CC BY
52
0
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ / Количественный состав продуктов
Протеомное исследование
количества мышечной ткани в образцах вареных колбас
М. А. Ковалева, А. В. Иванов, Л. И. Ковалев, С. С. Шишкин,
ФГБУ Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН,
А. Б. Лисицын, академик РАСХН, доктор техн. наук, И. М. Чернуха, доктор техн. наук, Н. Л. Вострикова, канд. техн. наук, ГНУ ВНИИМП им. В.М. Горбатова Россельхозакадемии
Проблемы, связанные с поступлением на рынок мясных продуктов (в частности, вареных колбас) ненадлежащего качества или даже фальсифицированных продуктов, традиционно являются актуальными для общества [2,4]. Экономически и общественно значимой задачей является также разработка методов лабораторных исследований, которые обнаруживают подобные нарушения
^ Существуют три важных вопроса, которые интересуют контролирующие организации и потребителей относительно качества колбасных изделий, а именно: 1) соответствие технологии ГОСТам или ТУ; 2) соблюдение рецептуры и состава закладываемого сырья; 3) наличие немясных белков либо белков немышечного происхождения или мышечных белков, но не относящихся к свинине или говядине.
Для обеспечения контроля качества мясных продуктов уже предложен целый ряд подходов и методов, включающих мониторинг фактического состава, определения присутствия белковых добавок растительного и животного происхождения, а также установления степени соответствия нормативной документации. Одно из активно развивающихся направлений в этой области - протеомные технологии, которые располагают значительным аналитическим арсеналом, включающим высокоэффективные методы фракционирования белков, их масс-спек-трометрической идентификации с использованием различных биоинформационных ресурсов, и этот арсенал начал использоваться для изучения белковых компонентов и их количественных характеристик в производимых коммерческих мясных продуктах [2,3].
В данной статье представлены результаты сравнительного изучения протеомными методами ряда количественных характеристик у образцов колбасных изделий и мясного сырья.
Материалы и методы
В работе исследовали образцы вареной колбасы «Докторской»: три образца, изготовленных в строгом соответствии с ГОСТ 52196-2003 (эталоны 1, 2, 3), различающиеся по содержанию жира, семь образцов колбасы про-
УДК 637.524.2.045:577.21
Ключевые слова: протеомные технологии, мышечная ткань, вареная колбаса, фальсификация, методы контроля.
изводства разных мясокомбинатов (№№1-4, М, Д, К), закупленных в торговых сетях.
Экстракцию белков, их фракционирование методом одномерного и двумерного электрофореза по О'Фарреллу, компьютерную денситометрию двумерных элек-трофореграмм и масс-спектромет-рическую идентификацию отдельных белковых фракций проводили как описано ранее [3,8,9].
Для выделения белковых соединений из исследуемых образцов брали навеску пробы 25 мг, за-
Рисунок 1. Результаты электрофоретического фракционирования белков опытных образцов.
18
ё О МЯСЕ № 1 февраль 2013
Количественный состав продуктов / МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
ßP
ливали 250 мкл солюбили- зирую-щего раствора (глицерин 20%, ß -меркаптоэтанол, бромфенол синий, трис HCl, SDS 40%). Провели экстракцию в течение 15 минут, при температуре 95°С. Полученный гомогенат, центрифугировали при 21°С в течение 20 минут, 15 000 об/мин в центрифуге Sigma 3K30.
Результаты и обсуждение
Белковый состав исследуемых образцов анализировали методом электрофореза в полиакриламид-ном геле в присутствии додецил-сульфата натрия с использованием электрофоретической камеры фирмы Sigma при силе тока 30 мА и напряжении 100 и 300 В в течение двух часов.
Анализ общей картины элек-трофоретического разделения семи образцов колбас различного состава показал схожесть в количественном и качественном составе белковых фракций исследуемых образцов.
Качественные различия в образцах колбас можно проследить по различным белковым фракциям, например, фракция 35-38 кДа, представлена в образцах №№1-4
четырьмя полосами разделения и фракция 70 кДа представлена двумя полосами разделения, тогда как в образцах эталонов 1-3 данные фракции присутствуют в виде одной полосы.
Также качественные различия в белковом составе исследуемых образцов хорошо видны на примере фракции 23-25 кДа. В образцах №1-№4, выявлены три фракции белка, тогда как в эталонах 1-3 -одна фракция.
Полученные данные свидетельствуют, что помимо Тропонинов I и Т и Тропомиозина в коммерческих образцах вареных колбас присутствуют другие белки с близкими молекулярными массами.
В результате проведенного исследования была установлена схожесть исследуемых образцов. Во всех образцах обнаружены белки: М-белок (170 кДа) (максимальное содержание белка во всех образцах); Глобулин - X (150 кДа); Актин G—F(56 кДа) ( в образце Д - минимальное количество); ЛЦ 2 (16 кДа) , ЛЦ 3 (14 кДа) и ЛЦ-А1 (20,7 кДа) в количестве одной фракции.
В результате проведенного ранее [3] исследования было уста-
Рисунок 2. Двумерная электрофореграмма эталонного образца докторской колбасы. Овалами обозначены фракции, использованные для расчета: 1- семейство тропомиозинов, 2 -структурные легкие цепи миозина, 3 - фосфорилируемые легкие цепи миозина, 4 - мышечные енолаза и креатинфосфокиназа, 5 - комплекс альдолазы А и глицеральальдегид-3-фос-фатдегидрогеназы, 6 - миоглобины.
новлено видовое различие мышечных белков в говядине и свинине. При этом наличие белка миогло-бина в образцах свинины и говядины, методом одномерного электрофореза выявлено не было. Молекулярная масса миоглобина составляет 17 КДа.
Поэтому следующим этапом наших исследований стало изучение фракционирования белков свинины и говядины методом двумерного электрофореза.
При исследовании протеом-ными методами количественного содержания мышечного белка в образцах вареных колбас на каждый образец получали по 3-5 двумерных электрофореграмм, выполненных в стандартных условиях [7]. При пробоподго-товке 200 мг образца гомогенизировали в 4 мл лизирующего буфера. Далее пробы объемом 75 мкл наносили на каждую трубку с гелем для изоэлектрофокусирования [6]. Предварительно было показано, что при анализе проб объемом 100 мкл и выше воспроизводимость результатов фракционирования ухудшается.
Типичная двумерная электро-фореграмма (ДЭ) белков из эталонного образца представлена на рисунке 2.
На каждой из подобных ДЭ количественно характеризовали шесть групп легко узнаваемых и хорошо воспроизводимых белковых фракций, которые были идентифицированы как мажорные мышечные белки а- и ß-тропо-миозины, структурные и фосфо-рилируемые легкие цепи миозина, изоформы мышечной енолазы, креатинфосфокиназы, альдолазы А и глицеральальдегид-3-фосфат-дегидрогеназы и миоглобины. Эти группы белковых фракций показаны овалами на рисунке 2.
Следующим этапом в разработках протеомной методики определения количественного содержания мышечного белка в образцах вареных колбас стало решение вопросов, связанных с обеспечением так называемой гель-документации ДЭ.
Ранее было установлено, что для получения с помощью компьютерной денситометрии воспроизводимых количественных
№ 1 февраль 2013 ВСЁ О МЯСЕ
19
0
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ / Количественный состав продуктов
Таблица 1.
Образец Суммарная интенсивность пятен
Эталон 1 1454±63 (4,3%)
Эталон 2 1457±184 (12,6%)
Эталон 3 1654±14 (0,8%)
Образец 1 805±52(6%)
Образец 2 824±18(2%)
Образец 3 801±10 (1,3%)
Образец 4 858±32 (3,7%)
Коммерческий образец М 757
Коммерческий образец Д 610
Коммерческий образец К 927
данных о содержании мышечных белков на ДЭ необходимо использовать только результаты их сканирования [1]. Изображения ДЭ, полученные с помощью цифрового фотографирования, оказались малопригодными в таком анализе из-за затруднений при обеспечении строго одинакового расстояния между фотокамерой и снимаемым объектом (ДЭ). Как следствие, снижалась воспроизводимость интенсивности окраски белковых фракций на подобных цифровых фотоизображениях.
Проведение сканирования ДЭ в разных режимах позволило сделать заключение, что оптимальным условиям соответствует сканирование в режиме 48 bit Color с сохранением результатов в формате TIFF.
Обобщенные результаты количественной компьютерной денси-тометрии шести групп белковых фракций (мышечных белков) на ДЭ исследованных образцов приведены в таблице 1.
Полученные количественные показатели эталона рассматривались как референсные значения и послужили основой для последующего определения количества мышечного белка в образцах колбасных изделий, предназначенных для реализации (таблица 1).
Как видно из представленных данных, в четырех исследованных образцах колбасных изделий количество мышечных белков (прямо пропорционально отражающих содержание мясного сырья) не превышает 55% от соответствую-
щих показателей у эталонных образцов. Параллельно проведенное аналогичное исследование трех коммерческих продуктов показало, что в этих образцах содержание мышечных белков составляет 40, 50 и 61% от эталонных значений.
Кроме этого, в эталонных образцах проводилось определение процентного содержания миогло-бина, мышечной енолазы и трио-зофосфат-изомеразы свинины и говядины.
Поскольку эталонные образцы были специально изготовлены в соответствии с ГОСТом, то в этих образцах соотношение свинины и говядины было известно заранее. Соответственно, протеомный количественный анализ в этих образцах выбранных потенциальных белковых биомаркеров мог обеспечить оценку эффективности и точности получаемых результатов.
В итоге суммарно по трем проанализированным эталонным образцам соотношение свинина / говядина по мышечной енолазе было оценено в величинах Мвт как 58,3±2 / 41,7±2, а по триозофос-фатизомеразе - 59,6±2,4 / 40,4±2,4. Таким образом, полученные средние значения для этих двух биомаркеров практически совпали. Принципиально иные результаты были получены при проверке биомаркерных свойств у миоглобина: прямое использование полученных характеристик по этому биомаркеру показало соотношение
мышечного белка свинина / говядина (в величинах Мвт) как 37,3±0,5 / 62,7±0,5.
Однако известно, что содержание миоглобина в свинине существенно ниже, чем в говядине. По разным оценкам различия могут составить от 2 до 8 раз в зависимости от особенностей сравниваемого сырья (включая, например, возраст животных и тип мышечных тканей).
Кроме того, были идентифицированы пятна легких цепей миозина (ЛЦМ 1-(быстрый тип)). При этом в свинине с высокой долей белых мышечных волокон основной компонент ЛМЦ 1, а минорный белок ЛМЦ 3 подобный (медленный тип) в 10 раз меньше. В свинине с преобладанием красных мышечных волокон соотношение меняется. ЛМЦ 3 подобный составляет две трети общего количества. Аналогичные изменения отмечены и для глицераль-дегид-3-фосфатдегидрогеназы, а также легкой цепи миозина ЛЦМ 2. Триозофосфатдегидрогеназа 1 меняется в относительном количестве (рисунок 3).
В результате проведенных исследований количественное определение миоглобина свиного и говяжьего происхождения колебалось в пределах 25% по его видо-специфичному содержанию. Исходя из сведений о реальном соотношении мышечного белка свинина/говядина в специально изготовленных эталонных образ-
Рисунок 3. Обзорные электрофореграммы свинины белой (А) и красной (Б).
Внизу фрагменты зоны легкой цепи миозина 1 (ЛЦМ). Стрелками с номерами обозначены идентифицированные пятна ЛЦМ (1 - Белок подобный ЛМЦ 3(медленный тип); 2 - ЛМЦ 1; 3 - триозофосфат дегидрогеназа 1; 4 - глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы; 5 - альдолаза А.
20
ё О МЯСЕ № 1 февраль 2013
Количественный состав продуктов / МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
ЁР
цах, был рассчитан соответствующий поправочный коэффициент (Кп), который для определения содержания миоглобина в свинине оказался равным 0,67 ед. OD/C (где ед.OD - величина оптической плотности фракции свиного мио-глобина, измеренной при компьютерной денситометрии, а C - содержание этого белка в условных единицах). Аналогично Кп для говяжьего миоглобина был определен величиной 1,5 ед. OD/C.
После коррекции результатов определения миоглобина с помощью рассчитанных Кп соотношение мышечного белка свинина / говядина в эталонных образцах было оценено следующими величинами (в %): эталон 1 - 56,3 / 43,7;
Литература
1. Говорун В.М., Мошковский С.А., Тихонова О.В., Гоуфман Е.И., Серебрякова М.В., Момыналиев К.Т., Лохов П.Г., Хряпова Е.В., Кудрявцева Л.В., Смирнова О.В., Торопыгин И.Ю., Максимов Б.И.,
Арчаков А.И. Сравнительный анализ протеомных карт Helicobacter pylori в клинических изолятах // Биохимия. 2003. Т.68. С.52-60.
2. Ковалев Л.И., Шишкин С.С., Иволгина Г.Л., Громов П.С., Шандала А.М. Выявление межлинейного полиморфизма белков сердечной мышцы мышей методом двумерного электрофореза. //
Биохимия. 1986. Т.51. №6. С.896-908.
3. Ковалева М.А., Иванов А.В., Ковалев Л.И., Шишкин С.С., Хряпова Е.В., Лисицын А.Б., Чернуха И.М., Вострикова Н.Л. Протеомные технологии в исследованиях белкового состава вареных
колбасных изделий // Все о мясе. 2012. № 2 С.48-53.
4. Чернуха И.М., Кузнецова Т.Г., Селиванова Е.Б., Марсакова Е.И. Современные подходы к объективной оценке качества мясного сырья и готовой продукции // Все о мясе. 2010. № 2. С.19-23.
5. Bjarnadottir S.G., Hollung K, H0y M, Veiseth-Kent E. Proteome changes in the insoluble protein fraction of bovine Longissimus dorsi muscle as a result of low-voltage electrical stimulation. // Meat Sci.
2011. 89. №2. с.143-149.
6. Blum H., Beir H., Cross H.G. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. // Electrophoresis. 1987. V.8. Р.126-129.
7. Celis J.E. Bravo R. (ed.). Two-Dimensional Gel Electrophoresis of Proteins: Methods and Applications. Academic Press, N. Y. 1984.
8. Montowska M, Pospiech E. Myosin light chain isoforms retain their species-specific electrophoretic mobility after processing, which enables differentiation between six species: 2-DE analysis of minced
meat and meat products made from beef, pork and poultry. // Proteomics. 2012. 12 (18). Р.2879-89.
9. O'Farrell P.H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins // J.Biol.Chem. 1975. V.250. P.4007-4021.
эталон 2 - 57,4 / 42,6; эталон 3 -57,6 / 42,4. Соответственно, суммарно по трем эталонам этот показатель составил - 57,1 / 42,9 и практически совпал с оценками, сделанными по двум другим видо-специфичным биомаркерам (см. выше).
Таким образом, проведенные протеомные исследования позволили заложить основу методики, пригодную для оценки количественного содержания мясного компонента в образцах вареных колбас. Данная методология в перспективе может быть усовершенствована до уровня достаточно универсальной, применимой для анализа разных видов вареных колбасных изделий. При этом для по-
вышения точности такого анализа, целесообразно выполнить определенные доработки с последующим расширенным тестированием (ва-лидацией).
Контакты:
Марина Анатольевна Ковалева,
Алексей Викторович Иванов,
Леонид Иванович Ковалев,
Сергей Сергеевич Шишкин,
+7(495)952-5886
Андрей Борисович Лисицын,
+7(495)676-9511
Ирина Михайловна Чернуха,
+7(495)676-7211
Наталья Леонидовна Вострикова +7(495)676-9971
