CC BY
664
ИЗВЕСТИЯ
ПЕНЗЕНСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО ПЕДАГОГИЧЕСКОГО УНИВЕРСИТЕТА имени В. Г. БЕЛИНСКОГО ЕСТЕСТВЕННЫЕ НАУКИ № 14 (18) 2009
IZVESTIA
PENZENSKOGO GOSUDARSTVENNOGO PEDAGOGICHESKOGO UNIVERSITETA imeni V. G. BELINSKOGO NATURAL SCIENCES № 14 (18) 2009
УДК 577.3
МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОБЩЕЙ ПЕРЕКИСЬ РАЗРУШАЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ РАСТЕНИЙ
© А. К. ВЕЛИЧКО, В. Б. СОЛОВЬЕВ, М. Т. ГЕНГИН Пензенский государственный педагогический университет им. В.Г.Белинского,
кафедра биохимии е-mail: [email protected]
Величко А. К., Соловьев В. Б., Генгин М. Т. - Методы лабораторного определения общей перекись разрушающей активности ферментов растений // Известия ПГПУ им. В.Г. Белинского. 2009. № 14 (18). С. 44-48. -
Проанализированы три метода определения общей перекись разрушающей активности ферментов растений. При оценке параметров быстроты и воспроизводимости показано, что в качестве экспресс анализа можно использовать спектрофотометрический и колориметрический методы. Воспроизводимость колориметрического метода выше, однако значения полученные при его использовании не соотносимы с другими методами. Ключевые слова: активность ферментов растений, колориметрия, спектрофотометия
Velichko A. К., Solovev V. B., Gengin M. T. - Methods of laboratory definition of the common peroxide of destroying activity of enzymes of plants // Izv. Penz. gos. pedagog. univ. im.i V.G. Belinskogo. 2009. № 14 (18). С. 44-48. -
Three methods of definition of the common peroxide of destroying activity of enzymes of plants are analyzed. On the strength of parameters of speed and reproducibility it is shown, that by way of the rapid analysis can be used spectrophotometry and colorimetric methods. Reproducibility colorimetric analysis is higher; however finding by this method is not numerically equivalent to other methods.
Keywords: activity of plant enzymes, colorimetry, spectrofotometry
В исследованиях, связанных с изучением действия тех или иных факторов на растения большое внимание уделяется измерению активности ферментов антиоксидантных систем. Чаще всего при экспериментах такого рода анализируется динамика изменения активностей каталазы [EC 1.11.1.6], L-аскорбат-перок-сидазы (АПО) [EC 1.11.1.11], супероксиддисмутазы [EC 1.15.1.1] и пероксидазы [EC 1.11.1.7].
Среди антиоксидантых ферментов каталаза является одним из наиболее эффективных, на что указывает её число оборотов - 108/мин [30]. В связи с этим, изменение активности фермента в модельных экспериментах является часто демонстрируемым параметром ответной реакции организма на действия различных факторов. Методы определения каталазы не трудоёмки и воспроизводимы практически в любой лаборатории. В литературе наиболее распространены три методики определения активности этого фермента:
- Спектрофотометрический метод Beer and Sizer [9-11, 13, 14, 16-18] и т.д., основанный на убыли оптической плотности в области светопоглощения перок-сида водорода при 240 нм.
- Перманганатометрический метод А.Н.Баха [6], наиболее распространенный в физиологии и биохимии растений и позволяющий определять количество
Н202 оставшейся в реакционной среде после действия фермента титрованием КМп04.
- Колориметрический метод Королюка М.А. [5, 23, 24, 29], основанный на способности Н202 образовывать с молибдатом аммония окрашенный комплекс [5] имеющий максимум поглощения при 410 нм.
Однако ни в одном из вышеприведённых методов не предполагается использование специфического ингибитора каталазы. С точки зрения энзимологии некорректно утверждать, что при использовании таких методических подходов (основанных на регистрации убыли концентрации перекиси в инкубационной смеси в результате ферментативной реакции) измеряется активность именно каталазы, так как деструкцию н2о2 могут осуществлять и другие антиоксидантные ферменты, к примеру: NADH-пероксидаза [ЕС 1.11.1.1], NADPH- пероксидаза [ЕС 1.11.1.2], цитохром с перок-сидаза [ЕС 1.11.1.5], пероксидаза [ЕС 1.11.1.7], глута-тион пероксидаза [ЕС 1.11.1.9], Е-аскорбат пероксидаза [ЕС 1.11.1.11], и др. Поэтому далее в тексте понятие активности каталазы, будет заменено понятием общей активности перекись разрушающих ферментов.
В большинстве работ, в которых регистрируется этот вид ферментативной активности, приходится проводить значительное количество измерений, поэтому
метод подбирается из соображений быстроты и воспроизводимости (экспресс-анализ). Целью настоящей работы явилось сравнительное исследование методов лабораторного анализа общей перекись разрушающей активности ферментов экстракта растительных клеток и определение возможности использования этих методов в качестве экспресс-анализа.
материалы и методика
Ферментативный препарат получали растиранием навески растительного материала (корневища Solanum Tuberosum) (2 г) в ступке с 10 мл охлажденного 50 мМ фосфатного буфера рН=7,0. Гомогенат фильтровали через полотно и центрифугировали при 12000 g 20 мин при 40С.
Общую перекись разрушающую активность ферментов определяли тремя способами:
Спектрофотометрический метод Beer, Sizer: Измерения проводили против контрольной пробы, не содержащей перекиси. общая схема метода представлена в табл. 1.
таблица 1.
схема определения общей перекись разрушающей активности спектрофотометрическим методом Beer, Sizer
опыт контроль
0,9 мл 50мМ фосфатного буфера, рН=7,0 1,9 мл 50мМ фосфатного буфера, рН=7,0
1мл 0,1% Н202
Измерить D0 при 240 нм.
100 мкл препарата фермента 100 мкл препарата фермента
Измерить D1 при 240 нм
Оптическую плотность D1 измеряют через 30 с - 1,5 мин (в зависимости от активности фермента в пробе) после добавления экстракта на спектрофотометре СФ-2000.
Перманганатометрический метод Баха А.Н. был реализован по схеме приводимой в табл. 2:
таблица 2.
схема определения общей перекись разрушающей активности перманганатометрическим методом Баха.
опыт контроль
5 мл препарата фермента 5 мл препарата фермента
— 3 мл 10% H2S04
10 мл 0,1% Н202 10 мл 0,1% Н202
Инкубация 30 мин при комнатной температуре
3 мл 10% H2S04 —
Титровать 0,02 М КМп04
Колориметрический метод Королюка М.А.
Метод основан на способности перекиси образовывать с молибдатом аммония окрашенный комплекс [5].
Определение перекись расщепляющей активности проводилось модифицированным методом, схема которого представлена в табл. 3.
Оптическую плотность измеряли при 405 нм на ФЭК «Флюорат»-02 АБЛФ-Т, против холостой пробы.
Ферментативную активность выражали в ммоль субстрата (Н2О2) расщепленного за 1 минуту инкуба-
1 * л C (Pd)
ции, на 1 мг белка: А =-,
t х C(p) х V
где C(pd) - концентрация перекиси в мМ, t - время инкубации в мин, С(р) - концентрация белка в мг/мл, V - объём пробы в мл.
Концентрацию белка в пробах определяли по методу Breadford [7].
результаты и обсуждение
Для определения активности каталазы методом Королюка обычно используют фосфатный буфер. Однако молибдат или парамолибдат аммония дает интенсивную реакцию на фосфаты:
(NH4)6Mo7O24 х 4Н2О+ HpO4^(NH)3 Р04 х 12MoO3 х 6 Н2О
Для устранения этого эффекта необходимо использовать Tris-HCl буфер (рН=7,0). Также чувствительность молибдата к ионам Р043- позволяет снизить его растворение не в HN03 или HCl, как указано в [3, 8], а в H2S04. Тем более что его растворимость в H2S04 намного выше, чем в HN03.
В методе Королюка используется молибдат аммония (NH4)2Mo04, однако нами был применен пара-молибдат (NH4)6Mo7024 х 4Н2О. При взаимодействии парамолибдата аммония растворённого в кислоте (в работе использовалась H2S04) с Н2О2 образуется комплекс пероксомолибдата [4] имеющий максимум поглощения при 410 нм.
(NH4)6Mo7O24 х 4Н2О+ HßO4^(NH)ßO4 х 12MoO3 х 6 Н2О MoO + Н2О2^ MoO8 (MoO, MoO) [1]
Ферментативная активность растительного экстракта рассчитывалась по уменьшению интенсивности окраски пероксомолибдата, с последующим расчётом концентрации Н2О2 по логарифмической (рис.1) и линейной (рис.2) калибровочным кривым.
Математические уравнения калибровочных графиков выглядят следующим образом: D = 0,0437 + 35,7562 х C (H 2O2) - для линейного D = 3,1953 +1,0954 lg C (H 2O2) - для логарифмического где D - оптическая плотность, С Н2О2 - концентрация пероксида водорода.
Было определено, что оптимальная концентрация парамолибдата аммония для обеспечения достоверной чувствительности метода (min-0,0005% Н2О2, max-0,8% до выхода калибровочного графика на плато) - 4%, растворённого в 10% H2S04. Выявлено, что концентрация H2S04 (проверено 10%, 18,5% (ориги-
таблица 3.
схема определения общей перекись разрушающей активности колориметрическим методом королюка.
опыт контроль Холостая проба
0,9 мл 50мМ фосфатного буфера, рН=7,0 1мл 50мМ фосфатного буфера, рН=7,0 2 мл 50мМ фосфатного буфера, рН=7,0
1мл 0,1% Н202 1мл 0,1% Н202
100 мкл препарата фермента — —
Инкубация 1 мин при комнатной температуре
1 мл 4% парамолибдата аммония на 10% H2So4 100 мкл препарата фермента 1 мл 4% парамолибдата аммония на 10% H2So4
-- 1 мл 4%парамолибдата аммония на 10% Н2^4 --
Измерить D при 405 нм.
Концентрация Н 202, %
Рис. 1. Логарифмический калибровочный график дляопределенияконцентрацииН2О2.
Концентрация Н202, %
Рис. 2. Линейный калибровочный график для определенияконцентрацииН2О2.
нальная по Королюку), 25%, 35%) не влияет на чувствительность анализа и на степень растворения па-рамолибдата аммония. Для определения активности была выбрана минимальная - 10%.
Также как в методе Королюка, при спектрофо-тометрическом определении перекись разрушающей активности, конечную концентрацию пероксида в реакционной смеси рассчитывали по логарифмической (рис.3) и линейной (рис.4) калибровочным кривым.
Математические уравнения калибровочных графиков выглядят следующим образом: Б = 4,3449 + 3,0597^ С (Н202) - для логарифмического Б = -0,3412 +16,0866 х С (Н202) - для линейного
Результаты измерений общей перекись разрушающей активности растительного экстракта и активность чистой каталазы представлены в табл. 4.
0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22 0,24 0,26 0,28 0,30 0,32
Концентрация Н202, % Рис. 3. Логарифмический калибровочный график для определения концентрации Н2О.
Концентрация Н202, % Рис. 4. Линейный калибровочный график для определения концентрации Н2О.
таблица 4.
общая перекись разрушающая активность растительного экстракта и чистого препарата каталазы.
объект тип калибровки спектрофотометрический метод колориметрический метод метод Баха А.н.
Чистый Фермент, мМ/мин X мг Log 7875 + 287,1 126,458 + 0,271 7936,5 + 102,3
Цпе 6126,79 + 322,73 98,875 + 0,136
Экстракт, мМ/мин X мг Log 72,3 + 4,32 0,9 + 0,0213 80,1 + 2,522
LiM 58,8 + 9,215 0,65 + 0,193
Было выявлено, что по числовым значениям показатель активности, полученный спектрофотомет-рическим методом максимально близок к таковому у метода Баха, который был принят за эталонный. Однако стандартное статистическое отклонение для метода Beer and Sizer имеет значительно больший показатель, чем для метода Королюка. Колориметрический метод обладает лучшей воспроизводимостью, однако численные показатели активности при его использовании в несколько десятков раз отличаются от значений, полученных другими методами, что объясняется их различной чуствительностью.
Вариационный разброс значений активностей, выражаемый стандартным отклонением, можно уменьшить, использовав не линейную, а логарифмическую калибровочную кривую, как для спектрофотометричес-кого, так и для колориметрического методов. Таким образом, спектрофотометрический и колориметрический методы можно применять в качестве экспресс анализа общей перекись разрушающей активности. Оба достаточно воспроизводимы и легки в исполнении. Воспроизводимость метода Королюка выше, однако, значения, полученные при его использовании, численно не соотносимы ни с методом Баха, ни с методом Beer and Sizer.
Для того чтобы перейти от общей перекись разрушающей активности к активности собственно ката-лазы, необходимо применение её специфичных ингибиторов. В литературе предлагается множество ингибиторов каталазы. Из них наиболее распространены:
2-меркаптоэтанол - для Beta vulgaris var. Cicla -50% ингибирование при 3 mM [12], для Zea mays - слабое ингибирование.
Cu2+ - для Beta vulgaris var. Cicla - 47% игибиро-вания при 0,2 mM [12].
ДТТ - Beta vulgaris var. Cicla - 50% ингибирование 10mM, для Lens culinaris [19] и Zea mays слабый ингибитор.
Fe2+ - для Beta vulgaris var. Cicla - 14% ингибиро-вания при 1,5 mM
Глутаровый альдегид - для Beta vulgaris var. Cicla -24% ингибирование при 8%.
KCN - для Beta vulgaris var. Cicla - 50% 0,65 mM, для Zea mays - сильный ингибитор.
Аспарагиновая кислота - для Beta vulgaris var. Cicla - 92% при 30mM.
Глутаминовая кислота - для Beta vulgaris var. Cicla - 84% при 30 mM.
Mn2+ - для Beta vulgaris var. Cicla - 56% при
1 mM.
NaN3 - для Beta vulgaris var. Cicla - 50% при 0,0018 mM, для Zea mays - сильный ингибитор при 0,001mM.
SDS - Beta vulgaris var. Cicla - 50% при 0,01%.
Однако большинство из этих соединений неспецифично ингибируют каталазу. Так цианиды, азиды, меркаптоэтанол и дТТ дезактивируют ещё и перокси-дазу и аскорбатпероксидазу [15].
Специфичным для каталазы, сильным и необратимым ингибитором является 3-amino-1H-1,2,4-tri-azole [2]. Поэтому для дифференцированного определения активности каталазы рекомендуется использовать именно этот ингибитор, инкубируя с ним контрольную пробу, как при спектрофотометрическом, так и при колориметрическом методах анализа.
список ЛИТЕРАТУРЫ
1. Гринберг А. А. Введение в химию комплексных соединений. М, СПб.: Химия, 1966. С. 530-544.
2. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. М.: Мир, 1982. T. 1. С. 330-382.
3. Донсон Р., Элиот Д., Эддиот У. Справочник биохимика М.: Мир, 1991. С. 399.
4. Зубович И. А. Неорганическая химия М.: Мир, 1989. С. 180-181.
5. Киселёва Р. Е., Альба Н. В., Баршанова Г. С. Практикум по патобиохимии. учебное пособие для студентов заочного отделения. Саранск, 1998.
6. Кучеренко Н. Е., Бабенюк Ю. Д., Васильев А. Н. Биохимия практикум. М.: Высшая школа, 1988. С. 101.
7. Скоупс Р. Методы! очистки белков. М.: Мир, 1985. С. 342.
8. Смолин А. Н., Филиппович Ю. Б., Васильева Н. В. Практикум по общей биохимии. М.: Просвещение, 1969. С. 235.
9. Aebi H. // Methods in enzymology. 1984. № 105. P. 121-126.
10. Cepeda J. A., Millar M., Sheridan E. A., Warwick S. // Journal of clinical Microbiology. 2006. № 44. P. 1917-1918.
11. Cox D.L., Riley B., Chang P., Sayahtaheri S. // Applied and environmental microbiology. 1990. Vol. 56. № 10. P. 3063-3072.
12. Dincer A., Aydemir T. Purification and characterization of catalase from chard (Beta vulgaris var. cicla) // Enzyme Inhib. 2001. № 16. P. 165-175.
13. Drazkiewicz M., Skorzynska-Polit E., Wanke M. // Cellular and Molecular biology letters. 2003. № 8. P. 777-781.
14. Joharapurkar A. A., Wanjari M. M., Dixit P. V., Zambad S. P. // Indian Journal of Pharmacology. 2004. № 36. P. 355-359.
15. Koshiba T. // Plant Cell Physiol. 1993. № 34. P. 713-721.
16. Manca C., Paul S., Clifton E. B. // Infection and Immunity. 1999. Vol. 67. №1. P. 74-79.
17. Muralikrishnan D., Mohanakunar K.P. // The FABES Journal. 1998. № 12. P. 905-912.
18. Madigan S. J., Katz E. R. // Journal of Bacteriology. 1989. Vol. 171. № 3. P. 1492-1495.
19. Schiefer S., Teifel W., Kindl H., Hoppe-Seyler's Z. // Physiol. Chem. 1976. №357. P. 163-175.
20. Day W. A., Jaime L., Pitts T. M. // Infection and Immunity. 2000. Vol. 68. №11. P. 6337-6345.
21. Yong Zh., Griendling K., Dikalova A., Owens G., Taylor W. // American Heart Association Inc. 2005. № 46. P. 732-737.
22. Yoruk J. H., Demir H., Ekili K., Savran A. // Pakistan Journal of Nutrition. 2005. № 4. P. 8-10.
23. Асанов Э. О., Беликова М. В. // Биология старения. 2006. Т. 15. № 4. С. 285-290.
24. Лапоногов О. А., Сутковой Д. А., Кузьменко Д. А. // Бюллетень украинской ассоциации нейрохирурговю 1999. Вып. 1. № 8.
25. лукаткин А. С. // Физиология растений. 2002. Т. 49. № 6. С. 878-885.
26. Полесская О. Г., Хаширина Е. И., Алехина Н. Д. //Физиология растений. 2006. Т. 53. № 2. С. 207-214.
27. Семчишин Г. М., Лущак В. И. // Украинский биохимический журнал. 2004. Т. 76. № 3. С. 42-48.
28. Троицкая Г. Н., Жизнёвская Г. Я., Измайлов С. Ф. // Физиология растений. 2000. Т. 47. № 6. С. 821-828.
29. Курманалиева З. Б. Патофизиологические основы невынашивания беременности у женщин на фоне герпетической инфекции. Автореф. дисс. ... к.м.н. Бишкек, 2007.
30. Павловская Л. И. Интервальная нормобарическая гипокситерапия в комплексном санитарном лечении больных с хронической вертебрально-базилярной недостаточностью. Автореф. дисс. . к.б.н. Томск, 2006.
31. Панина Я. С. Модулирование индуцированной устойчивости и восприимчивости картофеля. Автореф. дисс. . к.б.н. М, 2005.
