CC BY
14
УДК 637.5.045 ил. 1. Библ. 19.
МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ МЯСНЫХ БЕЛКОВ В МЯСНЫХ ПРОДУКТАХ
Ахремко А.Г., Пчелкина В.А., канд. техн. наук,
Котенкова Е.А., канд. техн. наук, Чернуха И.М., чл.-корр. РАН
ФГБНУ «ВНИИМП им. В.М. Горбатова»
Ключевые слова: методы контроля, протеомные технологии, мышечные белки, фальсификация
Реферат
Представлен обзор различных аналитических стратегий, которые используются в лабораториях для оценки мясных изделий. А также подробно рассмотрены возможности протеомных методов для выявления случаев фальсификации мясных продуктов. Отмечено, что наибольшей информативностью является метод, основанный на выявлении биомаркеров.
METHODS OF DETERMiNiNG THE CONTENT OF MEAT PROTEiNS iN MEAT PRODUCTS
Akhremko A.G., Pchelkina V.A., Kotenkova E.A., Chernukha I.M.
The V.M. Gorbatov All-Russian Meat Research Institute
Keywords: control methods, proteomic technology, muscle proteins, falsification
Summary
This article presents an overview of different analytical strategies used in laboratories for evaluation of meat products composition. The possibility of proteomic methods implementation for falsification cases of meat products is also discussed. It is also noted that the most informative method is based on the identification of bio-markers.
С каждым годом увеличивается ассортимент мясных продуктов как отечественного, так и иностранного производства на потребительском рынке России. Официальная оценка мясной продукции преимущественно направлена на определение ее безопасности и практически не затрагивает определение сырьевого состава и определение соответствия его нормативным документам. По этой причине в пищевой промышленности одним из перспективных направлений является определение качественного состава мясных продуктов [6]. Фальсификация и прослеживаемость качества мяса и мясных продуктов становятся вопросами первостепенной важности в пищевой промышленности. Известны случаи фальсификации мясных продуктов, касающиеся обнаружения сырья, не заявленного на этикетке, например, инцидент с кониной [16]. Таким образом, у потребителя возрастает необходимость в получении четкой и надежной информации о еде, которую он употребляет. Данный вопрос особенно актуален в случае измельченных термо-обработанных мясных продуктов, где простой визуальный осмотр не позволяет определять компоненты так легко, как в случае нативного мяса [17].
Для мясных продуктов в Европе существует декларирование количественного индгредиентного состава «Quantitative Ingredient Declaration» (QUID), данная декларация устанавливает термин «мясо» как скелетные мышцы вместе с максимальным пределом содержания соединительной ткани и жира, где не рассматривается как мясное сырье избыток жира и/или соединительной ткани. Таким образом, не мясные компо-
ненты должны быть заявлены отдельно на этикетке [19].
В связи с ростом фальсификации пищевых продуктов для оценки требуются все более точные и специализированные методы. Для этого используют следующие ключевые методы: хемометри-ка, гистологические и гистохимические, иммунохимические методы анализа, а также протеомные методы. Как в России, так и за рубежом среди методов выявления мышечной ткани в мясном сырье и готовой продукции можно выделить гистологические и гистохимические, которые достаточно широко применяются [5].
Хемометрика - это химическая дисциплина, применяющая математические, статистические и другие методы, основанные на формальной логике, для построения или отбора оптимальных методов измерения и планов эксперимента, а также для извлечения наиболее важной информации при анализе экспериментальных данных [9]. В отношении пищевых фальсификатов, хемометрика используется для группировки и классификации неизвестных образцов со схожими характеристиками и количественно используемой для определения примесей в образцах или для оценки качества или подлинности образцов [10]. В частных случаях идентификации мяса и мясных продуктов хемометрика, главным образом, связана со спектроскопическими методами (в около или средней ИК-области) [2], а также используется для определения видовой специфичности сырья в комплексе с такими методами анализа как ядерный магнитный резонанс (ЯМР), в комплексе с масс-спектрометрией.
В основе гистологических методов
лежит способность тканей окрашиваться дифференцирующими гистологическими красителями. При дальнейшем анализе полученного гистологического препарата под световым микроскопом можно определить наличие мышечной ткани в образце, а также в зависимости от строения установить ее вид: поперечно-полосатая (скелетная), сердечная, гладкая. Гистохимические методы основаны на определении на гистологических срезах специфических компонентов мышечной ткани, которые выделяются цветной реакцией, например, определение миоглобина методом Верболовича.
Для оценки содержания мышечной ткани в мясных продуктах применяют метод электронной микроскопии, анализируя поперечное сечение образца. Так, РгауБоп и др. данным способом определили содержание мяса в американских сосисках [11]. Они также оценивали содержание влаги в образцах. Полученные результаты весьма интересны, так как показали, что в большинстве случаев более 50% от общей массы сосиски составляла вода. Количество мяса, представленное скелетной мускулатурой, в большинстве случаев было менее 10% от площади поперечного сечения.
Гистологические методы, не требуя сложного оборудования, позволяют достаточно быстро получать убедительный ответ о качественном составе большинства мясных продуктов, выявлять входящие в состав животные (кости, хрящи, субпродукты и др.) и растительные (соевые белки, крахмал, каррагинан и др.) компоненты [7].
В современной практике для оценки содержания ткани и выявления мор-
фологических изменений в готовых мясных продуктах применение находят компьютерные системы анализа изображений [12, 14]. Программное обеспечение позволяет производить «узнавание» различных анализируемых структур с учетом многофакторного анализа в автоматическом режиме. В то же время проведения точного измерения массовой доли компонента гистологическими методами затруднено нелинейной корреляцией объемных и массовых данных при количественной оценке содержания компонентов, прежде всего из-за различной степени их гидратирования в ходе технологической обработки.
Широко используются для целей идентификации как доли мышечной ткани, так и видовой специфичности мяса иммунохимические методы анализа благодаря ряду важных преимуществ: простота проведения исследования персоналом, не требующего специальной подготовки, доступная цена, высокая чувствительность и возможность обрабатывать большое количество образцов в короткие промежутки времени. Все эти характеристики делают их пригодными для повседневного использования в лабораториях контроля качества пищевых продуктов. Выполнение анализа зависит от способности имеющихся антител специфически детектировать целевой белок/пептид, характерный для конкретного вида животных, тканей или примесь.
Среди различных иммунологических анализов иммуноферментный анализ (ИФА), вероятно, наиболее широко используемый метод для целей идентификации. Дополнительная информация об использовании ИФА в пищевой подлинности можно найти в обзоре, написанной АБепБЮ и соавт. [3]. Несмотря на многие преимущества, иммунология имеет некоторые ограничения, таких как необходимость специфических антител. Если антитела не являются специфичными для конкретного вида и/или ткани, могут возникнуть проблемы, связанные с перекрестными реакциями, что приводит к ложноположительным или ложноотрицательным случаям. Другие ограничения, представленные для иммунологического анализа касаются анализа с высокой степенью переработки мясных продуктов, так как агрессивные условия, такие как высокая термическая обработка, могут изменять третичную структуру белков, что отрицательно сказывается на их реакцию с антителом
[11]. Это может привести к ложным негативным или к заниженным результатам количественной оценки. Некоторые нововведения были недавно предоставлены, чтобы преодолеть эту проблему: были продуцированы антитела, выработанные против термостабильных белков. О данной стратегии сообщают Kotoura и соавт. [8], им удалось определить содержание мяса говядины в коммерческих обработанных пищевых продуктах путем разработки сэндвич-метода-ИФА, включающего два типа моноклональных антител, один тип против денатурированного миоглобина говядины и второй - против аминокислотной последовательности уникального миоглобина говядины.
Аналитические стратегии, обсужденные выше, связаны с общим измерением химических соединений и наборов данных изображений. Альтернативой к этим подходам, основанных на общих измерениях, является поиск ключевых биомаркеров, способных предоставить необходимую информацию о наличии определенного типа мяса, ткани и/или примеси. Применение протеомных методов таких как: классический одномерный электрофорез, двумерный электрофорез в сочетании с масс-спек-трометрией (МС), а именно матрич-но-активированной лазерной десорбцией/ионизацией «Matrix-Assisted Laser Desorption lonisation» (MALDI) и ионизацией распылением в электрическом поле «Electrospray lonisation» (ESI) позволяет выявить также маркерные белки.
Одним из первых инструментов проте-омики стал одномерный (1D) электрофорез по Лэммли. Данный метод используется и в настоящее время, он позволяет определить фракционный состав белков по молекулярным массам мясного сырья, по которому можно прогнозировать функционально-технологические свойства, а также идентифицировать видо-и тканеспецифические белки. Однако ID-электрофорез не способен фракционировать сложные белковые смеси, поэтому в 1975 году O'Farrell предложил метод двумерного (2D) электрофореза, возможности которого превосходят одномерный электрофорез в несколько раз. При осуществлении 2D-элек-трофореза белки разделяют по двум различным физико-химическим свойствам. Вначале белки разделяют в первом направлении по заряду согласно их изоэлектрической точке путем изоэлек-трического фокусирования (ИЭФ), а за-
тем во втором направлении - согласно их молекулярной массе с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ).
Протеомные подход обладает большим потенциалом с точки зрения прочности и надежности во время идентификации с высокой степенью переработки мяса, где другие методы имели больше ограничений. Для этих продуктов, извлечение белков и пептидов является более пригодным по сравнению с процедурами, экстракции ДНК, что облегчает разработку стандартных протоколов экстракции. В дополнение к этому, первичная аминокислотная последовательность пептидов более устойчива к условиям обработки, чем короткие ДНК-последовательности, тем самым предоставляя возможность разработки надежных количественных определений.
Возможность применения МС для определения молекулярной массы и аминокислотной последовательности пептидов и белков имеет большое значение в лабораторных исследованиях. MALDI и ESI позволяют производить быструю ионизацию пептидов и белков предшествующего анализа МС, с возможностью использования в качестве точных и надежных биомаркеров, способных определять состав мяса и мясных продуктов для целей идентификации мяса [18]. Современные масс-спектрометры имеют большую производительность, более высокую точность определения молекулярной массы и чувствительность, что значительно облегчает обнаружение малых количеств загрязняющих мяса и/или других необъявленных ингредиентов в мясных продуктах.
Избирательность может быть сравнима с методами, основанными на анализе ДНК, так как пептидные последовательности, используемые в качестве биомаркеров являются специфическими для конкретного вида животных.
Методы, основанные на идентификации пептидов с помощью МС, имеют дополнительное преимущество, позволяющее определять пептидную последовательность тканеспецифических белков. Примером этого является работа, проводимая Balizs и др. [4], где они обнаружили и дифференцировали присутствие мяса и костной муки крупного рогатого скота и свиней путем выявления специфических триптических пептидов, полученных из остеокальцина, белковой составляющей кальцинированной кости.
2D17 | №2 ВСЕ О МЯСЕ
Рисунок 1. ДЭ измельченного и термообработанного мясного продукта
На данный момент совершенствуется методика представленная далее, которая является перспективным инструментом определения количества мышечной ткани в мясных продуктах. Для этого проводят фракционирование белков методом двумерного электрофореза по ОТаггеИ [13], и анализируют полученные двумерные электрофоре-граммы (ДЭ) с помощью компьютерной денсиметрии. Из полученных ДЭ выявлено и охарактеризовано шесть групп легко узнаваемых и хорошо воспроизводимых белковых фракций, которые были идентифицированы как мажорные мышечные белки: а- и р-тропом-иозины, структурные и фосфорилиру-емые легкие цепи миозина, изоформы мышечной енолазы и креатинфосфо-киназы, альдолазы А, глицеральаль-дегид-3-фосфатдегидрогеназы и мио-глобины. Эти группы белков показаны овалами на рисунке 1.
Овалами показаны белковые фракции с идентифицированными ранее белками, использующиеся для количественных расчетов при компьютерной денситометрии: № 1 - семейство тро-помиозинов, № 2 -структурные легкие цепи миозина, № 3 - фосфорилируемые легкие цепи миозина, № 4 - изоформы мышечной енолазы и креатинфосфо-киназы, № 5 - альдолазы А и глице-ральальдегид-3-фосфат дегидрогеназы и № 6 - миоглобины [1].
По обобщенным результатам количественной компьютерной денситометрии шести групп белковых фракций определяют количество мясного сырья в продукте. Данная методология в настоящее время апробируется для анализа разных видов мясных изделий.
Проблема фальсификации продуктов остро стоит в пищевой промыш-
ленности, и современная наука вносит значительный вклад в уведомлении потребителя о качестве и безопасности продуктов. Исследования в этой области довольно динамично развиваются, поскольку есть необходимость более достоверного определения состава мясных изделий. Быстрые и неинва-зивные методы, которые основаны на анализе спектроскопии, могут быть применены в производственных предприятиях в качестве методов скрининга, способных предоставить информацию о составе пищевых продуктов и потенциальных мошенничеств. Наиболее информативным методом является метод, основанный на выявлении биомаркеров. Это остается большой
9. Massart, D.L. Chemometrics: a textbook. Elsevier, NY. 1988
перспективой исследований в пищевой области.
Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 16-16- 10073).
© КОНТАКТЫ:
Ахремко Анастасия Геннадьевна а е-таИ: ahremko94@gmail.com Пчелкина Виктория Александровна а е-таП: delta806@rambler.ru Котенкова Елена Александровна а е-mail: lazovlena92@yandex.ru Чернуха Ирина Михайловна а е-mail: imcher@inbox.ru
список ЛИТЕРАТУРЫ:
REFERENCES:
Ковалев, Л.И. Протеомное исследование количества мышечной ткани в образцах вареных колбас / Л.И. Ковалев, М.А. Ковалева, А.В. Иванов, С.С. Шишкин, А.Б. Лисицын, И.М. Чернуха, Н.Л. Вострикова // Все о мясе. - 2013. - № 1. - С. 18-21.
Kovalev, L.I. Proteomnoye issledovaniye kolichestva my-shechnoy tkani v obraztsakh varyonykh kolbas [Proteomic study of muscle tissue in the samples of cooked sausages] / L.I. Kovalev, M.A. Kovaleva, A.V. Ivanov, S.S. Shishkin, A.B. Lisitsyn, I.M. Chernukha, N.L. Vostrikova // Vsyo o myace. — 2013. — № 1. — P. 18-21.
