CC BY
56
гребінчатих м'язів у вушках є особливим пристосуванням, яке при систулі призводить до утворення вихреподібних потоків крові, які накладуються на основний потік крові з передсердь в шлуночок, надаючи йому деяку турбулентність. Крім цього із-за наявності в лівому вушці багато численних тупикових порожнинних випинів умови для застійних явищ крові і тромбоутворення повинно бути більш виражено,чим в правому вушці.
Ключові слова: серце, передсердя, вушко,
гемодинаміка, тромб, кров, гребінчасті перекладини.
Стаття надійшла 22.02.2011 р.
device which in systole leads to the formation of vortex blood flow, superimposed on the basic flow of blood from the atria to the ventricles, giving him some turbulence. In addition, because of the presence in the left auricle of multiple dead-end cavities diverticulum’s conditions for stagnation of blood and blood clots should be more pronounced than in the right auricle of.
Key words: heat, atria, auricular, hemodynamics, thrombus, blood, pectinate muscles.
УДК 619;616.98:579.842.11:631.147
МЕТОДЫ ДЕТОКСИКАЦИИ ЭНТЕРОТОКСИНОВ ESCHERICHIA COLI
Показано, что эффективность детоксикации термолабильного и термостабильного энтеротоксинов Escherichia. coli, зависит от индивидуальных особенностей их молекул, которые следует учитывать при разработке оптимальных условий анатоксинобразования.
Ключевые слова: Escherichia coli, желудочно-кишечные заболевания, энтеротоксины, детоксикация, анатоксины.
Работа выполнена в рамках научно-исследовательской темы №76 задание 04.02.01.М, утвержденной Национальной академией аграрных наук Украины.
Желудочно-кишечные заболевания, которые вызывают энтеротоксигенные Escherichia coli, продолжают оставаться значимой проблемой во всех без исключения странах [1, 4, 5]. Вакцинация культуральными вакцинами не всегда предохраняет от болезни, что обусловлено рядом причин: бактериальные вакцины не содержат полного набора серовариантов E.coli; зачастую вместе с патогенностью теряется и иммуногенность вакцинирующих препаратов; избыток антигенов оказывает отрицательное влияние на реакцию иммунного ответа и т.д. [2]. В связи с этим представляет интерес использование для приготовления вакцин отдельных антигенов - факторов патогенности возбудителя. Такими факторами патогенности для E.coli являются энтеротоксины: термостабильный (ST) и термолабильный (LT) [6, 7, 8]. Одним из наиболее важных, для экспериментальных целей, биохимических свойств токсинов, является их способность при определенных условиях трансформироваться в анатоксин [3]. В связи с тем, что обезвреживание токсинов - непременное условием приготовления из них иммунизирующих препаратов, до недавнего времени внимание исследователей было обращено преимущественно на эту сторону анатоксинобразования. Между тем качественная характеристика препаратов целиком связана со степенью сохранения ими антигенной информации, и объяснение этого феномена имеет принципиальное значение.
Целью работы была разработка методов детоксикации энтеротоксинов E.coli и сравнении их эффективности.
Материал и методы исследования. Нативные термолабильный и термостабильный энтеротоксины Escherichia coli; 0,6 % раствор формальдегида; 0,0125 % раствор глутарового альдегида; рН-метр; термометр; термостат; белые беспородные мыши массой 14-16 г. Формольно-тепловая детоксикація: к раствору
энтеротоксинов (рН 7,0-7,2) дробно добавляли 0,3-0,2-0,1 % 0,6 % раствора формальдегида с интервалом в пять дней, температуре 37°С, рН 5,5-5,8 и экспозиции 10-17 суток. Глутаральдегидная детоксикация: к раствору энтеротоксинов (рН 7,0-7,2) добавляли 0,0125% раствор глутарового альдегида при температуре: 18-20 °С и 37 °С. Для контроля полноты детоксикации энтеротоксинов и их переход в анатоксины, белым беспородным мышам интраперитонеально вводили 0,5 мл отдельно LT- и ST-анатоксины в количестве: 0,25, 0,50, 1,00, 2,00 мкг/мл. Дозу анатоксина считали безвредной при полном отсутствии летального эффекта у зараженных животных, в течение 7 дней наблюдения. Контрольным мышам инъецировали нативные энтеротоксины E.coli в таких же дозах. Иммунизирующие дозы (ИМД50) анатоксинов E.coli вычисляли по формуле:
lg ИМД50 = lg DN - с (ELi - 0,5), где DN - наибольшая из испытанных доз; с - логарифм отношения каждой последующей дозы к предыдущей (при двукратном интервале эта величина равна 0,3); Li - отношение числа выживших от данной дозы животных к общему количеству животных, которым была введена эта доза; ELi - cумма всех значений Li для всех испытанных доз. Антигенные свойства анатоксинов определяли в реакции термофлокуляции. Для этого в
отдельные пробирки разливали возрастающие количества антитоксической сыворотки к ST- и LT-анатоксинам:
0,1-0,5 мл и добавляли, раздельно по 2 мл ST- и LT- анатоксинов гомологичных штаммов E.coli. Содержимое пробирок встряхивали и нагревали до 40-45 °С на водяной бане. Учет вели в течение суток. Положительной считали реакцию в случае выпадения мелких хлопьев (+, ++) и осаждение их на дне пробирки (+++), а также в случае полного просветления жидкости (++++). Иммуногенную активность LT- и ST- анатоксинов определяли в опыте на белых беспородных мышах, методом подкожной (в область спины) инокуляции различных доз препаратов: 0,05, 0,1, 0,2, 0,4, 0,8 мл, с последующим заражением их летальными дозами культур токсигенных штаммов E.coli. В контроле использовали не иммунизированных анатоксинами животных.
Результаты исследования и их обсуждение. Установили, что подобранные режимы детоксикации ЦГ-и ST-энтеротоксинов E.coli с помощью формольно-теплового метода приводили к их полному обезвреживанию (отсутствию летального эффекта у зараженных мышей), при 100% гибели животных в контроле, (табл. 1).
Таблица 1
Количество мышей выживших после иммунизации анатоксинами E.coli, полученными методом
формольно-тепловой детоксикации
Исследуемый антиген Количество мышей Доза антигена Учет падежа по дням Выжило мышей
в опыте (мкг/мл) 1 2 3 4 5 6 7 (%)
3 0,25 100
LT- 3 0,50 100
анатоксин 3 1,00 100
3 2,00 100
Контроль: 3 0,25 2 33,3
LT-энтеротоксин 3 0,50 2 1 0
3 1,00 3 0
3 2,00 3 0
3 0,25 100
ST- 3 0,50 100
анатоксин 3 1,00 100
3 2,00 100
Контроль: 3 0,25 2 1 0
ST-энтеротоксин 3 0,50 3 0
3 1,00 3 0
3 2,00 3 0
Сравнение длительности детоксикации энтеротоксинов E.coli, при использовании различных методов обезвреживания показало, что наиболее быстрой была детоксикация с помощью 0,0125% раствора глутаральдегида при 18-20 °С, которая позволила сократить время на анатоксинобразование до 2 дней в сравнении с обработкой глутаральдегидом при 37 °С (7 дней) и формольно-тепловым методом (17 дней). В процессе обезвреживания ЦГ-энтеротоксина практически все его количество модифицировалось в анатоксин. При обезвреживании ST - большая часть его антигенной активности утрачивалась (табл.2).
Таблица 2
Степень флокуляции анатоксинов E.coli, полученных формольно-тепловым методом, в реакции с
гомологичными антисыворотками.
Исследуемый антиген Доза антигена (мл) Количество сыворотки (мл) Степень флокуляции (в баллах)
2 0,1 -
ST-анатоксин 2 0,2 -
2 0,3 -
2 0,4 -
2 0,5 +
2 0,1 ++
LT-анатоксин 2 0,2 ++++
2 0,3 ++++
2 0,4 ++++
2 0,5 ++++
Установили, что LT-анатоксин E.coli обладал иммуногенными свойствами (табл.3). Тогда как ST-анатоксин проявил низкую иммуногенную активность (табл.4).
Таблица 3
Количество иммунизированных LT- анатоксином мышей, выживших после заражения культурой
гомологичного токсигенного штамма E.coli
Иммунизирующая доза (мл) Заражено мышей после иммунизации Доза заражения КУЕ/мл Выжило мышей (%)
0,05 10 1 х 109 10
0,1 10 1 х 109 20
0,2 10 1 х 109 40
0,4 10 1 х 109 50
0,8 10 1 х 109 80
Контроль 10 1 х 109 0
Таблица 4
Количество иммунизированных 8Т- анатоксином мышей, выживших после заражения культурой
гомологичного токсигенного штамма Е.еоИ
Иммунизирующая Доза (мл) Заражено мышей после иммунизации Доза заражения КУЕ/мл Выжило мышей (%)
0,05 10 І x Ю9 0
0,1 10 І x Ю9 0
0,2 10 І x Ю9 0
0,4 10 І x Ю9 0
0,8 10 І x Ю9 10
Контроль 10 І x Ю9 0
1. На основании полученных результатов энтеротоксины E.coli по чувствительности к действию формалина и тепла были разделены на две группы - формалинстабильную и формалинлабильную. В процессе обезвреживания формалинстабильного токсина практически все его количество модифицировалось в анатоксин. При обезвреживании формалинлабильного - модифицировалось лишь незначительное количество токсина. К первой группе отнесли LT-энтеротоксин, характеризовавшийся высоковыраженной устойчивостью к действию формалина и тепла. Ко второй группе - ST-энтеротоксин, с высокой неустойчивостью к действию этих агентов, в связи с чем детоксикация его сопровождалась большой потерей антигенной активности. 2. Наиболее быстрым был метод детоксикации с помощью 0,0125% раствора глутаральдегида при 18-20 °С, который позволил сократить время на анатоксинобразование до 2 дней в сравнении с обработкой глутаральдегидом при 37 °С (7 дней) и формольно-тепловым методом (17 дней. Исследования показали бесперспективность получения иммунизирующего препарата на основе ST-анатоксина E.coli.
Перспектива исследований в данном направлении направлены на конструирование препаратов на его основе, которые обладали бы антигенными и иммуногенными свойствами.. Полученные результаты будут использованы при разработке технологии получения анатоксинов E.coli в условиях биофабричного производства.
^У/уШ^ШаУ////////////////////////^
1. Малов В. А. Острые инфекционные диарейные заболевания /В. А. Малов, А. Н. Горобче нко // Лечащий Врач.- 2005.- № 2.- С. 6-8.
2. Олійник Л.В. Розповсюдження ешерихій та оцінка їх патогенного потенціалу / Л.В. Олійник // Ветеринарна медицина: Міжвідомчий тематичний науковий збірник. - Харків, 2004. -№83. -С. 167-170.
3. Караев Я.М. Протективные и иммуногенные свойства эшерихиозного анатоксина / Я.М. Караев // Автореферат диссер.на соиск. уч ст. к. вет н.-16.00.03.-Краснодар.-2008.-25 с.
4. Терехов В.И. Эшерихиоз поросят и его профилактика / В.И. Терехов, Н.В.Колесникова, Я.М. Караев // Ветеринария Кубани. -2006. -№2. -С. 5.
5. Шахов А.Г. Этиология и пофилактика желудочно-кишечных и респираторных болезней телят и поросят /А. Г. Шахов //Ветеринарный консультант.- 2003.- №1.- С.4-5.-Библиогр.: с. 19.
6. Шпонько Ю.Б. Совершенствование методов лечения и профилактики эшерихиоза поросят / Ю.Б. Шпонько // Ветеринарная патология, 2007. - №1. - С. 20-23.
7. In Vitro Antimicrobial Susceptibility Testing of Bacterial Enteropathogens Causing Traveler's Diarrhea in Four Geographic Regions / H.Gomi, Z.-D.Jiang [et all.] //Antimicrob. Agents Chemother.- 2001.- 45.-P. 212-216.
8. Thielman N. M., Acute infectious diarrhea / N. M.Thielman, R. L.Guerrant // N. Engl. J. Med.-2004.-V.350 (1).-P.38-47.
МЕТОДИ ДЕТОКСИКАЦІЇ ЕНТЕРОТОКСИНІВ METHODS OF DETOXIFICATION
ESCHERICHIA COLI ENTEROTOXIN ESCHERICHIA COLI
Сухарєв Ю.С., Гужвинська С.О. Sukharev Y.S., Guzhvinskaya S.A.
Показано, що ефективність детоксикації It is shown that the efficiency of detoxification
термолабільного і термостабільного ентеротоксинів of heat-lability and thermo stability enterotoxins
Escherichia coli, залежить від індивідуальних Escherichia coli, depends on the individual characteristics
особливостей їх молекул, які слід враховувати при of their molecules, which should be considered in the
розробці оптимальних умов анатоксиноутворення. development of optimal conditions creation of toxoids.
Ключові слова: Escherichia coli, Key words: Escherichia coli, enterotoxins,
ентеротоксини, детоксикація, анатоксини. detoxification, toxoids.
Стаття надійшла 10.02 2011 р.
