CC BY
189PPBN ID ppbn.v8i4.987
ТОКСИКОЛОГИЯ
OPEN ACCESS
В.Б. ПРОЗОРОВСКИЙ
Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины; Черниговская ул., 5, Санкт-Петербург 198904, Россия
2457
Резюме
Карбоксим обладает свойствами обратимого неконкурентно-конкурентного ингибитора холинэстеразы, что снижает скорость фосфорилирования фермента и защищает его от необратимой инактивации. В комплексе с атропином (в субэффективных дозах — 5 и 5 мг/кг) обеспечивает повышение эффективности при профилактике в 6-11 раз — индекс защиты равен 26,2. При лечебном применении — 24,9.
Прозоровский В.Б., Скопичев В.Г., Панченкова О.А. Оценка реактиватора холинэстеразы карбоксима как средства профилактики отравлений фосфорорганическими ингибиторами холинэстераз. // Психофармакол. биол. наркол. 2008. Т. 8, № 3-4. С. 2457-2462
Ключевые слова
фосфорорганические ингибиторы холинэстераз (ФОИ); профилактика отравлений; карбоксим как ингибитор холинэстеразы; лечебно-профилактический антидот ФОИ
В.Г. СКОПИЧЕВ
Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины; Черниговская ул., 5, Санкт-Петербург 198904, Россия
О.А. ПАНЧЕНКОВА
Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины; Черниговская ул., 5, Санкт-Петербург 198904, Россия
ОЦЕНКА РЕАКТИВАТОРА ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ КАРБОКСИМА КАК СРЕДСТВА ПРОФИЛАКТИКИ ОТРАВЛЕНИЙ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИМИ ИНГИБИТОРАМИ ХОЛИНЭСТЕРАЗ
ВВЕДЕНИЕ
Инсектициды из группы фосфорорганических соединений (ФОС), ингибиторов холинэстеразы (ХЭ) обладают высокой токсичностью. Во всем мире при производстве, транспортировке, применения на полях, на животноводческих фермах и в быгу ФОС вызывают до 3 000 000 отравлений в год [14]. Согласно Международной Конвенции 1993 года боевые отравляющие вещества, в том числе фосфорорганические (ФОВ), подлежат уничтожению. Возможность возникновения отравлений в процессе этих работ не исключена [11]. При террористических актах в Японии с использованием зарина (1994 и 1995 гг.) в токийском метро было отравлено 650 человек [15]. Считается, что в последующем террористами будут использованы именно ФОВ [16].
Следовательно, в настоящее время не только сохраняется высокая частота отравлений, но и возникла угроза массового поражения населения токсичными ФОВ. В нашей стране созданы оригинальные высокоэффективные антидотные средства: обратимый ингибитор ХЭ аминостигмин [7], М-холиноблокатор пентифин и реактиватор ХЭ карбоксим [3]. На их основе разработаны комплексные антидоты профилактический П-10 и лечебный пелексим, которые могут применяться при авариях и при аварийных работах на объектах уничтожения химического оружия [2]. В общей практике не утратил своего значения и традиционный универсальный М-холиноблокатор атропин.
После распада СССР в России не было налажено производство собственного реактиватора ХЭ. По этой причине созданному в
© Коллектив авторов, 2008; лицензиат ООО «Архив»
ISSN 1606-8181
2458
Институте токсикологии ФМБА, препарату карбок-сим, который обладает рядом уникальных свойств и является реактиватором ХЭ нового поколения [12, 13] должно быть уделено особое внимание.
В данной работе изучена антихолинэстеразная активность карбоксима и перспективность его использования совместно с атропином не только как лечебного, но и как профилактического средства при отравлении ФОС. Такая модель может явиться основой для создания необходимого лечебно-профилактического антидота [10].
реводили в расчетный (фактический) с учетом конкуренции с ацетилхолином. добавляемым в инкубационную смесь [11]. Для фосфакола определяли бимолекулярную константу ингибирования — К2 до и после воздействия на фермент карбоксимом. В опытах in vitro использовали цельную гемолизирован-ную кровь. Активность фермента оценивали в процентах по отношению к контролю, принятому за 100 % . Фосфакол и карбоксим синтезированы в Институте токсикологии ФМБА. Прочие препараты фабричного производства.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Токсикологические исследования
В первой серии опытов оценивали величину дозы карбоксима, необходимой для профилактики гибели 50 % животных (ПД50) при отравлении фосфаколом в дозе 2ЛД50. Карбоксим вводили внутрибрюшинно в комплексе с атропином (в дозе 5 мг/кг подпорого-вой по эффективности) за 15 мин до фосфакола.
Во второй серии определяли показатели индекса защиты и индекса гарантированной защиты по сдвигу кривой доза—эффект фосфакола после введения атропина, карбоксима и их сочетаний в разных дозах.
Опыты выполнены на белых беспородных мышах самцах массой тела 16—22 г, получаемых из Института цитологии РАН. Мышей содержали на стандартном рационе при неограниченном доступе к воде. Растворы препаратов вводили в объеме 0,1 мл/10 г массы животных. Дозы варьировали изменением концентрации веществ. Средние эффективные дозы определяли табличным методом |8|, с использованием в каждом опыте 8—12 животных.
Биохимические исследования
Анти-ХЭ активность карбоксима оценивали в опытах in vitro с использованием очищенной ХЭ эритроцитов человека с активностью 3,6 ЕД/мг. Применен метод непрерывного потенциометрическго титрования ацетата, образующегося при гидролизе аце-тилхолина, раствором КОН на автотитраторе ТТТ-1 с титрографом фирмы «КасНотегг» (Дания) в условиях постоянства рН = 7,4, концентрации субстрата ацетилхолина иодида = 2 х 10-3М и температуры 37,0°. Определяли скорость гидролиза в разные отрезки времени и вычисляли концентрации карбок-сима и других обратимых ингибиторов, необходимых для торможения активности ХЭ на 50 % — I50. Эмпирический показатель, определяемый в опыте, пе-
РЕЗУЛЬТАТЫ ОПЫТОВ
И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В предварительных опытах методом пробитов с расчетом по способу наименьших квадратов [4], определяли средние летальные дозы отдельных препаратов веществ (ЛД50 ± т, мг/кг) и в части случаев вычисляли показатель наклона кривой — ПН = о : ЛД50. Получены следующие величины: атропин — 250,0 ± 38,8, ПН = 0,8, карбоксим — 159,3 ± 47,6, ПН = 0,8, галантамин —16,7 ± 0,2, аминостигмин — 0,23 ± 0,09 и оксазил 4,50 ± 0, 11.
Профилактическая эффективность карбоксима при отравлении армином по показателю ПД50 и коэффициенту эффективности оценена в сопоставлении с прочими обратимыми ингибиторами ХЭ в табл. 1.
Согласно данным, полученным ранее [5], оксазил является аллостерическим ингибитором ХЭ, который снижает ее сродство к ФОС. Именно это обстоятельство лежит в основе его высокой защитной эффективности. Однако оксазил совсем не проникает через гематоэнцефалический барьер. По строению молекулы карбоксим сходен с оксазилом , однако он выгодно отличатся от оксазила тем, что он лучше проникает в мозг [12]. В то же время он, очевидно, имеет сходство с оксазилом как аллостерический ингибитор ХЭ, а именно потому эффективен в малых дозах. Такое свойство обеспечивает ему преимущество перед прочими обратимыми ингибиторами.
Результаты оценки комплекса карбоксима и атропина в разных дозах по эффективности при профилактическом и лечебном введении мышам за 15 мин внутрибрюшинно до подкожного введения фосфакола приведены в табл. 2.
Показатели наклона (ПН) кривых возрастают в опытах по сравнению с контролем в 2,5—5,5 раза, следовательно, сравнительная оценка эффективности противоядий только по ИЗ некорректна. Судя по индексу гарантированной защиты — ИГЗ [9], ат-
Таблица 1
Эффективность обратимых ингибиторов холинэстеразы и карбоксима как средства профилактики отравления,
при их внутрибрюшинном введении совместно с атропином (в фиксированной дозе 5 мг/кг) за 30 до подкожного
введения белым мышам фосфакола. ЕЭ ± т; N = 8—12 2459
Ингибиторы холинэстеразы и карбоксим Показатели токсичности и эффективности препаратов
50, мг/ 50, м / показатель эффективности
Галантамин 16,7 ± 0,20 1,93 ± 0,720 8,65
Аминостигмин 0,23 ± 0,09 0,02 ± 0,012 11,5
Оксазил 4,50 ± 0,11 0,015 ± 0,003 300,0
Карбоксим 159,3 ± 47,6, 1,59 ± 0,7 100,0
Примечание: ЛД50 — средняя летальная доза; ПД50 — профилактическая доза, предупреждающая гибель 50 % животных; ЛД50: ПД50 — показатель эффективности.
Таблица 2
Оценка защитного эффекта атропина, карбоксима в условиях их раздельного и совместного профилактического (за 15 мин) и лечебного # (через 1 мин) внутрибрюшинного применения при отравлении белых мышей фосфаколом подкожно. Число животных в группе 8—10; ЛД50 ± т мг/кг
, мг/ Фосфакол 50 ± m Показатели измерений и коэффициенты защиты
ПН ИЗ ИГЗ
Контроль 0,71 ± 0,21 0,2 - -
10 / 1,79 ± 0,29 0,4 2,5 0,81/1,24 = 0,6
15 мг/ 3,34 ± 0,49 0,5 4,7 1,60/1,24 = 1,3
5 мг/кг + + 5 мг/ 20,0 ± 5,5 0,9 28,2 2,35/1,24 = 1,9
5 / # + + 5мг/кг# 17,7 ± 6,7 1,1 24,9 2,10/1,24 = 1,7
Примечание: ПН — показатель наклона = о : ЛД50 = (т V N^1: ЛД50; ИЗ — индекс защиты = ЛД50опыта: ЛД50контроля; ИГЗ — индекс гарантированной защиты = ЛД 1 опыта: ЛД99 контроля. # — препараты вводили лечебно.
Таблица 3
Сравнительная антихолинэстеразная активность карбоксима с оксазилом и галантамином в присутствии ацетилхолина (150+АХ) и без него (150-АХ) с характеристикой степени конкурентности ингибиторов
Вещества Показатели и характеристика антихолинэстеразной активности
l50+ax c AX l50-ax АХ т -ax . т +ax 150 150 Взаимодействие с холинэстеразой
Галантамин 6,2 10-6 1,7 х 10-7 35,4 конкурентный
Физостигмин - - 12,7 преимущественно конкурентный
Оксазил 8,0 10-10 8,0 10-10 1,0 неконкурентный
Карбоксим 8,0 10-6 ± 0,2 2,5 х 10-6 ± 0,1 3,2 аллостерически неконкурентный
2460
ропин в дозе 10 мг/кг практически не эффективен — ИГЗ < 1. Эффективность карбоксима не велика. Его ИГЗ больше 1 всего на 1/3. В случае использования комплекса атропин + карбоксим, взятых в неэффективных, попросту недействующих, дозах, при профилактике отравлений установлены ИЗ в 6—11 раз превосходящий эффективность того и другого вещества, взятых в 2—3 раза больших дозах по отдельности. Более того, несмотря на существенное увеличение наклона кривой, ИГЗ комплекса при профилактике в 3,2 раза превосходит ИГЗ атропина и в 1,5 карбоксима.
Результаты оценки анти-ХЭ активности карбок-сима в сравнении с типичными обратимыми ингибиторами разного типа взаимодействия с ферментом приведены в табл.3.
Сходство с оксазилом послужило основанием определения влияния карбоксима на фосфорилирова-ние ХЭ фосфаколом. Карбоксим вводили в инкубационную смесь за 15 мин до фосфакола и через 30 мин определяли величину К2 . Результаты оценки
влияния карбоксима на фосфорилирование приведены в табл. 4
Аллостерический защитный эффект карбоксима, таким образом, не вызывает сомнений. Долю участия конкурентной защиты фермента при данной постановке опытов уточнить не представлялось возможным.
В целом можно заключить, что приведенные материалы являются достаточным основанием, для рекомендации применения карбоксима не только как средства лечения, но и как средства профилактики отравлений ФОС. Испытанный на мышах комплекс атропин + карбоксим является моделью для создания более эффективного лечебно-профилактического антидота ФОС, который необходим для оказании помощи при массовых поражений высокотоксичными ФОС.
В опытах in vivo определяли снижение активности холинэстеразы крови мышей после введения раздельно армина и карбоксима и их последовательного введения в разное время. Эффект оценивали путем
Таблица 4
Константы ингибирования фосфакола при взаимодействием с ацетилхолинэстеразой без карбоксима (контроль — К20), в опытах после воздействия карбоксима (К2') и их относительное изменение к контролю
Концентрации карбоксима в молях Фосфакол
2¡(106 х -1 х -1) 20 / 2Í
0 (контроль) 2,8 -
1 X 10-5 1,2 1,3
2 х 10-5 0,8 3,5
5 х 10-5 0,5 5,6
Таблица 5
Снижение активности ХЭ крови мышей в %. Карбоксим вводили мышам внутримышечно в дозе 20 мг/кг, армин — подкожно в дозе DL50. Активность фермента определяли через 15 мин после введения карбоксима (контроль) и через 60 мин после введения армина (контроль и опыт). (М ± т; п = 6—7)
Вещество Время введения карбоксима
15 после армина
15 45
( ) 11,3 ± 3,1 - -
( ) 72,3 ± 1,9 70,9 ± 5,3 70,6 ± 7,1
+ 29,5 ± 3,3 46,1 ± 9,9 48,8 ± 3,2
Примечание: карбоксим вводили мышам внутримышечно в дозе 20 мг/кг, армин — подкожно в дозе DL50. Активность фермента определяли через 15 мин после введения карбоксима (контроль) и через 60 мин
Таблица 6
Снижение активности холинэстеразы крови мышей в % к контролю при раздельном и последовательном введении карбоксима (20 мг/кг в/м) и хлорофоса (п/к в дозе DLвв). М ± т, п = 5)
Вещества Время введения карбоксима ,
15 30 60
Карбоксим - 7,2 ± 6,3 10,1 ± 2,8 11,5 ± 4,2
Хлорофос - 79,3 ± 2,8 82,6 ± 9,4 89,4 ± 8,1
+ + 60 51,3 ± 16,6 59,4 ± 12,1 60,1 ± 9,7
+ + 30 20,6 ± 7,3 31,5 ± 7,8 30,7 ± 10,8
+ + одновременно 10,1 ± 2,8 10,1 ± 2,8 10,1 ± 2,8
+ + 15 10,1 ± 2,8 10,1 ± 2,8 10,1 ± 2,8
2461
сравнения с контролем (в процентах). Результаты приведены в табл. 5
Согласно данным таблицы во всех случаях опыт абсолютно достоверно отличен от контроля. Экстренная (за 15 мин) профилактика достоверно эффективней лечения. Возможно, что в первом случае имеет значение не только защита ХЭ, но и феномен реактивации, значимость которого очевидна при последующем введении карбоксима.
Аналогичные опыты выполнены с использование вместо армина типичного инсектицида хлорофоса. Результаты приведены в табл. 6.
Как следует из полученных результатов, эффект карбоксима абсолютно достоверен при введении за 30 минут, одновременно и через 15 мин. Одновременное и лечебное применение активней ранней (за 30 мин) профилактики. Профилактика и лечение отравлений хлорофосом эффективней, чем отравление армином.
Выявляются еще некоторые особенности: лечебное применение эффективней, чем профилактическое. Однако это может быть связано с тем, что в данном случае использована хотя и ранняя (за 30 мин), но не экстренная профилактика (за 15 мин) как в опытах с армином. Очевидно, что время профилактики имеет очень существенно значение. Способность реактиваторов ХЭ потенцировать эффект хо-линоблокаторов, в частности атропина, была неоднократно показана ранее. Однако во всех случаях, как атропин, так и реактиваторы ХЭ, были использованы в дозах, при использовании которых они были эффективны при раздельном введении, и дозы
эти были близки к токсическим. В опытах В.Б. Прозоровского [6] при профилактике отравления фос-факолом атропин в дозе 1/8 ЛД50 (ИЗ = 3,в) в сочетании с токсогонином в такой же дозе (ИЗ = 10 0) при совместном применении обеспечивали типичное потенцирование — ИЗ = 30. В данной работе оба препарата в не эффективных дозах обеспечивают такой же защитный эффект — феномен сверхпотенцирования типичный для аллостерического взаимодействия.
ВЫВОДЫ
1. Атропин и карбоксим в рекомендованных для мышей дозах (10 и 15 мг/кг в/б) относительно мало эффективны как средства профилактики отравления мышей фосфаколом — ИЗ равны 2,6 и 4,7 и не обеспечивают гарантированной профилактики во всем диапазоне доз фосфакола: ИГЗ равны соответственно 0,6 и 1,3.
2. Комплекс атропин + карбоксим в неэффективных дозах (5 + 5 мг/кг) при профилактическом введении обеспечивают при отравлении мышей фосфаколом ИЗ = 28,2 и ИГЗ = 1,9, а при лечебном — ИЗ = 24, 9 и ИГЗ — 1,7.
3. В опытах in vitro карбоксим тормозит активность очищенной ацетилхолинэстеразы на 50 % в концентрации 2,5 х 10-6М, являясь ее преимущественно неконкурентным ингибитором. Именно это свойство обеспечивает проявление защитного эффекта карбоксима в дозе 1/100 от ЛД50, что отличает
2462
его от прочих реактиваторов и обратимых ингибиторов ХЭ.
ЛИТЕРАТУРА
1. Глухан Е.Н., Сметанин А.В., Казаков П.В. и др. Вероятностная оценка риска как показатель экологической безопасности на примере объекта по уничтожению химического оружия.. // Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева. 2007. Т. 51, № 2. С. 52-54.
2. Куценко С.А., Прозоровский В.Б., Федонюк В.П., Пути создания эффективны средств профилактики и неотложной терапии поражений фосфорорга-ническими отравляющими веществами при авариях на объектах по хранению и уничтожению химического оружия. // Рос. хим. ж. (Ж. хим. об-ва им. Д.И. Менделева. 1994. Т. 38, № 2. С. 90-93
3. Петров А.Н., Софронов Г.А., Нечипоренко СП., Антидоты фосфорорганических отравляющих веществ. // Рос. хим. ж. (Ж. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева). 2004. Т. 48, № 2. С. 110-116.
4. Прозоровский В.Б. О выборе показателя выносливости при токсикологических исследованиях. // Фармакол. и токсикол. 1967. Т. 30, № 2. С. 240-243
5. Прозоровский В.Б. Донкопий В.Д., Суслова И.М. Взаимодействие обратимых ингибиторов с каталитическими центрами и аллостерическими участками холинэстераз. // Бюл. эксперим. биологии и мед. 1976. Т. 82, № 8. C. 553-556.
6. Прозоровский В.Б. Изучение взаимодействия атропина, токсогонина и фосфакола. // Фармакол. и токсикол. 1984. Т. 48, № 2. С. 33-37.
7. Прозоровский В.Б. Павлова Л.В. Суслова И.М. Фармакологическая характеристика нового анти-холинэстеразного средства аминостигмина. // Эксперим. и клин. фармакол. 1992. Т. 55, № 1. С.13-16.
8. Прозоровский В.Б. Табличный экспресс-метод определения эффективных мер воздействия на биологические объекты. // Токсикол. вестн. 1998. № 1. С. 3.
9. Прозоровский В.Б. Индекс гарантированной за-
щиты — новый показатель эфективности антидотов. // Токсикол. вестн. 1999. № 4. С. 10-13.
10. Прозоровский В.Б. Лечебно-профилактический антидот ФОВ.. // Актуальные вопросы профилактики и терапии интоксикаций. (Научн. тр. / Научн.-практ. мед. центр «Нейрон» и НИИЦ (МБЗ) ГосНИИИ военной мед). СПб.: Астрон, 2005. С/Мб .
11. Тонкопий В.Д., Саватеев Н.В., Бресткин А.П. Об определении активности холинэстераз в тканях животных после воздействия обратимых ингибиторов. // Докл. АН СССР. 1972. Т. 207, № 3. C. 736-738
12. Eyer P. The role of oximes in the management of organophosphorus pesticide poisoning. // Toxicol. Rev. 2003. Vol. 22, N 3. P. 165-90.
13. Nechiporenko S.P., Zatsepin E.P. A Study to establish an efficient means for delivering antidotal therapy at nerve agent destruction facillies. // J. Toxicol. Clin. Toxicol. 2003. Vol. 41, № 5. P. 723.
14. Newmark J. Therapy for nerve agent poisoning. // Arch. Neurol. 2004. Vol. 61, N 5. P. 649-52.
15. Okudera H. Clinical features on nerve gas terrorism in Matsumoto. // J. Clin. Neurosci. 2002. Vol. 9, N 1. P. 17-21.
16. Wiener S.W., Hoffman R.S. Nerve agents: a comprehensive review. // J. Intensive Care Med. 2004. Vol. 19, N 1. P. 22-37.
Prozorovskii VB, Skopichev VG, Panchenkova OA. The Evaluation of Reactivator of Acetylcholine Esterase Carboxim as a Drug for Prevention from Poisoning with Phosphororganic Inhibitors of Acetylcholine Esterase.
Psychopharmacol Biol Narcol. 2008; 8(3-4): 2457-2462
St. Petersburg State Academy of Veterinary Medicine, St. Petersburg 198904.
SUMMARY: Carboxim possesses the properties of inreversible-reversible inhibitor of acetylcholine esterase, reducing the velocity of phosphorilation for the enzyme and defending it from inreversible inactivation. Carboxim in use with atropine (in subeffective doses 5 + 5 mg/kg) increases the defense from phosphororganic inhibitors of acetylcholine esterase in 6-11-fold when used as preventive (defense index equal 26.2) or curative (defense index equal 24.9) agent.
KEY WORDS: phosphororganic inhibitors of acetylcholine esterase; prevention from poisoning; carboxim; antidotes of phosphororganic inhibitors of acetylcholine esterase
Correspondence to: Valery B. Prozorovskii St. Petersburg, Russia e-mail: [email protected]
Epub 2009 Jan 25. In Russian © PPBN
http://www.psychopharmacology.ru/index.php/PPBN/article/view/987 http://www.elibrary.ru
