CC BY
125
УДК 636.083:(619:579)
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ДЕЙСТВИЯ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ E.COLI ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ДИСБАКТЕРИОЗЕ И ТОКСИКОИНФЕКЦИИ
Ю.Е. КОЗЛОВСКИЙ, кандидат биологических наук, зав. лабораторией
НИИ пушного звероводства и кролиководства имени В.А. Афанасьева Россельхозакадемии
A.Н. ОВЧАРОВА, младший научный сотрудник НИИ морфологии человека РАМН
B.А. ПЕТРОВА, младший научный сотрудник
И.В. ПЛУГИНА, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник
C.А. ПУСТОВАЛОВ, младший научный сотрудник НИИ пушного звероводства и кролиководства имени В.А. Афанасьева Россельхозакадемии
А.Ю. ПЕТНИКОВ, младший научный сотрудник Т.И. ХОМЯКОВА, кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник
А.Д. МАГОМЕДОВА, младший научный сотрудник Н.Ф. ЧЕРТОВИЧ, младший научный сотрудник НИИ морфологии человека РАМН E-mail: niipzk@mail.ru
Резюме. Исследования проводили с целью сравнительного изучения влияния пробиотика, разработанного на основе индигенного штамма Escherichia coli EB 387, имеющего более высокие адгезивные свойства и способного к продукции микроцина С51, и пробиотика E.coli М17при индуцированном антибиотиками дисбактериозе и токсикоинфекции.
Для моделирования экспериментального дисбактериоза использовали канамицин и тетрациклин в терапевтических дозах (перорально 250 мг/кг ежедневно в течение 14 дн.). Далее в течение 14 дней животные I группы получали препарат на основе штамма E.coli EB 387, II группы - штамм E.coli М17. Затем из групп I и II выделили по 5 голов (соответственно группы III и IV), которым для определения протективного действия изучаемых штаммов перорально однократно давали энтеротоксигенный штамм E.coli EB 120, продуцирующий цитотонический термолабильный токсин эшерихий (1x10я КОЕ/гол.). Приживаемость пробиотических штаммов в ЖКТ животных всех групп устанавливали через 45 дней. Контрольная группа на протяжении периода исследований получала физиологический раствор. После завершения каждого этапа проводили анализ просветной микрофлоры.
Штамм E. coli EB 387способствует более эффективному восстановлению всех изученных компонентов структуры микрофлоры после действия антибиотиков, при этом наиболее значимо влияние в отношение энтерококков. Штамм E.coli М17 не оказывает протективного действия при введении токсигенного штамма Ecoli ЕВ120, которое вызвало гибель 100 %животных, тогда как при использовании препарата на основе бактерий E. coli EB387отмечена не только 100 %-ная выживаемость, но и восстановление ряда компонентов просветной микрофлоры в короткие сроки. В более отдаленные сроки при использовании пробиотика на основе E. coli EB387отмечено повышение уровня лактозоферментирующих эшерихий и уменьшение уровня неферментирующих эшерихий ниже определяемого. Повреждения, вызванные штаммом E.coli ЕB120 отразились на формировании в просветной флоре животных этой группы пула лактозо-неферментирующихэнтеробакте-рий, не чувствительных к действию микроцина C51.
Ключевые слова: пробиотики, нормофлора, дисбактериоз, ин-дигенный штамм, Escherichia coli.
В последние годы первостепенное значение для ветеринарной медицины приобретает проблема дис-биотических состояний у сельскохозяйственных животных. В связи с этим возрастает внимание к изучению кишечной микрофлоры и ее взаимодействию с макроорганизмом [1]. Наиболее остро проблема дисбакте-
риоза возникает при выращивании молодняка, когда эта патология встречается чаще всего [2].
Основное средство коррекции кишечной микрофлоры - пробиотические препараты. Механизм их положительного действия основан на подавлении патогенных и условнопатогенных микроорганизмов в результате продукции биологически активных веществ, конкуренции за сайты адгезии на кишечной стенке, влиянии на ферментативную активность желудочно-кишечного тракта и стимуляции иммунной системы организма хозяина [3].
Наиболее важное свойство пробиотических препаратов - обеспечение колонизационной резистентности, которая определяет характер взаимоотношений пробиотических микроорганизмов с индигенной микрофлорой. Однако применение пробиотических препаратов зачастую не оказывает положительного эффекта, или он носит транзиторный характер. Одна из главных причин такой ситуации - антагонизм между индегенными и пробиотическими микроорганизмами [4].
Цель нашей работы - сравнительное изучение действия двух пробиотиков на основе различных штамма Escherichia coli на нормофлору желудочно-кишечного тракта лабораторных животных при экспериментальном дисбактериозе.
Условия, материалы и методы. В работе использовали индигенный высокоадгезивный штамм Escherichia coli EB 387 из коллекции, поддерживаемой в лаборатории генно-инженерных препаратов, и штамм E.coli М17, широко используемый при создании пробиотиков. В состав генома микроорганизмов обоих штаммов посредством генетической трансформации были введены две плазмиды: природная плазмида Р74, выделенная и идентифицированная в Институте молекулярной генетики РАН И.А. Хмель, отвечающая за синтез микроцина С51, который подавляет развитие патогенных энтеробактерий, и плазмида рLTB44, содержащая ген В-субъединицы термолабильного энтеротоксина E.coli, который отвечает за конкурентное ингибирование LT-подобных токсинов [8]. В опытах по моделированию токсикоинфекции использовали штамм Escherichia coli ЕВ120, продуцирующий термолабильный токсин эшерихий.
Для выделения и идентификации представителей просветной микрофлоры использовали следующие дифференциально-диагностическиие среды: агар Эндо и Мак-Конки - для бактерий кишечной группы; энтерококк- и бифидоагар для энтерококков и бифидобактерий соответственно; среда MRS - для культивирования лактобацилл. Все использованные среды были изготовлены ФГУП «Государственный научный центр прикладной микробиологии» МЗ РФ.
В эксперименте использовали самцов мышей линии Balb/C массой 12.. .14 г. У этих животных превалирует Th-2 тип иммунного ответа, и они более подвержены стрессовым воздействиям, что делает их оптимальной моделью для изучения дисбиотических состояний.
Экстракцию просветной микрофлоры из образцов и ее последующий анализ осуществляли методами, рекомендованными в [6], высев на питательные среды проводили из серийных разведений. Энтробактерии куль__ Достижения науки и техники АПК, №4-2012
1,00Е+09п
1,00Е+0»
1,00Е+07
l,00E+0fr
1,00Е+05^
1,00Е+04-
1,00Е-Н№
1,00Е+02
1,00Е+01
1,00Е-Н№
Контроль
Антибиотики
Рис. 1. Изменения просветной микрофлоры под действием антибиотиков с прследующей коррекцией пробиотиками: □ - E.coli 1ас-\ □ - E.coli lac+\ U - энтерококки; ■ - бифидобак-
терии; S - лактобациллы
тивировали в аэробных условиях при температуре 37 °С в течение 24.36 ч. Для оптимизации роста лактобацилл их выращивали в атмосфере, содержавшей до 5 % СО2, представителей рода бифидобактерий, которые относятя к микроаэрофилам, культивировали в анаэростате в атмосфере, содержавшей 40 % СО2 и 60 % пропана.
Для уточнения видового состава нормофлоры и анализа ее динамических изменений использовали полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с праймерами, специфичными к 16S РНК представителей семейства Enterobacteriaceae. Выделение бактериальной ДНК из образцов проводили сорбент-ным методом с помощью наборов Diatom DNA Prep.
На первом этапе эксперимента сформировали 3 группы подопытных животных по 10 гол. в каждой, две из которых были опытными, а третья служила контролем. Определение нормального микробиологического фона у интактных животных непосредственно перед экспериментом показало, что количество энтеробактерий варьировало в пределах 6...2,5x105. В основном они были представлены E.coli. Количество энтерококков составляло 1,6x106...1,2x107, лактобацилл - 3,4.8,8x107, бифидобактерий - 1.8x107.
Для моделирования экспериментального дисбактериоза использовали канамицин и тетрациклин в терапевтических дозах. Эти антибиотики синергисты и обладают широким спектром действия. Оба препарата обнаруживаются в желчи, а тетрациклин в значительных количествах (20.50 %) выделяется с калом. В связи с этим к основным проявлениям их побочного действия на организм относятся дисфункции пищеварительного тракта и дисбактериоз [4].
Антибиотики вводили перорально в дозе 250 мг/кг ежедневно в течение 14 дн. После этого проводили анализ изменений в составе просветной микрофлоры.
Далее в течение 14 дней животные I группы получали индигенный высокоадгезивный штамм E.coli EB 387, II группы - штамм E.coli М17. По прошествии 14 дней после окончания курса пробиотиков вновь проводили анализ про-светной микрофлоры.
На следующем этапе исследования из экспериментальных групп I и II были выделены по 5 животных для определения протективного действия изучаемых штаммов, из которых сформировали соответственно группы III и IV. После чего подопытным животным также перорально однократно давали энтероток-сигенный штамм E.coli EB120, продуцирующий цитотониче-ский термолабильный токсин
Достижения науки и техники АПК, №4-2012
эшерихий, в дозе 1x109 КОЕ на голову. Контрольная группа во всех случаях получала физиологический раствор.
Вторым важным вопросом было выяснение особенностей длительного взаимодействия индигенных и транзиторных штаммов пробиотических микроорганизмов на нормофлору желудочно-кишечного тракта. Для определения приживаемости пробиотических штаммов в ЖКТ животных всех групп в течение 45 дней после окончания применения пробиотиков выдерживали в стандартных условиях, затем вновь проводили бактериологический анализ про-светной микрофлоры.
Результаты и обсуждение. В ходе исследований мы установили, что в результате введения антибиотиков количество неферментирующих энтеробактерий снизилось на 2.3 порядка, ферментирующие эшерихии не высевались. По данным ПЦР энтеробактерии были в основном представлены условно патогенными Escherichia coli, а также видами родов Enterobacter и Citrobacter (E. aero-genes, E. agglomerans, C.freundii). Количество лактобацилл снизилось на 1.2 порядка. Аналогичная картина наблюдалась и в отношении бифидобактерий. Энтерококки в составе просветной микрофлоры не обнаруживались (рис. 1). Таким образом, полученная картина соответствовала дисбактериозу третьей степени [7, 9].
После применения пробиотиков в обеих подопытных группах произошло частичное восстановление количества ферментирующих эшерихий, что свидетельствует о начале процесса колонизации ЖКТ пробиотическими штаммами. Видовой состав энтеробактерий по результатам ПЦР в I группе не претерпел заметных изменений, а у животных II группы, помимо представителей родов Enterobacter и Citrobacter, был обнаружен Proteus mirabilis. Количество бифидобактерий возросло в среднем на 2 порядка и практически сравнялось с таковым в контроле. Также увеличилась популяция лактобацилл, а во II группе их количество оказалось даже выше, чем у интактных мышей. Кардинальные различия между экспериментальными группами наблюдались по количеству энтерококков. У мышей, получавших в качестве пробиотического штамм E.coli EB 387, их количество нормализовалось, а у животных, которым давали штамм М17, энтерококки бактериологическим анализом не обнаруживались (см. рис.1).
1.00Е+09 -л 1,00Е+08 1,00Е+07 1.00Е+06 1,00Е+05 1.00Е+04 1,00Е+03 1,00Е+02 1,00Е+01 1,00Е+00
контроль I гр П гр III гр
Рис. 2. Пролонгированное действие пробиотиков на нормофлору: □ - E.coli lac-; □ -E.coli 1ас+\ U - энтерококки; ■ - бифидобактерии; S - лактобациллы
65
Через 4.6 ч после введения токсигенного штамма у подопытных животных в обеих группах наблюдалось угнетение двигательной активности и диарейный синдром, более выраженные во IV группе. В промежутке времени от 24 до 4В часов все животные, получавшие в качестве пробиотического штамм E.coli М1У погибли с признаками резкого обезвоживания.
В III группе гибель животных не отмечалась. Через У2 часа после введения токсигенного штамма признаки диареи и угнетения у мышей этой группы не наблюдались. Проведенный бактериологический анализ просветной микрофлоры существенных отличий от мышей I группы, за исключением снижения содержания энтерококков не показал (см. рис. 1).
Через 4Б дн. у мышей I и II групп условно-патогенные энтеробактерии из состава просветной микрофлоры элиминировались до уровня ниже определяемого, что, на наш взгляд, произошло в результате вытеснения их нормальными ферментирующими эшерихиями. Особенно выражено это было у животных, получавших индигенный высокоадгезивный штамм E.coli EB ЗВУ, где их количество за 4Б дн. возросло, по сравнению с уровнем лактозо-ферментирующих эшерихий после окончания коррекции дисбиоза, примерно на порядок. Во II группе наметилась тенденция к снижению уровня ферментирующих эшерихий.
В III группе количество условно патогенных энтеробактерий на порядок превышало количество ферментирующих эшерихий, но представлены они были, по данным ПЦР, родами Enterobacter, Citrobacter, Hafnia и Klebsiella, не чувствительными к действию микроцина C51, продуцируемого пробиотическим штаммом. Токсигенные E.coli не обнаруживались поскольку их рост был полностью подавлен пробиотиком.
Восстановление энтерококков наблюдалось только в I и III группах и хотя в I группе их количество было на порядок ниже, чем в контроле, тем не менее оно находилось в пределах физиологической нормы.
Количество лактобацилл и бифидобактерий во всех группах также соответствовало норме и практически не отличалось от контроля. В то же время такие изменения в составе нормофлоры, как полное отсутствие энтерококков во II группе и превышение числа условно патогенных энтеробактерий над нормальными ферментирующими эшерихиями в III группе позволяют говорить о наличии у этих животных первой стадии дисбактериоза [7, 9].
Выводы. Таким образом, при сравнении эффективности корректирующего действия двух пробиотиков на основе штаммов Е. соїіЕВ 387 и М17 на нормофлору желудочно-кишечного тракта лабораторных животных при экспериментальном дисбактериозе, вызванном пероральным введением канамицина и тетрациклина, обнаружено, что Е. соїі ЕВ 387 более эффективно способствует восстановлению всех изученных компонентов структуры микрофлоры от повреждающего действия антибиотиков, при этом наиболее значимым было действие в отношение энтерококков.
Препарат на основе штамма Е.соїі М17 не оказывает протективного действия при введении токсигенного штамма Е.соїі ЕВ120, вызвавшего гибель 100 % животных, тогда как бактерии Е. соїі ЕВ 387, обладающие способностью к продукции микроцина С51, характеризуются выраженным протективным действием, обеспечившим не только 100 %-ную выживаемость животных, но и восстановление ряда компонентов просветной микрофлоры в короткие сроки.
Исследование состава микрофлоры в отдаленные сроки показало высокую эффективность выскоадгезивного пробиотика Е. соїі ЕВ 387, проявившуюся в повышении уровня лактозоферментирующих эшерихий и снижении уровня неферментирующих эшерихий ниже определяемого. Повреждение, вызванное введением токсин-продуцирующего штамма Е.соїі ЕВ120, на фоне пробиотика Е.соїі ЕВ 387 отразилось на формировании в просветной микрофлоре пула лактозо-неферментирующих энтеробактерий, не чувствительных к действию микроцина С51 (III группа).
Литература.
1. Панин А.Н. МаликН.И., Малик. Е.В. Иммунобиология и кишечная микрофлора. - М.: Аграрная наука, «Родник», 1998. - 48 с.
2. Маннапов, А. Г.Морфологические и функциональные показатели систем организма телят при колибактериозе и его профилактике: автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук. - Москва, 1999. - 40 с
3. Бондаренко В.М., Чупринина Р.М., Аладышева Ж.И., Мацулевич Т.В. Пробиотики и механизмы их лечебного действия. // Эксперим. и клин. гастроэнтерол. — 2004. - 3. - 83-87.
4. КактурскийЛ.В., Михайлова Л.П., Овчарова А.Н., Козловский Ю.Е., Серебряков С.Н., Тихонова Н.Б. Морфологическая характеристика тонкой и толстой кишки мышей Balb/C при нарушении состава микрофлоры, индуцированном антибиотиками. // Морфологические ведомости. - 2011. - № 2. С 36-43.
5. Глушанова Н.А., Шендеров Б.А. Взаимоотношения пробиотических и индигенных лактобацил хозяина в условиях совместного культивирования in vitro. //ЖМЭИ. - 2005. - 2. - С. 56-61.
6. Коршунов В.М., Смеянов В.В., Ефимов Б.А. Рациональные подходы к коррекции микрофлоры кишечника. // Вест. РАМН.
- 1996. - 2. - С. 60-65.
7. Лобзин Ю.В., Макарова В.Г., Корвякова Е.Р., Захаренко С.М. Дисбактериоз кишечника (клиника, диагностика, лечение).
- СПб., 2003.
8. Овчарова А.Н., Михайлова Л.П., Серебряков С.Н., Макарова О.В., Козловский Ю.Е., Матевосян К.Ш., Тихонова Н.Б. Морфологическая характеристика иммунной системы мышей Balb/C при нарушении состава микрофлоры и коррекции его пробиотиками «Энтероцин» и «Колибактерин» // Российский медико-биологический вестник им. академика И.П. Павлова. -2009. - № 1. - С. 8-18.
9. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Том III: Пробиотики и функциональное питание. - М.: Издательство ГРАНТЪ, 2001. - 288 стр.
COMPARATIVE EFFECTIVENESS ESTIMATION OF SOME PROBIOTIC STRAINS OF ESCHERICHIA COLI IN EXPERIMENTAL DISBIOSIS AND TOXICOINFECTION Yu.E. Kozlovsky, А.N. Ovcharova, V^. Petrova, I.V. Plugina, S.A. Pustovalov, A.Yu. Petnikov, T.I. Khomyakova, A.D. Magomedova, N.F. Chertovich
Summary. The aim of the work was a comparative investigation of influence of probiotic strains on animal gut microbiom recovery in experimental antibiotic-induced disbiosis and toxicoinfection. The probiotic preparations were created on the base of indigene and transitory Escherichia coli strains. An indigene strain based probiotic was shown to possess a higher colonization activity in comparence with a transitore strain based. It apparently provides a high protective activity against toxin-producing bacteria in an acute experiment. Both probiotic strains stimulated gut microbiome recovery. The stimulation was more expressive in the case of the indigene strain based preparation. The prolonged influence of indigene strain based probiotic on the composition of gut microflora of experimental animals and its particular components was shown too.
Key words: probiotics, normoflora, disbacteriosis, indigene strains, Escherichia coli.
66
Достижения науки и техники АПК, №4-2012
