CC BY
198FOOD
УДК: 579.67; 579.64; 579.62
/ \ Микробиологическая безопасность меда
Кущ Ирина Вячеславовна
ФГБОУ ВО «Московский государственный университет пищевых производств»
Адрес: 125080, Москва, Волоколамское шоссе, дом 11
E-mail: [email protected]
Ваннер Наталья Эдуардовна
Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии — филиал ФГБНУ ФНЦВИЭВ РАН Адрес: 123022, город Москва, Звенигородское ш., дом 5 E-mail: [email protected]
Удавлиев Дамир Исмаилович
ФГБОУ ВО «Московский государственный университет пищевых производств»
Адрес: 125080, Москва, Волоколамское шоссе, дом 11 E-mail: [email protected]
Мурадова Мая Дурдымурадовна
Туркменский сельскохозяйственный университет имени С. А. Ниязова Адрес: 744000, город Ашхабад, ул. Гёроглы, дом 62, Туркменистан
E-mail: [email protected]
Проведено микробиологическое исследование пчелиного меда реализуемого на рынках Москвы в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (бактерии рода Salmonella, Shigella, общая микробная обсемененность (КМАФАнМ), бактерии группы кишечной палочки (БГКП), плесневых грибов, осмофильных дрожжей, S. aureus). Дополнительно были проведены органолептические (внешний вид, аромат, вкус) и физико-химические (определение массовой доли сахарозы, фруктозы и глюкозы, гидрокси-метилфурфураля, кислотности, электропроводность и т.д.) исследования для исключения фальсификации продукта. Микробиологические, органолептические и физико-химические исследования проводились в испытательной лаборатории соответствующей требованиям ГОСТ ISO/EC 17025-2019. Исследованию были представлены 221 образец меда, отобранные с 13 рынков Москвы на наличие патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. По результатам исследований в 37 образцах (16,7 %) были обнаружены Escherichia coli, в 18 образцах (8 %) - бактерии группы кишечной палочки (БГКП), 53 образцах (23,9 %) - S.aureus, КМАФАнМ - 25 (11,3 %), осмофильные дрожжи - 3 (1,3 %), несоответствие по физико-химическим показателям обнаружено в 45 (20,3 %) образцах. Рассмотрены российские и международные требования к микробиологической безопасности меда в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Проведен анализ и сравнительная характеристика показателей и их значений.
Ключевые слова: мед, микробиологическая безопасность, международные требования, патогенные, условно-патогенные микроорганизмы
Введение
Мёд - продукт пчеловодства растительного происхождения, содержащий значительное количество полезных веществ для организма человека (углеводы, витамины, аминокислоты, минеральные вещества и прочее). При этом мёд обладает отличными вкусовыми, питательными и диетическими
свойствами, что делает данный продукт востребованным на внутреннем и внешнем продовольственном рынке многих стран мира. Пчелиный мед является одним из важных продуктов питания, а также играет большую роль в выполнении программы Доктрины продовольственной безопасности Российской Федерации, положения которой определяются тем, что пчёлы играют активную роль как опылители сельскохозяйственных куль____/
_ Как цитировать _
Кущ, И. В. , Ваннер, Н. Э., Удавлиев, Д. И., & Мурадова, М. Д. (2019). Микробиологическая безопасность меда. Health, Food & Biotechnology, 1(3). https://doi.org/10.36107/hfb.2019.i3.s267
Материал опубликован в соответствии с международной . „ ,
лицензией Creative Commons Attribution 4.0. 106
тур. Кроме того, пчеловодство дает ценные продукты питания и сырье. Продукты пчеловодства: мёд, перга (пыльца), маточное молочко, прополис, пчелиный яд, используются как диетические и лечебные средства, а воск находит применение более чем в 40 отраслях промышленности. Поэтому здоровью пчёл и ветеринарно-санитарной экспертизе мёда пчелиного и других продуктов пчеловодства придается в нашей стране особое внимание (Бутко, 2019). В Российской Федерации (РФ) к натуральному меду ветеринарно-санитарные требования установлены в Техническом Регламенте Таможенного союза (ТР ТС) 021/2011 «О безопасности пищевой продукции», решение Комиссии Таможенного союза от 28 мая 2010 г. N 299 «О применении санитарных мер в Евразийском экономическом союзе», решении Комиссии Таможенного Союза от 18.06.2010 N 317 «О применении ветеринарно-санитарных мер в Евразийском экономическом союзе» и ГОСТ 19792-2017 (замена ГОСТ Р 54644-2011). В перечисленных законодательных документах натуральный мёд исследуют на органолептические (внешний вид, аромат, вкус), физико-химические показатели (определение массовой доли сахарозы, фруктозы и глюкозы, гидроксиметилфурфураля, кислотности, электропроводность и т.д.), присутствие лекарственных препаратов, пестицидов, тяжелых металлов, радио-нуклеидов, а информация по определению микробиологической загрязненности мёда и других продуктах пчеловодства отсутствует.
Возможно, причина в том, что существует мнение, что мед — безопасный продукт и в нем не могут присутствовать патогенные и условно-патогенные микроорганизмы, дрожжи и плесени, из-за концентрированного раствора сахаров с высоким осмотическим давлением. Натуральный мед не подвергается термической обработке и употребляется в пищу в сыром виде, что увеличивает возможность присутствия в нем микробиологических патогенных агентов и их продуктов распада, как и в любом другом сырье растительного или животного происхождения. Так, первичными источниками контаминации мёда могут являются пыльца, пищеварительный тракт медоносных пчел, почва, вода, воздух и нектар; вторичные - связаны с переработкой, обработкой, тарой и хранением мёда и продуктов пчеловодства.
Данная работа посвящена изучению патогенных и условно-патогенных микроорганизмов в меде для дальнейшего изучениях их. Полученные данные позволят нам в будущем минимизировать обсеменение продукта, если таковое имеется, а также узнать о санитарно-гигиенических нарушениях при работе с медом.
В исследованиях проведенными зарубежными учёными было установлено, что в пчелином меде способны выживать патогенные и условно-патогенные микроорганизмы, которые не обладают репродуктивной способностью. Несмотря на временное приостановление репродуктивной функции - микроорганизмы могут быть опасны для потребителей, в особенности людей с ослабленным иммунитетом, детей и пожилых людей (Fernández, 2016).
Осмофильные дрожжи и плесневые грибы сохраняют свою способность размножению (вегетативное размножение). Рост плесневых грибов сопровождается выработкой микотоксинов являющимися вторичными метаболитами нитевидных грибов и токсичны для человека и животных. Основными продуцентами микотоксинов являются грибы рода Aspergillus, Alternaria, Fusarium и Penicillium. Наиболее часто встречаются Aspergillus spp. и Penicillium spp., исследования на эту тему проводили в Великобритании, Италии, Бразилии и Пакистане (Silva,
2017). Несмотря на то, что мед является неблагоприятной средой для развития микотоксинов, плесневые грибы все же могут вызывать аллергические реакции, ослабление иммунитета и астму. Наиболее опасным патогенном являются Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus terreus и Aspergillus niger (Liu, 2019). В меде из дрожжей выявляли Debaryomyces hansenii, Zygosaccharomyces rouxii, Aureobasidium pullulans, Schizosaccharomyces plombe, Kluyveromyces thermotolerans, Saccharomyces cerevisiae и Cryptococcus uzbekistanensis (Hocine,
2018). Однако патогенным для человека является вид Cryptococcus и способны вызывать поражение центральной нервной системы (Gomes, 2010).
В Мексике, как и в России мед является одним из популярных продуктов, однако для Мексики мед еще является ключевым экономическим элементом обеспечивающим ей пятое место в мире, как стране-производителю и третье, как стране-экспортеру. В Мексике разработан один стандарт NMX-036-N0RMEX-2006, обеспечивающий микробиологическую безопасность меда. Согласно данному стандарту в меде не должны присутствовать более чем в 1000 КОЕ/г условно-патогенных микроорганизмов, в том числе осмофильных дрожжей и плесневых грибов в 100 КОЕ/г (Vázquez-Ouinones, 2017).
Мексика не единственная страна разработавшая документ, который обеспечивает микробиологическую безопасность меда. Аналогичные документы обеспечивающие микробиологическую безопасность меда разработали в Китайской Народной Республике, в арабских странах Персидского залива и в Гонконге.
В Китайской Народной Республике действует стандарт (GB 14963—2011) «Государственный стандарт безопасности продуктов питания. Мед», представлены данные с предельным содержанием микроорганизмов. Согласно данному документу в 25 граммах меда не должны быть выявлены бактерии рода Salmonella, Shigella и St. aureus, количество плесневых грибов и осмофильных дрожжей не более 200 колониеобразующих единиц в грамме (Ш-E/г), бактерий группы кишечной палочки (БГКП) - 103, а общее количество колоний (КМАФАнМ) не превышать 1000 КOE/г.
В арабских государствах Персидского залива существует единый стандарт GSO 160/2015 на «Микробиологические критерии для пищевых продуктов», в котором утверждены нормативные показатели для натурального мёда и других продуктов пчеловодства. Исследования проводят на обнаружение Clostridium botulinum, наличие которых не допускается; определение содержания в продукте суль-фит-редуцирующих анаэробных бактерий, плесневых грибов и дрожжей - не превышать 1000 КOE/г.
В Гонконге существуют микробиологические рекомендации для пищевых продуктов (от 2014 г), в котором мёд исследуется на наличие бактерий рода Salmonella, Shigella и St. aureus и не должен быть выявлен в 25 граммах продукта.
Mercado Común del Sur (MERCOSUR) - экономическое и политическое соглашение созданное в 1985 году между Аргентиной и Бразилией, впоследствии присоединившимися к ним Уругваем и Парагваем устанавливает требования к качеству пчелиного меда, в том числе и микробиологическое. Согласно требованиям соглашения (SENASA33 резолюция 870/2006) в меде не должны присутствовать бактерии рода Salmonella, Shigella, бактерии группы кишечной палочки, дрожжи и плесневые грибы не более 100 ЮБ/г. ( Fernández, 2016).
Помимо того что Бразилия входит в соглашение между Аргентиной, Парагваем и Уругваем внутри страны утверждена внутренняя инструкция №62 от 23 августа 2003 года согласно которой натуральный мед исследуют на наличие St. aureus, бактерии рода Salmonella, плесневые грибы и дрожжи (Azonwade, 2018).
В Мексике было проведено 1920 исследований меда на наличие патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, в том числе дрожжей и плесеней. Из общего количества образцов было выде-
лено: факультативно аэробных микроорганизмов 17 % (327), плесневых грибов дрожжей 18,1 % (348), 2 % содержали молочно-кислые бактерии, S. aureus менее чем 100 КOE/г, бактерии рода Salmonella не обнаружены. Из аэробов и факультативных анаэробов выделяли такие микроорганизмы, как: Brochothrix spp., Citrobacter spp., Enterobacter spp., Erwinia spp., Flavobacterium spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp (Vázquez-Quiñones, 2018).
В Турции в 2013 году провели крупное исследование на микробиологическую безопасность, в результате которого исследованию подверглись 500 образцов меда из Стамбула. Помимо микробиологического обсеменения образцов было также обнаружено и паразитологическое загрязнение: в 80 образцах (16 %) были обнаружены Escherichia coli, в 18 образцах (3,6 %) - бактерии группы кишечной палочки (БГКП), 67 образцах (13,4 %) - Золотистый стафилококк (S. aureus), 51 образец (10,2 %) дал положительный результат на Ascosphaera apis, 22 образца (4,4 %) - Aspergillus flavus, 32 образца (6,4 %) - Aspergillus fumigatus, 16 образцов (3,2 %) -Paenibacillus larvae, 29 образцов (5,8 %) Melissococcus pluton и 39 образцов (7,8 %) - Nosema spp. (Emek DÜMEN1, 2013).
Исследования проведенные в Мексике и Турции подтверждают присутствие патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, однако результаты исследований могут быть не верны, если предмет исследования оказался не натуральным продуктом. В России мёд входит в десятку фальсифицированных продуктов. В связи с чем отобранные образцы в первую очередь исследовались на органолептические (вкус, цвет, аромат, консистенция и кристаллизация) и физико-химические (определение массовой доли сахарозы, фруктозы и глюкозы, гидроксиметилфурфураля, кислотности, электропроводность и так далее) показатели для избежания фальсификации продукта и искажении результатов исследования1.
Следует отметить, что мед имеет большие преимущества по сравнению с другими продуктами питания, так как он считается ценнейшим лечебно-профилактическим средством. (Жунева, 2019). Например, Нидерландах изучалась общее антимикробное свойство меда в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов в организме человека, с поиском новых способов их применения (Kwakman, 2012). Аналогичное исследование проводили в США и Австралии, где сравнивали разные сорта меда и их антибактериальное дей-
1 https://basetop.ru/ Топ рейтинги мира «Самые подделываемые продукты питания в России» (2019)
ствие на патогенные и условно-патогенные микроорганизмы (Campeau, 2014; Anand, 2019).
В Словакии продолжили опыты по определению действующего антимикробноего вещества в меде (Bucekova, 2018). Группа ученых из Португалии изучала антимикробное воздействие на кишечную палочку при лечении кожных ран, и добились успеха в данном вопросе (Oliveira, 2017). Наши коллеги из Эфиопии проводили опыты с 2017 года, в которых доказывали бактерицидное воздействие меда на Staphylococcus aureus (Mama, 2019). В Саудовской Аравии оценивали бактерицидные свойства импортного и отечественного меда в отношении Staphylococcus aureus (Almasaudi, 2017).
Из небольшого обзора видно, что интерес к меду возрастает с каждым годом. Связи с чем необходимо определять не только качественный продукт по физико-химическим показательно, но также и по микробиологическим.
Материалы и методы
Лабораторные исследования проводились в испытательной лаборатории, которая соответствует международным требованиям ГОСТ ISO/EC 170252019.
Первым этапом работы - это проведение органо-лептических и физико-химических исследований. Исследования проводились согласно ГОСТ 197922017 «Мед натуральный. Технические условия».
В России нет нормативного документа регулирующего микробиологическую безопасность меда, связи с чем в нашей работе проводился подбор питательных сред и методов для анализа. Пчелиный мед исследовался на такие показатели как КМАФАнМ, БГКП, E.coli, S.aureus, бактерии рода Salmonella, Shigella, осмофильные дрожжи и плесени.
Первые три месяца исследования были посвящены поискам оптимальных методов, сред и температур. Сложности в исследовани наступили на этапе титрования и определениях степени исследования, например при исследовании на микробиологическую чистоту, БГКП или S.aureus имеет большое значение.
Вставал вопрос каким раствором титровать. Для решения этой проблемы мы использовали четыре раствора: физиологический, лимоннокислый, бро-
мистый и пептонную воду. Каждый из растворов титровался и из каждого разведения параллельно в две чашки вливалось разведение и так до 6 степени, после чего заливались питательной средой.
Определние КМАФАнМ
Для определения общей микробной обсемененности мы титровали продукт затем его заливали питательной средой. Однако в нашем распоряжении было два вида среды - это МПА (мясо-пептонный агар) и КМАФАнМ-среда. Связи с чем опыты проводимые с поиском оптимального раствора для титрования мы удваивали, чтоб в параллели наблюдать рост микроорганизмов на двух средах. После того как мы залили чашки Петри с разведениями питательной средой мы медленно и равномерно перемешиваем их круговыми движениями. После застывания среды чашки вверх дном помещали в термостат. Инкубирование микроорганизмов происходило 72 часа при температуре (30±1°C).
Определение БГКП и Escherichia coli
В нашем распоряжении имелось только обогатительная среда Кесслера для изучения БГКП, но в данном случае все было не так однозначно. Необходимо было правильно подобрать концентрацию и объем среды. Например, если мы исследуем молочные продукты, то используем среду Кесслера обычной концентрации, но при этом 5 мл, если же мы говорим о колбасных изделиях, то используем Кесслер нормальной концентрации объемом 10 мл, если же это мясной продукт или овощи, то мы используем Кесслера нормальной концентрации в объёме 10 мл. Помимо определения необходимой концентрации и объема существовала еще одна важная проблема - в каком разведении должен быть образец. Для определения необходимой концентрации нужно было убедиться в присутствии БГКП, поэтому первые образцы сеялись с флакона с раствором из физиологического, лимоннокислого, бромистого и пептонной воды в пробирку с обычной концентрацией 10 мл и 5 мл, двойной концентрацией (10 мл). Инкубирование образцов составляло 48 часов при температуре (37±1 °C ). После чего делались пересевы на дифференциально-диагностическую среду ЭНДО - инкубирование микроорганизмов составляло 24-48 часов при температуре (37±1 °C). Далее при необходимости следовали биохимические тесты для подтверждения микроорганизмов к бактериям группы кишечной палочки, в том числе и E.coli.
Определение S.aureus
Исследование на наличие S.aureus вызвало аналогичные сложности. Изначально подбирали подходящий раствор для титрования и питательные среды. Предположительное присутствие коагула-зоположительных стафилококков определяли на Жиолитти-Кантони бульоне и солевом бульоне -мы добавляли по 1 мл титрованного раствора с образцом в пробирку, после чего инкубировали при температуре (37±1 °C) в течение 48 часов. Затем пересев петлей на поверхность одной из дифференциальных сред: среды Байрд - Паркер, молоч-но-солевого агар. Инкубирование при температуре (37±1 °C) в течение 24-48 ч. Посевы проводили также из пробирок, в которых нет видимых признаков роста. После чего пересев на скошенный МПБ, инкубирование при температуре (37±1 °C) 24 ч и проведение биохимических тестов для подтверждения выросших микроорганизмов к S. aureus. Далее шел пересев на дифференциально-диагностические среды такие как Брайд Паркер агар и молочно-со-левом агар.
Определение бактерий рода Salmonella
Исследование на присутствие бактерий рода Salmonella проводить было проще, мы использовали ГОСТ 31659-2012 (ISO 6579:2002) Методы выявления бактерий рода Salmonella spp. стандарт, данный стандарт не рассчитан для исследования меда, но все же мы решили рискнуть. Исследование происходило согласно выше перечисленному ГОСТу, 25 грамм образца мы добавили в забуферную пептон-ную воду (ЗПВ) (225 мл) инкубировали 18-20 часов при температуре 37 °C. После инкубирования по 1 мл мы добавляли на Бульон РАППАПОРТА-ВАССИ-ЛИАДИСА (далее RVS-бульон) и бульона Мюллера-Кауфмана (МК-бульон). RVS-бульон инкубировали при 41.5 градусах, а МК при 37 в течение 24 ч, затем шел пересев на чашки Петри со средами: Rambach - агар, агар с бриллиантовым зеленым, XLD-агар, и Эндо.
Определение бактерий рода Shigella
При выявлении бактерий рода Shigella мы опирались на ГОСТ 32010-2013 Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Shigella. Так как бактерии рода Shigella близки к бактериям рода Salmonella и Escherichia coli (E.coli), то исследование было схожим с выявлением бактерий рода Salmonella, единственным различием было, то что для вторичного обогащения культуры мы не использовали RVS-бульон и MK-бульон, а просто изменили температуру обогащения культуры с комнатной
(22 °C) на 37 °C и продолжили инкубирование еще 24 ч. Для индентификации использовались аналогичные среды, что и для бактерий рода Salmonella (Rambach - агар, агар с бриллиантовым зеленым, XLD-агар, и Эндо).
Определение осмофильных дрожжей и плесневых грибов
Исследование на осмофильные дрожжи и плесени было чем-то схоже с исследованием на КМАФАнМ, титровали пробы до 102 и заливались агаром с дихлораном, бенгальским розовым и хлорамфени-колом (DRBC). Образцы помещали в специальный пакет для предотвращения контаминации и обсеменения термостата и ламинарного бокса спорами грибов, затем убирали в термостат на 5 суток. После чего считывали результат.
Оборудование
В данной работе использовалось проверенное и аттестованное оборудование, которое проходит все необходимые проверки в соответствии с графиком технического обслуживания.
Первичные и вторичные посевы, а также окраска по Грамму осуществлялись в боксе микробиологической безопасности БМБ-11-»Ламинар-С»-1,5 (год выпуска 2017 г., страна производитель Россия). Взвешивали образцы на весах BP2100S Sartorius (2008 года, производитель Германия) с максимальной массой 2000г. Для исследования мазков использовался микроскоп медицинский Микмед-6 (2008 г, производство Россия).
Для инкубирования микроорганизмов использовались разные термостаты, т.к. температурные режимы у них разные. Для исследования на БГКП, S.aures, бактерии рода Salmonella, Shigella использовали термостат термостат электрический сухо-воздушный ТС-200 СПУ (2016г, производство Россия) с температурой в 37 °C. Для исследования на КМАФАнМ использовали Сушильный шкаф Binder с естественной конвекцией ED 115 (производство Германия, 2008г.) температурный режим 30 ± 1 °C. Для исследования на осмофильные дрожжи и плесневые грибы мы использовали отдельный термостат для предотвращения заражения оборудования Термостат с охлаждением Binder КВ 53 (производство Германия, год ввода в эксплуатацию 2008). Для исследования на осмофильные дрожжи и плесени использовали Ламинарный бокс II класса защиты АС2-4Е1 (2008г, производство Сингапур).
Питательные среды хранились в холодильнике
фармацевтическом Sanyo MPR-331 D (2008 г, производство Япония) при температуре от 4 до 8 °C. Питательные среды топились на водяной бане (без перемешивания) SUB Agua PRO, тип SAP 18 (2017г, производство Англия). Чашки Петри с селективной средой разогревались в термостате Binder с естественной конвекцией BD-53 (2008 г, производство Германия) при 37 °C в течение 20 минут.
После окончания исследовательской работы все оборудование обрабатывалось 70 % этиловым спиртом, все помещение обеззараживалось рецир-кулятором УФ-бактерицидным двухламповым с принудительной циркуляцией воздушного потока РБ-07-Я-ФП (2008г, производство Россия) в течение 60 минут.
Результаты исследований
Основной целью нашего исследования было определить микробиологическую чистоту меда на примере меда, реализуемых на московских рынках. Исследованию подверглись 221 образец, упакованный в различные упаковки.
Первым этапом работ было определение натурального меда, соответствующего требованиям ГОСТ 19792-2017 (Мед натуральный. Технические условия). Проведенные нами физико-химические и органолептические исследования позволили нам исключить фальсифицированный продукт. И, как следствие, искажение результатов. Итого, из 221 образца меда не соответствовали физико-химическим показателям 45 проб, что составляет 20,3 % от общего числа. Согласно результатам исследования 176 образцов меда соответствуют ГОСТ 19792-2017 по физико-химическим и органолептическим показателям и считаются натуральным медом.
Вторым этапом работ являлось определение микроорганизмов в натуральном меде. Общая микробная загрязненность меда присутствовала в 75 пробах, однако 45 проб являются не натуральным медом. Так как микробная чистота это особый показатель указывающий на загрязнение продукта, на несоответствующие условия хранения, на транспортировку и отбор проб.
Бактерии группы кишечной палочки присутствуют в 18 образцах, что от общего количества меда составило 8 %. Так как мед разделился на натуральный и фальсифицированный, то результаты немного изменились, в натуральном меде количество положительных образцов 13, что составляет от общего количества пчелиного меда 7,4 %.
Escherichia coli присутствовала в 37 отобранных образцах (16,7 %). В пчелином меде положительных проб 29, что процентном соотношении составляет 16,4 %.
В исследованиях на выявление S.aureus получен положительный результат у 53 образцов, что составляет 29,3 % от общего количества проб. Однако согласно результатам исследованиям из 53 общих положительных образцов на натуральней мед пришлось 47 проб со S.aureus, что составило 26,7 % от общего количества проб пчелиного меда.
Положительных образцов не выявлено при исследовании на наличие бактерий рода Salmonella и Shigella.
Обсуждение результатов
В своих опытах мы не стали отбраковывать фальсифицированный мед и подвергли его микробиологическому анализу. Как итог, были выявлены образцы загрязненные условно-патогенными микроорганизмами. Результаты исследований натурального и фальсифицированного меда схожи по микробиологическим параметрам, что может служить подтверждением неправильного хранения, транспортировки, отбора меда (Sereia, 2017).
Проводя свои опыты, мы сталкивались с некоторыми трудностями, начиная от выбора среды для титрования и заканчивая температурными и временными диапазонами. Данное обстоятельно значительно прибавило времени для исследования.
Для титрования нам подошли два раствора - физиологический и пептанная вода, при использовании которых в дальнейшем шел рост микроорганизмов. Титровали мы преимущественно до разведения 103, в некоторых случаях до 106. Редкими случаями нашего раститровывания образцов являлись выявления положительных проб, но как показала практика, в этом нет необходимости, т.к. рост колоний ограничивался в разведениях 103. Для исследования на общую микробную обсемененность мы использовали 2 среды МПА (мясо-пептонный агар) и КМАФАнМ. Обе среды показали отличный результат. Рост колоний присутствовал на чашках со средой КМАФАнМ и МПА с флакона(10!) с разведения 102 и 103. Однако на среде МПА наблюдался рост плесеней, идентификацию которых мы не проводили, т.к. это не было основной целью исследования. Также сказалась ограниченность ресурсов для данного исследования. Следует отметить, что рост осмофильных дрожжей и плесневых грибов ожи-
дается на элективных средах с содержанием медового агара-70 % 2.
При исследовании на БГКП и E.coli наиболее удачным была среда Кесслер обычной концентрации 10 мл. Для исследования мы использовали разный объем и концентрацию среды Кесслера (5 мл обычной концентрации, 10 мл двойной концентрации и 10 мл обычной концентрации). Помутнение столбика и газообразование наблюдалась в концентрациях: 0.1, 0.01 и 0.001 г. Пересев на чашку Петри с дифференциально-диагностической питательной средой Эндо. На среде Эндо E.coli образуют колонии от бледно-розового до темно-красного цвета часто с металлическим блеском, бактерии группы кишечной палочки на среде Эндо образуют типичные колонии колиформных бактерий от розового до красного цвета, часто с металлическим блеском. Проведены были биохимические тесты подтверждающие рост E.coli (окраска по Грамму - грамо-трицательные палочки; определение отсутствия оксидазы - оксидазоотрицательные; определение образования индола - образует индол; определение образования ацетоина - не образует ацетоин - реакция Фогес-Проскауэра отрицательная; определение утилизации цитрата - не утилизирует цитрат; определение образования сероводорода - не образует сероводород; определение интенсивности ферментации углеводов - интенсивно ферментирует углеводы; определение ферментации сорбита, глюкозы и лактозы - ферментирует) и бактерий группы кишечной палочки (окраска по Грамму - грамотрицательные палочки; определение отсутствия оксидазы - оксидазоотрицатель-ные; определение ферментации лактозы - ферментируют лактозу с образованием кислоты (цвет среды меняется) и газа).
Исследование на наличие S.aureus подтвердили их наличие. Рекомендованная нами среда для исследования - МПБ с 6 % NaCl. На дифференциально-диагностической среде Байрд-Паркер агар с кроличьей плазмой и бычьим фибриногеном S.aureus образуют черные или серые, или ровные белые мелкие колонии, окруженные зоной преципитации, указывающей на коагулазную активность, а на молочно-солевом агаре - колонии круглые, слегка возвышающиеся над поверхностью агара, с ровными краями, окрашены в желтый, золотистый, лимонно-жёлтый, кремовый, палевый или белый цвет. Также было проведено биохимическое подтверждение S. aureus (окраска по Грамму -грамположительные, имеют шарообразную форму, клетки диаметром 0,6-1,0 мкм, располагающиеся
чаще (но не всегда) в виде скоплений, напоминающих гроздья винограда; определение каталазы - каталазоположительные; образовывает ацетоина (реакция Фогес - Проскауера) - образует; ферментация мальтозы - ферментирует мальтозу в аэробных условиях с образованием кислоты (цвет среды Гисса меняется).
Исследования на осмофильные дрожжи и плесени были относительно удачными. Рост колоний наблюдался на чашках с флакона (101) с разведения 102 у трех образцов, что составило 1.3 % от общего числа проб.
При исследовании на бактерии рода Salmonella положительных образцов не обнаружено было. Причина может крыться в неподходящей методике, средах, либо в их выживаемости в меде. Исследования, проводимые Дальневосточным университетом утверждают, что бактерии рода Salmonella выживают в меде в течение 14 дней, подтвердить или опровергнуть этот факт мы не смогли (Сали-мов, 2008). Следует отметить, что данный вопрос не смогли решить наши зарубежные исследователи. Однако мед исследуют на наличие бактерий рода Salmonella и Shigella в Китайской Народной Республике, странах Персидского залива, Бразилии и Мексике. Предполагаем, что если ведется мониторинг этих бактерий, то и выживаемость и опасность для потребителя существует. В будущем стоит уделить особое внимание бактериям рода Salmonella и Shigella и протестировать зарубежные методики и среды.
Аналогичная ситуация была выявлена с бактериями рода Shigella. Положительных образцов меда не обнаружено. Возможно, причина кроется в том, что бактерии рода Salmonella и Shigella являются близкими родами, что может косвенно подтверждать непродолжительность выживаемости этих бактерий в меде. Хотя, бактерии рода Salmonella и Shigella также близки с E. coli, что может также опровергать нашу мысль, описанную ранее.
В будущем мы планируем заражать натуральный мед бактериями рода Salmonella и Shigella для определения выживаемости их, а также подтверждения или опровержения выдвинутых нами теорий.
Заключение
Проведенное нами исследование подтвердило присутствие патогенных и условно-патогенных
www.biologyguide.ru «Выделение чистой культуры дрожжевых грибов»
микроорганизмов в меде, указывает на проблемы связанные со сбором, транспортировкой и хранением продукта, а также нарушением санитарно-гигиенических требований.
Обнаруженные микроорганизмы также могут передаваться от медоносных пчел, что указывает на болезни и неблагополучные условия содержания пчел. (Gisder, 2018).
Стоит согласиться с тем, что в нашем вопросе не достаточно проработана практическая часть в отношении бактерий рода Salmonella и Shigella, однако теоретическая часть выполнена в полном объеме.
Что касаемо бактерий группы кишечной палочки, E.coli, S.auereus, осмофильных дрожжей и плесеней, здесь вопрос проработан в полной мере теоретически и практически, но в дальнейшем требуются дополнительные исследования по выживаемости этих микроорганизмов в меде при длительном хранении и температурных режимах.
Говоря о плесневых грибах и осмофильных дрожжах, то здесь вопрос проработан полной мере, но в будущем необходимы дополнительные исследования с расширением температурных режимов и добавлением питательных сред. Возможно, необходим будет подбор новой методики для более точного определения микроорганизмов.
В будущем необходимо провести исследования для составления соотношения между эпизоотической обстановкой в регионе и качеством меда. Так как мед может являться индикатором неблагополучной обстановки в регионе, в том числе и на пасеке.
Литература
Бутко, М. П., Герасимов, А. С., Посконная, Т. Ф., Смирнов, А. М., Клочко, Р. Т., & Попов, П.А. (2019). Требования по обеспечению безопасности и ветеринарно-санитарная экспертиза мёда пчелиного. Издательский дом «Научная библиотека». Жунева, Л. С., Семченко, М. В., & Асякина, Л. К. (2019). Анализ технологий получения сухого меда. Хранение и переработка сельхозсырья, 2, 8-23. https://doi.org/10.36107/spfp.2019.69 Салимов, Р. М. (2008). Выживаемость микроорганизмов в некоторых пищевых продуктах. Дальневосточный аграрный вестник, 4 (8), 25-27.
Al-Nahari, A. A. M., Almasaudi, S. B., Abd El-Ghany, E. S. M., Barbour, E., Al Jaouni, S. K., & Harakeh, S.(2015). Antimicrobial activities of Saudi honey against Pseudomonas aeruginosa. Saudi Journal of Biological Sciences, 22(5), 521-525. https://doi. org/10.1016/j.sjbs.2015.04.006 Al-Waili, N., Salom, K., Al-Ghamdi, A., & Ansari, M. J. (2012). Antibiotic, pesticide, and microbial contaminants of honey: human health hazards. The Scientific World Journal, 2012, 930849, https://doi. org/10.1100/2012/930849 Anand, S., Deighton, M., Livanos, G., Morrison, P.D., Pang, E. C. K., & Mantri, N. (2019) Antimicrobial activity of agastache honey and characterization of its bioactive compounds in comparison with important commercial honeys. Frontiers in Microbiology, 10(263), 1-16. https://doi.org/10.3389/ fmicb.2019.00263 Augustin, J.-C., & Carlier, V. (2006). Lessons from the organization of a proficiency testing program in food microbiology by interlaboratory comparison: analytical methods in use, impact of methods on bacterial counts and measurement uncertainty of bacterial counts. Food Microbiology, 23(1), 1-38. https://doi.org/10.1016Zj.fm.2005.01.010 Boncristiani, H., Li, J. L., Evans, J. D., Pettis, J. & Chen, Y. P. (2011). Scientific note on PCR inhibitors in the compound eyes of honey bees, Apis mellifera. Apidologie, 42, 457-460. https://doi.org/10.1007/ s13592-011-0009-9 Bulgasem, B. Y., Lani, M. N., Hassan, Z., Wan Yusoff, W. M., & Fnaish, S. G. (2016). Antifungal Activity of Lactic Acid Bacteria Strains Isolated From Natural Honey Against Pathogenic Candida Species. My-cobiology, 44(4), 302-309. https://doi.org/10.5941/ MYC0.2016.44.4.302 Campeau, M. E. M., & Patel, R. (2014). Antibiofilm activity of manuka honey in combination with antibiotics. Hindawi Publishing Corporation International Journal of Bacteriology, 2014, 795281. https:// doi.org/10.1155/2014/795281 Chien, H.-Y., Shih, A.-T., Yang, B.-S., & Hsiao, V. K. S. (2019). Fast honey classification using infrared spectrum and machine learning. Mathematical Biosciences and Engineering, 16(6), 6874-6891. https:// doi.org/10.3934/mbe.2019344 Fernández, L. A., Ghilardi, C., Hoffmann, B., Busso, C., & Gallez, L. M. (2017). Microbiological quality of honey from the pampas region (argentina) throughout the extraction process. Ryobiology, 49(1), 69-72. https://doi.org/10.10Wj.ram.2016.05.010 Gisder, S., & Genersch, E. (2015). Special issue: honey bee viruses. Viruses, 7(10), 5603-5608. https://doi. org/10.3390/v7102885 Gomes, S., Dias, L. G., Moreira, L. L., Rodrigues, P., &
Estevinho, L. (2010). Physicochemical, microbiological and antimicrobial properties of commercial honeys from portugal. Food and Chemical Toxicology, 48(2), 544-548. https://doi.org/10.10Wj. fct.2009.11.029 Hegazi, A. G., Al Guthami, F. M., Al Gethami, A. F. M., Allah, F. M. A., Saleh, A. A., Fouad, E. A. (2017) Potential antibacterial activity of some Saudi Arabia honey. Veterinary World, 10(2), 233-237. https://doi. org/10.14202/vetworld.2017.233-237 Johnston, M., McBride, M., Dahiya, D., Owusu-Apent-en, R., Nigam, P. S. (2018). Antibacterial activity of Manuka honey and its components: An overview. AIMS Microbiology, 4(4), 655-664. https://doi. org/10.3934/microbiol.2018.4.655 Kwakman, P. H. S., & Zaat, S. A. J. (2012). Antibacterial components of honey. International Union of Biochemistry and Molecular Biology, 64(1), 48-55. https://doi.org/10.1002/iub.578 Kwong, W. K., Mancenido, A. L. & Moran, N. A. (2017). Immune system stimulation by the native gut mi-crobiota of honey bees. Royal Society Open Science, 4(2),170003. https://doi.org/10.1098/rsos.170003 Liu, O., Lei, J., & Kadowaki, T. (2019). Gene disruption of honey bee trypanosomatid parasite, lotmaria passim, by CRISPR/Cas9 system. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 9(126), 1-12. https:// doi.org/10.3389/fcimb.2019.00126 Mama, M., Teshome, T., Detamo, J. (2019). Antibacterial activity of honey against methicil-lin-resistant staphylococcus aureus: a laboratory-based experimental study. International Journal of Microbiology, 2019, 7686130. https://doi. org/10.1155/2019/7686130 Matovic, K., Ciric, J., Kaljevic, V., Nedic, N., Jevtic, G., Vaskovic, N., & Baltic , M. Z.(2019). Physicochemical Parameters and Microbiological Status of Honey Produced in an Urban Environment in Serbia. Environmental Science and Pollution Research, 25(8), 14148-14157. https://doi.org/10.1007/s11356-018-1659-1
Oliveira, A., Ribeiro, H. G., Silva, A. C.,Silva, M. D., Sousa, J. C., Rodrigues, C. F.,Melo, L. D. R., Hen-riques, A. F., & Sillankorva, S. (2017). Synergis-tic Antimicrobial Interaction between Honey and Phage against Escherichia coli Biofilms. Frontiers in Microbiology, 8, 664-302. https://doi.org/10.3389/ fmicb.2017.02407 Pajor, M., Worobo, R., Milewski, S., & Szweda, P. (2018).
The antimicrobial potential of bacteria isolated from honey samples produced in the apiaries located in pomeranian voivodeship in northern poland. International Journal of Environmental Research and Public Health, 15(9), 2002. https://doi.org/10.3390/ ijerph15092002 Regan, T., Barnett, M. W., Laetsch, D. R., Bush, S. J., Wragg, D., Budge, G. E., Highet, F., Dainat, B., de Miranda, J. R., Watson, M., Blaxter, M., & Freeman, T. C(2018). Characterisation of the british honey bee metagenome. Nature Communications, 9(1), 1-13. https://doi.org/10.1038/s41467-018-07426-0 Ruiz-Argueso, T., & Rodriguez-Navarro, A. (1975). Microbiology of Ripening Honey. Applied Microbiology, 30(6), 893-896. https://doi.org/10.1128/ AEM.30.6.893-896.1975 Sereia, M. J., Alves, E. M., Toledo, V. A. A., Marchini, L. C., Faquinello, P., Sekine, E. S., & Wielewski, P. (2011). Microbial flora in organic honey samples of africanized honeybees from Paraná river islands. Food Science and Technology, 31(2), 462-466. https://doi. org/10.1590/S0101-20612011000200028 Sereia, M. J., Perdoncini, M. R. F. G., Mar^o, P. H., Parpi-nelli, R. S., De Lima, E. G., & Anjo, F. A. (2017). Techniques for the evaluation of microbiological quality in honey. in V. de A. A. de Toledo (Ed.), Honey Analysis (pp.233-258). https://doi.org/10.5772/67086 Silva, M. S., Rabadzhiev, Y., Eller, M. R., Iliev, I., Ivanova, I., & Santana, W. C. (2017). Microorganisms in Honey. In V. de A. A. de Toledo (Ed.), Honey Analysis (pp.233-258). https://doi.org/10.5772/67262 Tudor, L., Mitränescu, E., Gali§ A. M., Ilie, L. I., & Ceau^i, C. (2006). Microbiological and physico-chemical analysis of honey from southern romania. Electronic Journal of Environmental, Agricultural and Food Chemistry, 9(9), 1485-1494. Vázquez-Quiñones, C. R., Moreno-Terrazas, R., Natividad-Bonifacio, I., Quiñones-Ramírez, E. I., & Vázquez-Salinas, C. (2017). Microbiological Assessment of Honey in México. Revista Argentina de Microbiología, 50(1), 75-80. https://doi.org/10.10Wj. ram.2017.04.005 Vejnovic, B., Stevanovic, J., Schwarz, R. S., Schwarz R., Aleksic, N., Mirilovic, M., Jovanovic, N. M., Stani-mirovic, Z. (2018). Quantitative pcr assessment of lotmaria passim in apis mellifera colonies co-infected naturally with nosema ceranae. Journal of Invertebrate Pathology, 151, 76-81. https://doi. org/10.1016/j.jip.2017.11.003
BIOTECHNOLOGY
/ \
Microbiological Safety of Honey
Irina V. Kushch
Moscow State University of Food Production 11 Volokolamskoe highway, Moscow, 125080, Russian Federation
E-mail: [email protected]
Natalya E. Vanner
All-Russian Research Institute of Veterinary Sanitation, Hygiene and Ecology
- Branch of Federal State Budget Scientific Institution «Federal Scientific Center - K. I. Skryabin, Ya. R. Kovalenko All-Russian Research Institute of
Experimental Veterinary Medicine, Russian Academy of Sciences» 5 Zvenigorodskoe highway, Moscow, 123022, Russian Federation
E-mail: [email protected]
Damir I. Udavliev
Moscow State University of Food Production 11 Volokolamskoe highway, Moscow, 125080, Russian Federation
E-mail: [email protected]
Maya D. Muradova
Turkmen Agricultural University Named after S.A.Niyazov 62 Gorogly str., Ashgabat, 744000, Turkmenistan E-mail: [email protected]
A microbiological study of bee honey sold in the Moscow markets with respect to pathogenic and conditionally pathogenic microorganisms (bacteria of the genus Salmonella, Shigella, total microbial contamination (KMAFAnM), bacteria of the E. coli group, mold, osmophilic yeast, S. aureus) was carried out. Additionally, organoleptic (appearance, aroma, taste) and physicochemical (determination of the mass fraction of sucrose, fructose and glucose, hydroxymethylfurfural, acidity, electrical conductivity, etc.) were conducted to exclude product falsification. Microbiological, organoleptic and physico-chemical studies were carried out in a testing laboratory that meets the requirements of GOST ISO / EC 17025-2019. The study presented 221 honey samples taken from 13 Moscow markets for the presence of pathogenic and conditionally pathogenic microorganisms. According to the results of studies, Escherichia coli was found in 37 samples (16.7 %), E. coli bacteria (BHEC) in 18 samples (8 %), S.aureus, 25 KMAFAnM (53 samples (23.9 %)) 11.3 %), osmophilic yeast - 3 (1.3 %), a discrepancy in physical and chemical parameters was found in 45 (20.3 %) samples. Considered Russian and international requirements for the microbiological safety of honey in relation to pathogenic and conditionally pathogenic microorganisms. Analyzed the comparative characteristics of indicators and their values.
Keywords: honey, microbiological safety, international requirements, pathogenic and conditionally pathogenic microorganisms
References
Butko, M. P., Gerasimov, A. S., Poskonnaya, T. F., Smirnov, A. M., Klochko, R. T., & Popov, P. A. (2019). Trebovaniya po obespecheniyu bezopasnosti i veter-inarno-sanitarnoy ekspertizy moda pchelinogo [Requirements for ensuring safety and veterinary sanitary examination of bee honey]. Scientific Library
Publishing House Zhuneva, L. S., Semchenko, M. V., & Asyakina, L. K. (2019). Analysis of technologies for obtaining dry honey. Khraneniye i pererabotka sel'khozsyr'ya [Storage and processing of agricultural raw materials], 2, 8-23. https://doi.org/10.36107/spfp.2019.69 Salimov, R. M. (2008). Microorganism survival in certain foods. Dal'nevostochnyy agrarnyy vestnik [Far
This article is published under the Creative Commons Attribution 4.0 International License.
How to Cite
Eastern Agricultural Bulletin], 4(8), 25-27. https:// doi.org/10.24411/1999-6837-2008-00074 Al-Nahari, A. A. M., Almasaudi, S. B., Abd El-Ghany, E. S. M., Barbour, E., Al Jaouni, S. K., & Harakeh, S.(2015). Antimicrobial activities of Saudi honey against Pseudomonas aeruginosa. Saudi Journal of Biological Sciences, 22(5), 521-525. https://doi. org/10.1016/j.sjbs.2015.04.006 Al-Waili, N., Salom, K., Al-Ghamdi, A., & Ansari, M. J. (2012). Antibiotic, pesticide, and microbial contaminants of honey: human health hazards. The Scientific World Journal, 2012, 930849, https://doi. org/10.1100/2012/930849 Anand, S., Deighton, M., Livanos, G., Morrison, P.D., Pang, E. C. K., & Mantri, N. (2019) Antimicrobial activity of agastache honey and characterization of its bioactive compounds in comparison with important commercial honeys. Frontiers in Microbiology, 10(263), 1-16. https://doi.org/10.3389/ fmicb.2019.00263 Augustin, J.-C., & Carlier, V. (2006). Lessons from the organization of a proficiency testing program in food microbiology by interlaboratory comparison: analytical methods in use, impact of methods on bacterial counts and measurement uncertainty of bacterial counts. Food Microbiology, 23(1), 1-38. https://doi.org/10.10Wj.fm.2005.01.010 Boncristiani, H., Li, J. L., Evans, J. D., Pettis, J. & Chen, Y. P. (2011). Scientific note on PCR inhibitors in the compound eyes of honey bees, Apis mellifera. Apidologie, 42, 457-460. https://doi.org/10.1007/ s13592-011-0009-9 Bulgasem, B. Y., Lani, M. N., Hassan, Z., Wan Yusoff, W. M., & Fnaish, S. G. (2016). Antifungal Activity of Lactic Acid Bacteria Strains Isolated From Natural Honey Against Pathogenic Candida Species. My-cobiology, 44(4), 302-309. https://doi.org/10.5941/ MYC0.2016.44.4.302 Campeau, M. E. M., & Patel, R. (2014). Antibiofilm activity of manuka honey in combination with antibiotics. Hindawi Publishing Corporation International Journal of Bacteriology, 2014, 795281. https://doi. org/10.1155/2014/795281 Chien, H.-Y., Shih, A.-T., Yang, B.-S., & Hsiao, V. K. S. (2019). Fast honey classification using infrared spectrum and machine learning. Mathematical Biosciences and Engineering, 16(6), 6874-6891. https:// doi.org/10.3934/mbe.2019344 Fernández, L. A., Ghilardi, C., Hoffmann, B., Busso, C., & Gallez, L. M. (2017). Microbiological quality of honey from the pampas region (argentina) throughout the extraction process. Ryobiology, 49(1), 69-72. https://doi.org/10.10Wj.ram.2016.05.010 Gisder, S., & Genersch, E. (2015). Special issue: honey bee viruses. Viruses, 7(10), 5603-5608. https://doi. org/10.3390/v7102885
Gomes, S., Dias, L. G., Moreira, L. L., Rodrigues, P., & Estevinho, L. (2010). Physicochemical, microbiological and antimicrobial properties of commercial honeys from portugal. Food and Chemical Toxicology, 48(2), 544-548. https://doi.org/10.10Wj. fct.2009.11.029 Hegazi, A. G., Al Guthami, F. M., Al Gethami, A. F. M., Allah, F. M. A., Saleh, A. A., Fouad, E. A. (2017) Potential antibacterial activity of some Saudi Arabia honey. Veterinary World, 10(2), 233-237. https://doi. org/10.14202/vetworld.2017.233-237 Johnston, M., McBride, M., Dahiya, D., Owusu-Apent-en, R., Nigam, P. S. (2018). Antibacterial activity of Manuka honey and its components: An overview. AIMS Microbiology, 4(4), 655-664. https://doi. org/10.3934/microbiol.2018.4.655 Kwakman, P. H. S., & Zaat, S. A. J. (2012). Antibacterial components of honey. International Union of Biochemistry and Molecular Biology, 64(1), 48-55. https://doi.org/10.1002/iub.578 Kwong, W. K., Mancenido, A. L. & Moran, N. A. (2017). Immune system stimulation by the native gut mi-crobiota of honey bees. Royal Society Open Science, 4(2),170003. https://doi.org/10.1098/rsos.170003 Liu, O., Lei, J., & Kadowaki, T. (2019). Gene disruption of honey bee trypanosomatid parasite, lotmaria passim, by CRISPR/Cas9 system. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 9(126), 1-12. https:// doi.org/10.3389/fcimb.2019.00126 Mama, M., Teshome, T., Detamo, J. (2019). Antibacterial activity of honey against methicil-lin-resistant staphylococcus aureus: a laboratory-based experimental study. International Journal of Microbiology, 2019, 7686130. https://doi. org/10.1155/2019/7686130 Matovic, K., Ciric, J., Kaljevic, V., Nedic, N., Jevtic, G., Vaskovic, N., & Baltic , M. Z.(2019). Physicochemi-cal Parameters and Microbiological Status of Honey Produced in an Urban Environment in Serbia. Environmental Science and Pollution Research, 25(8), 14148-14157. https://doi.org/10.1007/s11356-018-1659-1
Oliveira, A., Ribeiro, H. G., Silva, A. C.,Silva, M. D., Sousa, J. C., Rodrigues, C. F.,Melo, L. D. R., Hen-riques, A. F., & Sillankorva, S. (2017). Synergis-tic Antimicrobial Interaction between Honey and Phage against Escherichia coli Biofilms. Frontiers in Microbiology, 8, 664-302. https://doi.org/10.3389/ fmicb.2017.02407 Pajor, M., Worobo, R., Milewski, S., & Szweda, P. (2018). The antimicrobial potential of bacteria isolated from honey samples produced in the apiaries located in pomeranian voivodeship in northern poland. International Journal of Environmental Research and Public Health, 15(9), 2002. https://doi.org/10.3390/ ijerph15092002
Kushch, I. V., Vanner, N. E., Udavliev, D. I., & Muradova, M. D. (2019). Microbiological Safety of Honey. Health, Food & Biotechnology, 1(3). https://doi.org/10.36107/hfb.2019.i3.s267
Regan, T., Barnett, M. W., Laetsch, D. R., Bush, S. J., Wragg, D., Budge, G. E., Highet, F., Dainat, B., de Miranda, J. R., Watson, M., Blaxter, M., & Freeman, T. C(2018). Characterisation of the british honey bee metagenome. Nature Communications, 9(1), 1-13. https://doi.org/10.1038/s41467-018-07426-0 Ruiz-Argueso, T., & Rodriguez-Navarro, A. (1975). Microbiology of Ripening Honey. Applied Microbiology, 30(6), 893-896. https://doi.org/10.1128/ AEM.30.6.893-896.1975 Sereia, M. J., Alves, E. M., Toledo, V. A. A., Marchini, L. C., Faquinello, P., Sekine, E. S., & Wielewski, P. (2011). Microbial flora in organic honey samples of africanized honeybees from Paraná river islands. Food Science and Technology, 31(2), 462-466. https://doi. org/10.1590/ S0101-20612011000200028 Sereia, M. J., Perdoncini, M. R. F. G., Mar^o, P. H., Par-pinelli, R. S., De Lima, E. G., & Anjo, F. A. (2017). Techniques for the evaluation of microbiological quality in honey. in V. de A. A. de Toledo (Ed.), Honey Analysis (pp.233-258). https://doi. org/10.5772/67086
Silva, M. S., Rabadzhiev, Y., Eller, M. R., Iliev, I., Ivanova, I., & Santana, W. C. (2017). Microorganisms in Honey. In V. de A. A. de Toledo (Ed.), Honey Analysis (pp.233-258). https://doi.org/10.5772/67262 Tudor, L., Mitränescu, E., Gali§ A. M., Ilie, L. I., & Ceau^i, C. (2006). Microbiological and physico-chemical analysis of honey from southern romania. Electronic Journal of Environmental, Agricultural and Food Chemistry, 9(9), 1485-1494. Vázquez-Quiñones, C. R., Moreno-Terrazas, R., Natividad-Bonifacio, I., Quiñones-Ramírez, E. I., & Vázquez-Salinas, C. (2017). Microbiological Assessment of Honey in México. Revista Argentina de Microbiología, 50(1), 75-80. https://doi.org/10.10Wj. ram.2017.04.005 Vejnovic, B., Stevanovic, J., Schwarz, R. S., Schwarz R., Aleksic, N., Mirilovic, M., Jovanovic, N. M., Stani-mirovic, Z. (2018). Quantitative pcr assessment of lotmaria passim in apis mellifera colonies co-infected naturally with nosema ceranae. Journal of Invertebrate Pathology, 151, 76-81. https://doi. org/10.1016/j.jip.2017.11.003
