МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕКАЛЬНЫХ ЦИТРАТПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ КИШЕЧНЫХ ПАЛОЧЕК Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

УДК 614.777-078:628.1.03:576.851.48

Г. П. Калина

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕКАЛЬНЫХ ЦИТРАТПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ КИШЕЧНЫХ ПАЛОЧЕК

Московский научно-исследовательский институт гигиены им. Ф. Ф. Эрисмана

На основании анализа литературных данных и собственных наблюдений установлено, что к категории фекальных кишечных палочек (ФКП) могут быть отнесены представители различных родов энтеробактерий, обладающие определенными свойствами. Основным видом ФКП являются Е. coli, однако нельзя исключить из этой категории и цитратположитель-ные кишечные палочки (Ц+КП), которые (особенно клебсиеллы) в последние годы все чаще обнаруживаются в кишечнике человека и могут быть показателями фекального загрязнения окружающей среды. В то же время в окружающей среде Ц+КП широко распространены, и, для того чтобы определить их фекальное происхождение, необходимы определенные свойства, отличающие их от нефекальных Ц+ КП. Способность ферментировать лактозу с образованием газа в среде ЕС при 44,5°С отмечена у выделяемых из кишечника человека и окружающей среды клебсиелл (Dufour и Cabelli; Bagley и Seidler), однако клебсиеллы с этим свойством обнаружены также в санитарно-благополучных объектах (Duncan и Razzel). Факт, что 100% клебсиелл, выделяемых из клинического материала, способны расти в среде ЕС при 44,5°С, но без выделения газообразных продуктов, явился основанием для Dufour и Cabelli считать, что «термотолерантные» клебсиеллы могут быть определены как ФКП. Однако, по мнению Bagley и Seidler, еще нет достаточного повода для этой гипотезы, так же как большой процент индол-положительных клебсиелл в окружающей среде сравнительно с выделяемыми из кишечника не может позволить судить о фекальном происхождении клебсиелл.

Все изложенное свидетельствует о том, что Ц + КП, в частности клебсиеллы, не могут быть исключены из категории ФКП. однако нет ясности в вопросе о критериях, которыми следует руководствоваться при определении их фекального происхождения. Пока можно принять в качестве рабочей гипотезы способность их развиваться в средах с ингибиторами при 44,5°С (как показали наши исследования, аналогичные результаты получаются при температуре 43°С), с продукцией газа при ферментации лактозы, а возможно, и без этого признака, наличие уреазной активности и принадлежность к роду Klebsiella как наиболее вероятному (после Е. coli) показателю биологического загрязнения.

Специальные среды и методы, применяемые в настоящее время для выявления и количественного учета ФКП — метод Мак-Кензи, среда ЕС, инкубируемые при 44,5 С, и борнокислый лактозо-буферный бульон (инкубация при 43°С) в основном рассчитаны на обнаружение и количественный учет фекальных Е. coli, особенно метод Мак-Кензи, включающий дополнительное определение продукции индола. Следовательно, проблема одновременного с Е. coli обнаружения фекальных Ц+КП остается при использовании этих сред нерешенной. Как указано выше, способность развиваться в ингибиторной среде при повышенной температуре инкубации еще не может сама по себе свидетельствовать о фекальном происхождении Ц+КП, поскольку штаммы с этим свойством выявлены в санитарно-благополучных объектах (Duncan и Razzel). Эта способность — лишь первый признак принадлежности Ц + КП и ФКП. Поскольку основным показателем биологического загрязнения является Е. coli, пробирки со средой Мак-Кензи (или нашей модификацией), в которых образовался газ, и наличие положительной реакции на индол (в рекомендованной нами среде эти два признака определяются в одной пробирке) не требуют дальнейшего уточнения родовой

принадлежности. Отсутствие положительной реакции на индол при наличии газа, индол при отсутствии газа и даже рост в среде без образования газа и индола обусловливают необходимость дальнейшей идентификации. При этом следует учесть, что к ФКП могут быть отнесены и безындольные Е. coli, последующая идентификация которых нужна. Из тестов, имеющихся в нашем распоряжении, следовало отобрать такие, которые подтверждали бы принадлежность развившегося в ингибиторной среде штамма к группе кишечных палочек и выявляли бы родовые признаки, в данном случае приобретающие значение (выявление клебсиелл, например, повышает шансы на квалификацию штамма как ФКП). Помимо широко известного набора тестов ИМАЦ (индол, реакция с метиловым красным, продукция ацетоина и цитратный тест), в последнее время для дифференциации лактозоположи-тельных кишечных палочек приобретает значение ассортимент тестов СОПЦ, в котором цитратный признак — общий с набором ИМАЦ, а остальные — сероводород, орнитин-декарбоксилаза, подвижность, более четко дифференцируют кишечные палочки на составляющие их роды (Wolfe и Amsterdam; Bascomb и соавт.; Closs и Digranes). В частности, этот дополнительный набор тестов легко дифференцирует клебсиелл от энтеробактеров, не отличимых по набору ИМАЦ. Из многочисленных комбинаций этих признаков мы остановились на индольном и цитратном тестах, определении подвижности и реакциях с метиловым красным и на ацетоин, добавив определение уреаз-ной активности. Исключили мало полезный в данном случае сероводородный признак и декарбоксилирование орнитина — тест хотя и полезный, но малодоступный в настоящее время для практических лабораторий. Однако и тот набор тестов, который мы считали необходимым, достаточно велик, чтобы его рекомендовать для повседневного применения в практических лабораториях.

Следовало или сократить число тестов, или пытаться их комплек-сировать, что представлялось более целесообразным. После многочисленных вариантов в эксперименте и натурных исследованиях мы остановились на следующих комбинациях тестов.

Совмещение в одной пробирке реакции с метиловым красным по Кларку

и определение ацетоина методом Баррита. Это комбинация описана в руководстве Cowan и Steel. Среду Кларка (обычный состав) мы рекомендуем для ускорения (обычно реакции ставят после 48-часовой инкубации при 37°С) разливать в пробирки по 1 мл. После 24-часовой инкубации при 37°С определяли реакцию с метиловым красным, а после учета результата ставили реакцию на ацетоин (по Барриту), которую учитывали через 5—10 мин на протяжении до 1 ч при комнатной температуре.

Совмещение в одной пробирке цитратного теста и продукции индола. Посев проводили на среду Симмонса (обычный состав). После суточной инкубации при 37СС — учет результатов и независимо от наличия или отсутствия роста по поверхности среды наливали 1 мл 0,05% раствора триптофана, 0,1% раствора пептона, 0,5% раствора К2НР04 в воде, тщательно встряхивали, чтобы смыть все с поверхности среды, после 4-часовой инкубации при 37°С определяли наличие индола реактивом Ковача.

Определение подвижности в полужидком (0,2%) агаре. Можно совместить с ферментацией лактозы или при наличии орнитина с реакцией на ор-ннтин-декарбоксилазу по Durand и Blazevic. Попытка сочетать определение подвижности с изменением уреазной активности не дала четких результатов: у всех штаммов наблюдалось щелочение верхнего слоя среды, хотя после нескольких дней пребывания при комнатной температуре резкое щелочение всего столбика среды свидетельствовало о наличии уреазы. Пробирка с полужидким агаром может служить и для сохранения штамма.

Определение уреазной активности. Из двух экономных и быстрых методов — Taylor и Fuscol — мы предпочли первый: на среду (питательный агар с 2% мочевины и индикатором феноловым красным) в чашке наносили культуру (обычно с поверхности полужидкого агара) в виде бляшки на пло-

щади 1 см2. На одной чашке можно определить уреазную активность до 16 штаммов. Учет проводили после 5—6-часовой инкубации при 37°С.

Контрольный посев в среду ФКП-1 и инкубация при 43°С на водяной бане для подтверждения развития и образования газа.

Схема исследования фекальных кишечных палочек следующая:

Первый этап. Посев в среду предобогащения (лактозо-пептон-ную среду), инкубация 18—20 ч при 37°С в 2 или 3 рядах десятикратных разведений.

Второй этап. Учет пробирок, в которых образовался газ, определение индекса бактерий группы кишечных палочек (БГКП). Пересев из положительных пробирок в среду ФКП-1, инкубация 20—22 ч при43°С на водяной бане, предварительно нагретой до той же температуры. Между пробкой и стенкой пробирок помещаются реактивные бумажки на индол.

Третий этап. Учет пробирок, в которых образовался газ, и положительных реактивных бумажек на индол. При наличии газа и индола — учет результатов и определение индекса фекальных Е. coli. При отсутствии изменения цвета реактивной бумажки — из этих пробирок, как и из пробирок, в которых отсутствует газ, но имеется помутнение, высев на среду Эндо, после чего постановка реакции на индол реактивом Ковача. При положительной реакции — перерасчет индекса Е. coli.

Четвертый этап. Определение характера колоний на среде Эндо. При наличии однородного характера всех колоний (чистая культура) отсев по 1—2 колонии последовательно в среду Кларка, на среду Симмонса и в полужидкий агар. При наличии разнородных колоний на среде Эндо — отсев по 1—2 колонии каждого типа. Инкубация отсевов при 37°С в течение 16—18 ч (среды Кларка —24 ч).

Пятый этап. Учет роста на среде Симмонса и прибавление реактива с триптофаном. Через 4 ч пребывания при 37°С — реакция на индол реактивом Ковача. Учет подвижности в полужидком агаре и отсев бляшками на мочевинную среду в чашке для определения уреазной активности. К концу рабочего дня — реакция с метиловым красным и на ацетоин в среде Кларка.

Эта схема в ее второй части (идентификация выделенных культур) была применена нами в нескольких лабораторных исследованиях на чистых культурах и в 7 сериях натурных исследований. На среду Эндо высевали во всех положительных случаях из пробирок с лактозо-пептонной средой, средой ФКП-1 и других сред, принятых для сравнения, независимо от наличия или отсутствия газообразования. Всего определено около 400 культур. Поскольку комбинацию реакции с метиловым красным и определения ацетоина в среде Кларка мы применяли раньше и она рекомендована зарубежными исследователями, сравнительную оценку ее проводили выборочно и во всех случаях результаты совпадали. Точно так же не требовало сравнительной оценки определение уреазной активности по Тейлору. Вновь разработанный метод комплексного обнаружения цитратного признака и продукции индола был проверен параллельно с определением индола в бульоне на 224 выделенных из среды обогащения и ингибиторных сред штаммах (147 цитрат-отрицательных и 77 цитратположительных).

Большая чувствительность реакции на индол в предлагаемом нами комплексном определении объясняется, видимо, наличием в дополнительном растворе триптофана. Особенно это сказывалось у цитратположительных штаммов благодаря массивной концентрации микробов в растворе триптофана. Проверка показала, что во всех этих случаях реакция на индол была специфичной, проявляясь в бульоне иногда на 2-е сутки.

Несомненно, что основным представителем ФКП, как показали наши исследования, являются Е. coli. Казалось бы, первичное определение наличия их при применении нашей модификации метода Мак-Кензи (в среде

ФКП-1) при 43°С достаточно и дальнейшее уточнение может мало изменить конечные результаты (в большинстве случаев так оно и есть). Выявление дополнительно Ц+КП фекального происхождения может изменить индекс в сторону увеличения на доли логарифма, редко — на 1 порядок. Однако в нашей практике встречались случаи, когда дополнительное выявление Ц+КП фекального происхождения резко меняло картину и приближало ее к санитарной ситуации, складывающейся в данном биотопе.

Выводы

1. Цитратположительные кишечные палочки могут обладать признаками, указывающими на их фекальное происхождение, и в особых случаях следует применять их идентификацию.

2. Разработана схема идентификации кишечных палочек на основании определения основных диагностических признаков в трех пробирках с дополнительным экспрессным методом измерения уреазной активности.

3. Наиболее достоверными индикаторными БГКП после Е. coli являются клебсиеллы.

ЛИТЕРАТУРА. Bagley S., Seidler R. — Appl. environm. Microbiol., 1977, v. 33, p. 1141 — 1148. — В a s с о m b S. et al. — J. gen. Microbiol., 1971, v. 66, p. 279—295. — С 1 о s s O., Digranes A. — Acta path, raicrobiol. scand., Sect. В, 1971, v. 79, p. 673—678. — С о w a n S., Steel К. Manual for the Identification of Médical Bacteria. Cambridge, 1965, 1973. — D u f о u г А., С a -belli V. — J. Water Pollut. Contr. Fed., 1976, v. 48, p. 872—879. — Duncan D„ R a z г e 1 W. — Appl. Microbiol., 1972, v. 24, p. 933—938. — Durand A., Blaze v i с D. — Ibid., 1970, v. 19, p. 134—137. — Taylor W. — Am. J. clin. Path., 1958, v. 30, p. 361—363. —Fuscoe F. — Med. Labor. Technol., 1974, v. 31, p. 247— 252. — Wolfe M., Amsterdam D. — Appl. Microbiol., 1968, v. 16, p. 1528— 1531.

Поступила 30/XI 1977 r.

УДК 576.851.48.07:637.»

Проф. И. С. Загаевский

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДА ИНДИКАЦИИ БАКТЕРИЙ ГРУППЫ КИШЕЧНЫХ ПАЛОЧЕК В МОЛОКЕ И ДОИЛЬНОМ ОБОРУДОВАНИИ

Сельскохозяйственный институт, г. Белая Церковь

Сложность и многоэтапность исследований молока и молочных продуктов с целью установления степени обсемененности его кишечными палочками затрудняют проведение систематического бактериологического контроля и вынуждают ограничиваться средой Кесслер, недостаточно информативной при учете реакции.

В связи с этим актуальной задачей является разработка ускоренных методов индикации кишечных палочек, которые позволяли бы в короткий срок давать ответ о санитарном состоянии молока, молочных продуктов, доильного инвентаря и оборудования, предприятий молочной промышленности.

Для индикации в молоке и молочных продуктах кишечных палочек и определения коли-титра хорошие результаты по чувствительности, элективным, дифференцирующим и демонстративным свойствам получены с предложенной нами средой ПЖ-65 следующего состава: лактозы 20 г, фосфорнокислого калия (двузамещенного) 3 г, питательного агара (в порошке) 50 г, стерилизованной желчи крупного рогатого скота 100 мл, 1 % спиртового раствора бриллиантового зеленого 2 мл. Указанные компоненты растворяют при подогреве и помешивании в 900 мл дистиллированной воды, устанавливают рН 7,4—7,5, разливают столбиком в пробирки по 5 мл, прогре-