CC BY
5
УДК 543.545.2:637.5 DOI: 10.21323/2071-2499-2019-3-46-48 Ил. 3. Библ. 13.
ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ДВУМЕРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА ДЛЯ ОЦЕНКИ СОСТАВА МЯСНЫХ ПРОДУКТОВ НА ПРИМЕРЕ МОДЕЛЬНЫХ ФАРШЕЙ
Ахремко А.Г.
ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова
Ключевые слова: мышечные белки, фарш, мясо, двумерный электрофорез Реферат
Исследованы модельные фарши из свинины и говядины с процентным содержанием говядины 10, 1, 0,1 и 0,01 % методом двумерного электрофореза с дальнейшей компьютерной денсито-метрией. Отмечено 25 конститутивных фракций для свинины и говядины, из которых наиболее интересными для дальнейшего анализа оказались тропомиозин альфа 1 (33,5 кДа), енолаза бета (46 кДа) креатинкиназа субъединица М (41,0 кДа), миозиновые лёгкие цепи (21,5 кДа) и тропо-нин Т скелетномышечный (31,0 кДа). Исследование показывает, что выявленные ранее енолаза бета и изоформы миозиновых лёгких цепей обнаруживаются даже при самом низком количестве компонента сырья при оценке состава мясных продуктов, что подтверждено на двумерных электрофореграммах и компьютерной денситометрией.
APPLiCATiON OF TWO-DiMENSiONAL ELECTROPHORESiS METHOD FOR ASSESSiNC MEAT PRODUCTS COMPOSiTiON ON MODEL STUFFiNC EXAMPLE
Ahremko A.G.
Gorbatov Research Center for Food Systems
Key words: muscle proteins, stuffing, meat, two-dimensional electrophoresis
Summary
In this work, model minced pork and beef with a percentage of beef 10, 1, 0.1 and 0.01 % were studied by two-dimensional electrophoresis with further computer densitometry. 25 constitutive fractions of pork and beef were noted, the most interesting fractions for further analysis were tropomyosin alpha 1 (33.5 kDa), enolase beta (46 kDa) creatine kinase subunit M (41.0 kDa), myosin light chains isoforms (21.5 kDa) and troponin T skeletal muscle (31.0 kDa). The study shows that enolase beta and isoform of myosin light chains are the most promising as biomarker candidates in assessing meat products composition, which was confirmed on two-dimensional electro-phoregrams and computer densitometry
Введение
Известно, что количество и качество потребляемых продуктов, в частности мясных, значительно влияют на состояние здоровья населения [1]. В условиях огромного потока информации и увеличения осведомлённости потребителей покупатели хотят иметь точную информацию о составе мясопродуктов [2]. Отдельно стоит отметить увеличение случаев фальсификации мясных продуктов с использованием мяса от других животных, белковых добавок и прочих, не предусмотренных технологией производства. Таким образом, контроль мясной продукции, а также сырья является весьма важным вопросом. Сегодня особую актуальность приобретает разработка надёжных и высокопроизводительных методов, позволяющих идентифицировать и определять отдельные компоненты сложных пищевых систем [3, 4]. Протеомика имеет в своём арсенале современные методы, которые способны охарактеризовать белки, присущие различным типам сырья, за счёт чего возможно проанализировать белковый состав продуктов. За последние десять лет в области протеомики мяса наблюдался устойчивый рост научного интереса [5]. Было проведено большое количество исследований, направленных на определение видовой и половой принадлежности мясного сырья, влияние автолитических и технологических процессов на белки мяса, определение количественного содержания «мясных» белков и многое другое [6, 7, 8]. Отдельно стоит отметить открытие белков-маркеров для различных атрибутов качества мяса [9].
Учёными ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова совместно с автором статьи предпринята попытка создания комплексной методики определения качественного и количественного состава мясной продукции к использованию двумерного электрофореза для аутентификации готовой мясной продукции.
В данной статье рассмотрена возможность использования основного метода протеомики для визуализации белков мясных композиций - двумерного электрофореза (2ДЭФ, 2DE), позволяющего проводить параллельное разделение и анализ сотни и тысячи отдельных белковых молекул. В результате проведения 2DE формируются «пятнистые» структуры, где каждое отдельное пятно представляет собой индивидуальный белок. Интенсивность окрашивания пятна указывает на количественное содержание белковых фракций в образце [10].
Целью данного исследования было оценить возможность применения метода двумерного электрофореза для анализа состава мясных систем на примере модельных фаршей с заданным количеством сырья.
Материалы и методы
Объектами исследования являлись модельные сырые фарши из длиннейшей мышцы свиньи с добавлением говядины - длиннейшая мышца (в виде замены равной части свинины) - с процентным содержанием 10,00% масс., 1,00% масс., 0,10% масс. и 0,01 % масс. Фарши измельчали при помощи ножевой мельницы Retsch GM 200 (Retsch GmbH, Германия) при плавном увеличении от
2000 до 5000 об/мин до гомогенизированного состояния. До момента начала анализа образцы хранили при температуре 4±2 °С.
Двумерный гель-электрофорез (2-DE)
Образцы, описанные выше, были исследованы методом двумерного электрофореза. На первом этапе проводили изоэлектрофокусирование (ИЭФ) при 3650 В/ч в 2,4 мм х 160 мм трубчатых гелях, в качестве анодного и катодного буфера использовали 0,02 М ортофос-форную кислоту и 0,02 М гидрооксид натрия соответственно. После ИЭФ гели инкубировали в течение 10 мин в 2,5 мл уравновешивающего буфера I (6 М мочевины, 20% глицерина, 2% БЭБ и 1 % ЭТТ в 50 мМ трис-НС1 буфер, рН 8,8), далее в уравновешивающем буфере II (6 М мочевина, 20 % глицерин, 2 % БЭБ и 4 % йодацетамид в 375 мМ трис-НС1 буфере, рН 8,8).
Далее проводили электрофорез с додеци л сульфатом натрия, для этого уравновешенные гели переносили в 12,5% полиакриламидный гель (170 мм х 180 мм х 1,5 мм). Электрофорез проводили с использованием буфера, содержащего 25 мМ трис-НС1, 192 мМ глицина и 0,1 % БЭБ, при 30 мА на гель до тех пор, пока фронт красителя не достигнет края геля.
Визуализация белковых фракций и анализ изображений
Белковые пятна визуализировали окрашиванием кумасси бриллиантовым синим G-250. Для компьютеризированной денситометрии использовали двумерные электрофореграммы во влажном
ВСЕ О МЯСЕ № 3 | 2019
Рисунок 1. Двумерные электрофореграммы модельных фаршей с различным содержанием говядины. Цифрами обозначены общие фракции
Й! .
I 1
* f
d'»sDr> I»
1W
Л
SO 4а
Hi
з;
4 ~Л
t
L
0,10 %
1,00 %
0,01 %
10,00 %
состоянии. Их цифровые изображения получали с использованием сканера Bio-5000 plus (Serva, Германия). Отсканированные изображения анализировали с помощью программного обеспечения ImageMaster ™ 2D Platinum на базе Melanie 8.0 (GE Healthcare and Genebio, Switzerland), которое автоматически обнаруживало и количественно определяло белковые фракции. Затем оцифрованные 2DE-изображения сравнивали методом сопоставления [11].
Результаты исследований
На начальном этапе исследования изучали модельные фарши с минимальным содержанием говядины методом двумерного электрофореза, в результате были выбраны общие конститутивные фракции для всех модельных систем, которые представлены на рисунке 1 (отмечены цветом и обозначены цифрами на элек-трофореграмме с 0,01 % содержанием говядины).
В результате исследования 2-DE гелевых изображений при помощи ImageMaster™ 2D Platinum software было выявлено порядка 150 пятен, присутствующих в каждом геле всех фаршевых систем. При этом наиболее выраженная интенсивность окрашивания белков выявлялась у образцов с 0,01 % содержанием говядины, наименее выраженная интенсивность окрашивания белков отмечена у образцов с 10% содержанием говядины. Среди
обнаруженных фракций были выявлены наиболее легко визуализируемые при помощи 2ЭБ 25 конститутивных белков, представленных на рисунке 1 (фарш с 0,01 % содержанием говядины). Наибольшей интенсивностью окрашивания характеризовались белковые пятна 2, 6, 7 и 17, являющиеся предположительно в соответствии с базой данной «Проте-омика мышечных органов» [12] тропо-миозином альфа 1 (33,5 кДа), енолазой бета (46 кДа) креатинкиназой субъединицей М (41,0 кДа) и тропонином Т
скелетномышечным (31,0 кДа) соответственно (рисунок 2).
Линейная зависимость от содержания говядины в фарше отмечалась у белков 3 и 6, вероятно являющиеся миозиновой лёгкой цепью 1/3 (21,5 кДа) и енолазой бета (46 кДа), их интенсивность уменьшалась при увеличении количества говядины в фарше. Зарубежными коллегами уже проводились исследования миозиновых лёгких цепей в качестве маркера качества мяса, но вопрос ещё не изучен в полной мере [13]. Также
о с
а
(в
4,0E+08
3,5E+08
3,0E+08
2,5E+08
Рисунок 2. Профиль экспрессии белковых фракций
2,0E+08
с
о
а
«
х
JS
(в ср
1,5E+08
1.0E+08
5,0E+07
0,0E+00
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
Номер белкового пятна
2D19 | № 3 ВСЕ О МЯСЕ
на рисунке 3 представлены фрагменты двумерных электрофореграмм, в которых отмечена подобная тенденция по снижению интенсивности окраски белковых фракций при увеличении мяса говядины.
Отмечено, что во фракциях 4 и 5 происходило равномерное снижение интенсивности пятен. Также в области белковых пятен № 19-25 в зависимости от состава фарша происходила деградация белковых молекул и небольшое смещение изоэлектрических точек, на фракции № 22 эти изменения более выражены. Возможно, данные изменения происходят из-за агрегации белковых молекул.
Заключение
Исследование показывает, что применяемый метод достаточно чувствителен и пригоден для выявления отличия интегральной оптической плотности при различном составе мясных моделей. Наиболее информативными для данного анализа, вероятно, являются енолаза бета и изоформы миозиновых лёгких цепей при оценке состава мясных продуктов, поскольку на двумерных электрофореграммах фаршевых систем отмечено равномерное изменение интенсивности указанных белковых пятен при увеличении доли говядины, что подтверждено компьютерной денсито-метрией.
список ЛИТЕРАТУРЫ: REFERENCES:
1. Olmedilla-Alonso, B. Development and assessment of healthy properties of meat and meat products designed as functional foods / B. Olmedilla-Alonso, F. Jiménez-Colmenero, F. Sánchez-Muniz // Meat science. — 2013. — Т. 95. — № 4. — P. 919-930.
2. Ali, M.E. Species authentication methods in foods and feeds: the present, past, and future of halal forensics / M.E. Ali, M. Kashif, K. Uddin, U. Hashim, S. Mustafa, Y.B. Man // Food Analytical Methods. — 2012. — T. 5. — № 5. — P. 935-955.
3. Ballin, N.Z. Authentication of meat and meat products / N.Z. Ballin // Meat science. — 2010. — T. 86. — № 3. — P. 577-587.
4. Montowska, M. Authenticity determination of meat and meat products on the protein and DNA basis / M. Montowska, E. Pospiech // Food Reviews International. — 2010. — T. 27. — № 1. — P. 84-100.
5. Zvereva, E.A. Enzyme immunoassay and proteomic characterization of troponin I as a marker of mammalian muscle compounds in raw meat and some meat products / E.A. Zvereva, L.I. Kovalev, A.V. Ivanov, M.A. Kovaleva, A.V. Zherdev, S.S. Shishkin, A.B. Lisitsyn, I.M. Chernukha, B.B. Dzantiev // Meat science. — 2015. — T. 105. — P. 46-52.
6. Чернуха, И.М. Сравнительное изучение автолитиче-ских изменений протеома мышечной ткани свинины и говядины / И.М. Чернуха, А.Г. Ахремко // Теория и практика переработки мяса. — 2018. — Т. 3. — № 3. — С. 56-63.
Chernukha, I.M. Sravnitel'noye izucheniye avtoliticheskikh izmeneniy proteoma myshechnoy tkani svininy i govyadiny [Comparative study of autolytic changes in the proteome of pork and beef muscle tissue] / I.M. chernukha, A.G. Akhremko // Teoriya i praktika pererabotki myasa. — 2018. — T. 3. — № 3. — P. 56-63.
7. Чернуха, И.М. Влияние термической обработки на сохранность тканеспецифичных белков сердечной мышцы и аорты Sus scrofa / И.М. Чернуха, Л.В. Фе-дулова, Е.А. Котенкова, С.С. Шишкин, Л.И. Ковалёв, Н.Г. Машенцева, Д.Л. Клабукова // Биофармацевтический журнал. — 2016. — Т. 8. — № 6. — С. 38-44.
Chernukha, I.M. Vliyaniye termicheskoy obrabotki na sokhrannost' tkanespetsifichnykh belkov serdechnoy myshtsy i aorty Sus scrofa [The effect of heat treatment on the preservation of tissue-specific proteins of the heart muscle and aortic tissue of Sus scrofa] / I.M. Chernukha, L.V. Fedulova, E.A. Kotenkova, S.S. Shishkin, L.I. Kovalev, N.G. Mashentseva, D.L. Klabukova // Biofarmatsevticheskiy zhurnal. — 2016. — T. 8. — № 6. — P. 32-38.
8. Чернуха, И.М. Выявление маркеров агрегации белков в мясном сырье и готовой продукции / И.М. Чернуха, Л.И. Ковалев, Н.Г. Машенцева, М.А. Ковалева, Н.Л. Вострикова // Инновации в пищевой биотехнологии: сборник трудов Международного симпозиума / под общ. ред. А. Ю. Просекова. — Кемерово, 2018. — С. 103-110.
Chernukha, I.M. Vyyavleniye markerov agregatsii belkov v myasnom syr'ye i gotovoy produktsii [Detection of protein aggregation markers in raw meat and finished products] / I.M. Chernukha, L.I. Kovalev, N.G. Mashentseva, M.A. Kovaleva, N.L. Vostrikova // Innovatsii v pishchevoy biotekhnologii: sbornik trudov Mezhdunarodnogo simpo-ziuma / pod obshch. red. A. Yu. Prosekova. — Kemerovo, 2018. — P. 103-110.
9. Федулова, Л.В. «Мясные» стереотипы / Л.В. Федуло- Fedulova, L.V. «Myasnyye» stereotipy [«Meat» stereotypes] ва // Все о мясе. — 2G18. — № 3. — С. 4-7. / L.V. Fedulova // Vsyo o myase. — 2G18. — № 3. — P. 4-7.
10. Василевская, Е.Р. Методология исследования белко- Vasilevskaya, E.R. Metodologiya issledovaniya belkovo-pep-во-пептидных компонентов экстрактов тканей sus tidnykh komponentov ekstraktov tkaney sus scrofa [Meth-scrofa / Е.Р. Василевская, Е.А. Котенкова, Е.А. Луки- odology for the study of protein-peptide components of sus нова, Е.А. Калинова // Теория и практика переработ- scrofa tissue extracts] / E.R. Vasilevskaya, E.A. Kotenkova, ки мяса. — 2017. — Т. 2. — № 3. — С. 79-85. E.A. Lukinova, E.A. Kalinova // Teoriya i praktika pererabot-
ki myasa. — 2017. — T. 2. — № 3. — P. 79-85.
11. Ахремко, А.Г. Применение протеомных технологий для изучения тимуса, селезенки и мезентеральных лимфатических узлов свиней / А.Г. Ахремко, Л.В. Федулова, Е.Р. Василевская // Все о мясе. — 2019. — № 1. — С. 54-57.
Akhremko, A.G. Primeneniye proteomnykh tekhnologiy dlya izucheniya timusa, selezenki i mezenteral'nykh limfaticheski-kh uzlov sviney [Application of proteomic technologies for the study of thymus, spleen and mesenteric lymph nodes of pigs] / A.G. Akhremko, L.V. Fedulova, Ye.R. Vasilevskaya // Vsyo o myase. — 2019. — № 1. — P. 54-57.
© КОНТАКТЫ:
Ахремко Анастасия Геннадьевна a a.ahremko@fncps.ru
12. База данных «Протеомика мышечных органов». Baza dannykh «Proteomika myshechnykh organov» [Pro-Электронный ресурс. — Режим доступа: [http:// teomics of Muscular Organs] Elektronnyy resurs. — Rezhim mp.inbi.ras.ru] (дата обращения 28.G4.2G19). dostupa: [http://mp.inbi.ras.ru] (data obrashcheniya
28.G4.2G19).
13. Montowska, M. Differences in two-dimensional gel electrophoresis patterns of skeletal muscle myosin light chain isoforms between Bos taurus, Sus scrofa and selected poultry species / M. Montowska, E. Pospiech // Journal of the Science of Food and Agriculture. — 2011. — T. 91. — № 13. — P. 2449-2456.
ВСЕ О МЯСЕ № 3 I 2019
