensors prepared by a layer-by-layer deposition technique // Mater. Sci. Eng. C, 2005. - V. 25. - P. 433-435.
21. Qin X., Wang H., Wang X. et al. Amperometric choline biosensors based on multiwall carbon nanotubes and layer-by-layer assembly of multilayer films composed of poly(diallyldimethylammonium chloride) and choline oxidase // Mater. Sci. Eng. C, 2009. - V. 29. - P. 1453-1457.
22. Shi H., Yang Y., Huang J. et al. Amperometric choline biosensors prepared by layer-by-layer deposition of choline oxidase on the Prussian blue-modified platinum electrode // Talanta, 2006. - V. 70. - P. 852-858.
23. Gromova M.S., Sigolaeva L.V., Fastovets M.A. et al. Improved adsorption of choline oxidase on a polyelectrolyte LBL film in the presence of iodide anion // Soft Matter, 2011. - V. 7. - P. 7404-7409.
24. Tudorache M., Bala C. Biosensors based on screen-printing technology, and their applications in environmental and food analysis // Anal. Bioanal. Chem., 2007. - V. 388. - P. 565-578.
25. Донцова Е. А., Будашов И. А., Еременко А. В. и др. Пероксид-чувствительный амперо-метрический сенсор на основе наночастиц диоксида марганца // Российские нанотехноло-гии, 2008. - Т. 3. - №7-8. - С. 133-143.
26. Jennings N. A., Pezzementi L., Lawrence A. L. et al. Acetylcholinesterase in the sea urchin Lytechinus variegatus: characterization and developmental expression in larvae // Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol, 2008. - V. 149. - P. 401-409
27. Liu J., Zhang H.Y., Tang X.C. et al. Effects of synthetic (-)-huperzine A on cholinesterase activities and mouse water maze performance // Zhongguo Yao Li Xue Bao, 1998. - V.19. -P.413-416.
Gromova M.S., Krainova N.A., Torgonskaya A.A., Sigolayeva L.V., Rudakova Ye.V. , Makhaeva G.F., Yeryomenko A.V., Kurochkin I.N.
Determination of blood cholinesterases using a highly sensitive amperometric biosensors based on enzyme- polyelectrolyte nanofilms
Department of Chemistry, Moscow State University
A planar amperometric choline oxidase biosensor was developed for a highly sensitive determination of choline and cholinesterases activity. Levels of acetylcholinesterase (AChE) and butyrylcholinesterase (BChE) activities were measured using the choline oxidase biosensor in experiments on the AChE/BChE selective inhibition in vitro in mice blood samples as well as in experiments on AChE and BChE dose-dependent inhibition in vivo after mice were exposed to a model organophosphorous inhibitor. Biosensor measurements were validated by spectrophotometric methods.
Материал поступил в редакцию 28.10.2011 года
