400https://doi.org/10.29926/2618723X-2018-02-08
Методика вскрытия и извлечения органов лабораторных
животных (крысы)
К.Е. Коптяева, научный сотрудник, патоморфолог, А.А. Мужикян, кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник, руководитель лаборатории гистологии и патоморфологии, Я.А. Гущин, научный сотрудник, патоморфолог,
Е.В. Беляева, научный сотрудник, патоморфолог, М.Н. Макарова, директор, В.Г. Макаров, доктор медицинских наук, профессор, зам. директора по науке НПО «Дом Фармации», Российская Федерация 188663, Ленинградская область, Всеволожский район, г. п. Кузьмоловский, ул. Заводская, дом 3, корп. 245
Е-тэИ: koptyaeva.ke@doclinika.ru
Резюме. Вскрытие животных (некропсия, аутопсия) - диагностическая процедура, направленная на выяснение причины смерти животного и определение спектра макроскопически видимых изменений органов и тканей у трупа. В научно-исследовательской практике одним и ключевых этапов эксперимента и одновременно гуманной точкой эксперимента нередко является эвтаназия животных с последующим патологоанатомическим и гистологическим исследованием органов. Для получения достоверных данных очень важна стандартизация процедуры вскрытия и извлечения органов лабораторных животных. В цикле статей, посвященных проведению некропсии лабораторных животных, будут освещены основные этапы аутопсии. В настоящей работе описана методика вскрытия и извлечения органов у крыс.
Ключевые слова: некропсия, крысы.
Для цитирования: Коптяева К.Е., Мужикян А.А., Гущин Я.А., Беляева Е.В., Макарова М.Н., Макаров В.Г. Методика вскрытия и извлечения органов лабораторных животных (крысы). Лабораторные животные для научных исследований; 2018; 2. https://doi.org/10.29926/2618723X-2018-02-08
Technique of dissection and extracting organs of laboratory animals. Message 1 (rats)
K. Koptyaeva, researcher, pathomorphologist, A. Muzhikyan, PhD veterinary medicine, senior researcher, Head of the Laboratory of Histology and Pathomorphology, Ya.Gushchin, researcher, pathomorphologist, E. Belyaeva, researcher, pathomorphologist, M. Makarova, Director, V. Makarov, Doctor of Medicine, prof., Deputy dir. of science JSC «Research-and-manufacturing company «Houm оf Pharmacy», 188663, Russia, Leningradskiy region, Vsevolozhskiy district, Kuzmolovskiy, st. Zavodskaya, 3. b. 245 Е-mail: koptyaeva.ke@doclinika.ru
Summary. Post-mortem examination of animals (necropsy, autopsy) is a diagnostic procedure aimed at finding out the cause of death of an animal, as well as determining the spectrum of macroscopically visible changes in organs and tissues of cadaver. In scientific and research practice, one of the key stages of the experiment and at the same time a humane experimental point often is euthanasia of animals with subsequent pathoanatomical and histological examination of organs. From the point of view of the quality and reliability the obtained data, an important step is the standardization of the procedure to dissection and extracting organs of laboratory animals. A series of articles about the carrying out of necropsy of laboratory animals will
LABORATORY ANIMALS FOR SCIENCE
highlight the main stages of autopsy. In this work, a technique to dissection and extracting organs of rats is described.
Key words: necropsy, rats.
For citation: Koptyaeva K., Muzhikyan A., Guschin Ya., Belyaeva E., Makarova M., Maka-rov V. Technique of dissection and extracting organs of laboratory animals. Message 1 (rats). Laboratory Animals for Science. 2018; 2. https://doi.org/10.29926/2618723X-2018-02-08
Введение
Некропсия (аутопсия, патологоанатомическое исследование, секция, вскрытие) - это посмертная диагностическая процедура, включающая в себя исследование трупа, в том числе внутренних органов, направленная на выявление причин смерти или заболевания, приведшего к гибели. Эта процедура широко применяется в биологических и медицинских исследованиях. В доклинических исследованиях лекарственных препаратов некропсия и последующее гистопато-логическое изучение органов и тканей - основные методы изучения токсичности, без которых невозможна адекватная оценка результатов эксперимента. Поэтому очень важно качество проведения процедуры вскрытия и последующей гистологической обработки материала. Полное вскрытие с соблюдением последовательности всех его этапов, а также грамотный подход к отбору гистологического материала - залог получения достоверных результатов патоморфологического исследования.
Следует отметить, что не существует единственного наилучшего метода вскрытия, который бы соответствовал желаниям любого патологоанатома или исследователя, выполняющего вскрытие [8]. Выбор метода вскрытия должен определяться на основе цели эксперимента, клинической истории животного, запланированного отбора образцов тканей и необходимых диагностических тестов. Крайне важно разработать и выполнять стандартную операционную процедуру на вскрытие с изучением и отбором проб всех органов в грамотной систематической последовательности. Наличие стандартной операционной процедуры предотвратит пропуск каких-либо изменений или образца из коллекции и значительно улучшит эффективность и скорость выполнения вскрытия.
Цель данной работы - разработка методики вскрытия и извлечения органов лабораторных крыс.
Методику разработали в НПО «Дом Фармации» на самцах аутбредных крыс (n=510). Масса животных составляла 250-300 г. Для исследования использовали животных, подлежащих эвтаназии в ходе текущих экспериментов, специально для данной работы животных не эвтаназировали.
Животные были подвергнуты эвтаназии с помощью СО2-камеры [2]. После установления факта смерти проводили некропсию с извлечением органов.
Материал и методы
Некропсия. Любая некропсия должна начинаться с идентификации животного, исследования анамнеза и ознакомления с планом исследования [5, 8]. Далее необходимо провести внешний осмотр животного, включающий в себя оценку тело-
сложения и упитанности, визуальный осмотр и пальпацию шерстного покрова, кожи, слизистых оболочек ротовой и носовой полостей, конъюнктивы, глаз, анального отверстия и наружных половых органов. Особое внимание следует обратить на любое вмешательство извне, наличие чипов, датчиков, имплантатов, хирургических швов и рубцов, любых других повреждений [5, 6]. Помимо этого, перед вскрытием необходимо определить массу тела животного, провести забор крови и других образцов тканей для иных диагностических исследований [8].
Все данные, получаемые по ходу вскрытия, должны регистрироваться в протоколе, форма которого разрабатывается в организации заранее [7]. Информация исследователя должна быть объективной, отражать точно его наблюдения. Интерпретация полученных результатов непосредственно в протоколе вскрытия недопустима. Степень выраженности признаков (например, «слабая», «умеренная», «выраженная») может быть указана только в том случае, если ее границы четко определены [5].
Инструменты для иссечения тканей должны быть чистыми и острыми. Для извлечения органов применяется пинцет с плоскими браншами (анатомический). Пинцет с зубчиками (хирургический) может использоваться только для вскрытия полостей и захвата окружающих органы тканей. Извлеченные органы помещаются в чашки Петри, заполненные физиологическим раствором натрия хлорида, таким образом, чтобы органы погружались в раствор целиком. Высушивание органов на воздухе не допускается. Органы желудочно-кишечного тракта после извлечения промываются физиологическим раствором натрия хлорида для удаления содержимого. Контакт органов с проточной водой не допускается, поскольку это может привести к разрушению клеток из-за разницы в осмотическом давлении.
После полного вскрытия проводится взвешивание органов. В том случае, если оно не предусмотрено планом исследования, допускается фиксация органов вместе с окружающими тканями.
1. В зависимости от метода эвтаназии и наличия/отсутствия необходимости забора крови, вскрытие грудной полости проводится в начале или по ходу нек-ропсии (при обескровливании открытым способом проводят вскрытие грудной полости непосредственно после наркотизации животного).
2. Положить труп животного на спину и зафиксировать при помощи иголок в препаровальном лотке (рис. 1, а).
3. Смочить шерстный покров шеи, грудной и брюшной стенки антисептическим раствором.
4. Пинцетом захватить и приподнять кожу с подлежащей подкожной клетчаткой в нижней части живота, надрезать ее и сделать продольный разрез по белой линии живота от основания нижней челюсти до паха таким образом, чтобы брюшная стенка осталась неповрежденной (см. рис.1, б).
5. Отсепарировать кожу в области брюшной стенки тупым концом ножниц (см. рис. 1, в). Сделать по 2 разреза кожи (сверху и снизу) от средней линии к конечностям, оттянуть и зафиксировать иголками кожные лоскуты (см. рис. 1, г).
Методика вскрытия и извлечения органов
LABORATORY ANIMALS FOR SCIENCE
6. Извлечение молочных желез иссечением участка кожи в паховой области
(рис. 2).
Рис. 3. Поверхностные лимфатические узлы: красными стрелками указаны места локализации паховых лимфатических узлов, черными - подмышечных лимфатических узлов
7. Извлечение поверхностных лимфатических узлов (подмышечных, коленных, паховых и т.д.) (рис. 3)
8. Для вскрытия брюшной полости необходимо сделать разрез мышечной стенки от паха вдоль средней линии, держа ножницы тупым концом вниз, приподняв пинцетом или зажимом участок брюшной стенки (рис. 4, а).
9. При обескровливании открытым способом грудная полость уже будет вскрыта. При ином способе эвтаназии грудную полость необходимо вскрыть 2 раз-
Рис. 4. Вскрытие брюшной и грудной полостей: а - Разрез брюшной стенки по белой линии живота; б, в - разрез грудной стенки справа и слева; г - отделение диафрагмы от грудной кости
LABORATORY ANIMALS FOR SCIENCE
резами (слева и справа) по бокам от грудины (по среднеподмышечной линии) косо вверх, перерезая ребра и мягкие ткани (см. рис. 4, б, в).
10. Для исследования костного мозга необходимо отобрать грудную кость целиком, отделив от нее мечевидный отросток, ребра и мягкие ткани (рис. 5).
11. Далее следует извлечь тимус. Вырезают грудную долю тимуса, располагаю -щуюся в верхней части грудной клетки у основания сердца, сразу за грудиной (рис. 6).
12. Извлечение сердца осуществляется путем перерезания удерживающих его сосудов (рис. 7)
Рис. 8. Извлечение легких: а - перерезка трахеи и пищевода в области шеи и диафрагмы; б - извлечение легких с трахеей и пищеводом; в - извлеченные легкие после удаления пищевода
Рис. 9. Отделение пищевода
в
Рис. 10. Извлечение грудной аорты: а - топографическое расположение органа (обозначена стрелкой); б - отделение аорты от позвоночника; в - извлеченная грудная аорта
13. Для извлечения легких, трахеи и пищевода следует перерезать зафиксированные пинцетом трахею и пищевод в области шеи (рис. 8, а). Затем, аккуратно подтягивая органокомплекс вверх, отделить пищевод от оставшейся в грудной полости аорты (см. рис. 8, б), после чего перерезать трахею и пищевод в области диафрагмы.
14. Отделение пищевода от извлеченного ранее органокомплекса (рис. 9).
15. Найти и вырезать грудную часть аорты, проходящую вдоль позвоночного канала (рис. 10).
LABORATORY ANIMALS FOR SCIENCE
б
Рис. 11. Извлечение селезенки: а - топографическое расположение органа; б - извлеченная селезенка без окружающих тканей
Рис. 12. Извлечение поджелудочной железы: а - топографическое расположение органа (обозначено стрелкой); б - поджелудочная железа после извлечения
Рис. 13. Извлечение желудка: а - топографическое расположение органа; б, в - вскрытие желудка по большой кривизне; г - промывание желудка в физиологическом растворе
16. Извлечение селезенки (рис. 11), расположенной в области левого подреберья брюшной полости, отделение ее от окружающих тканей.
17. Извлечение поджелудочной железы (рис. 12), расположенной в области S-образного изгиба тонкой кишки, и отделение ее от окружающих тканей.
18. Извлечение желудка осуществляется путем отделения его в верхней части от пищевода, а в нижней - от двенадцатиперстной кишки (рис. 13, а). Далее делают разрез желудка по большой кривизне (см. рис. 13, б, в) и прополаскивают его в физиологическом растворе, освободив от содержимого (см. рис. 13, г).
д е
Рис. 14. Извлечение кишечника: а - иссечение фрагмента кишки; б - отделение фрагмента от окружающих тканей; в - фрагмент после отделения от окружающих тканей; г - укладка участка кишечника для помещения в гистологическую кассету
19. Извлечение фрагментов тонкой и толстой кишки длиной 1-3 см: тонкой -отступив от желудка на 0,5-1 см (рис. 14, а), толстой - отступив от слепой кишки на 0,5-1 см (см. рис. 14., б, в). После извлечения отделить от окружающих тканей (см. рис. 14, г, д). Освободить от содержимого, прополоскав в физиологическом растворе.
20. Если необходимо исследовать все отделы кишечника (с содержимым или без), то петли кишок можно поместить в гистологические кассеты целиком, свернув их в форме «улитки» (см. рис. 14, е).
»
а
г
Рис. 15. Извлечение печени: а, б, в - иссечение связок, удерживающих печень; г - печень после извлечения
* *
в
Рис. 16. Извлечение надпочечников; а, б - отделение органа; в - извлеченные надпочечники после удаления окружающих тканей
21. Извлечение печени путем разреза удерживающих ее серозных связок: венечной, прикрепляющейся к диафрагме, почечно-печеночной, желудочно-пече-ночной и печеночно-двенадцатиперстной кишки (рис. 15, а, в). Допускается вырезка и фиксация отдельных фрагментов печени после взвешивания.
22. Извлечение надпочечников (рис. 16, а, б) и отделение их от окружающих тканей (см. рис. 16, в).
в
Рис. 17. Извлечение почек: а - извлечение почки; б - отделение окружающих тканей; в - почки после удаления окружающих тканей
23. Извлечение почек (рис. 17, а) и отделение их от окружающих тканей (см. рис. 17, б).
24. Извлечение половых органов и мочевого пузыря у самок:
• яичники извлечь и отделить их от окружающих тканей (рис. 18, а, б);
• матку (рога матки, тело, шейку матки) извлечь отделить от окружающих тканей (см. рис. 18, в);
• мочевой пузырь извлечь и отделить от окружающих тканей (см. рис. 18, д). Влагалище извлекается следующим образом: большими ножницами перере -
зают лонное сочленение (см. рис. 18, з, и), после чего отделяют влагалище от подлежащих тканей (см. рис. 18, к) и извлекают его (см. рис. 18, л).
Рис. 18. Извлечение органов мочеполовой системы у самок: а, б - извлечение яичника; в - извлечение матки; г - яичники и матка после извлечения; д - извлечение мочевого пузыря; ж - мочевой пузырь после извлечения; з, и - перерезка лонного сочленения; к - отделение влагалища от подлежащих мягких тканей; л - влагалище после извлечения
ЛАБОРАТОРНЫЕ ЖИВОТНЫЕ ДЛЯ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Рис. 19. Извлечение органов мочеполовой системы самцов: а - извлечение семенника; б, в - извлечение придатка семенника; г - семенник и придаток после извлечения; д - извлечение мочевого пузыря и половых желез единым органокомплексом; е - органокомплекс после извлечения (1 - мочевой пузырь, 2 - предстательная железа; 3 - свертывающая железа)
ч
а
/
N
б
Рис. 20. Извлечение подчелюстных лимфатических узлов и слюнной железы: а - топографическое расположение органов: слюнная железа указана красными стрелками, лимфатические узлы - черными стрелками; б - органы после извлечения
25. Извлечение органов мочеполовой системы у самцов:
• семенников (рис. 19, а);
• левого и правого эпидидимиса (см. рис. 19, б, в);
• половых желез (простата, свертывающая железа, семенные пузырьки) и мочевого пузыря (извлекаются единым органокомплексом), см. рис. 19, д, е.
26. Извлечение подчелюстной слюнной железы с лимфатическими узлами и отделение ее от окружающих тканей (рис. 20).
а
I
в
Рис. 21. Извлечение гортани с трахеей, щитовидной и паращитовидной железой: а - область шеи после удаления кожи, слюнных желез и лимфатических узлов; б - удаление мышц; в - захват и перерезка гортани; г - органокомплекс после извлечения
27. Сделать глубокий продольный разрез в области шеи (рис. 21, а, б) и извлечь гортань с трахеей, щитовидной и паращитовидной железой (см. рис. 21, в).
. JL
д
Рис. 22. Извлечение языка и глотки: а - разрез нижней челюсти; б, в - отделение языка от подъязычной кости; г - извлечение языка вместе с глоткой; д - органокомплекс после извлечения
28. Для извлечения языка и глотки следует сделать продольный разрез нижней челюсти (рис. 22, а, б). После этого анатомическим пинцетом захватить кончик языка и сделать разрезы у основания корня языка, отделив его от подъязычной кости (см. рис. 22, в). Далее продолжать разрезать мягкие ткани в дорсальном направлении, извлекая язык вместе с глоткой (см. рис. 22, г).
Рис. 23. Извлечение головного мозга, способ 1: а - удаление кожи; б, в - продольные разрезы в черепе с обеих сторон по направлению от большого отверстия к ушным проходам; г - вскрытие черепной коробки в области теменной и височной кости черепа; д, е - извлечение головного мозга из черепной коробки
29. Извлечение головного мозга можно осуществлять двумя способами:
Способ 1:
• при помощи ножниц с большими браншами отрезать голову на линии между атлантом и черепом;
• отпрепарировать от кожи и фасций верхнюю часть черепной коробки (рис. 23, а);
• затем сделать продольные разрезы в черепе с обеих сторон, по направлению от большого отверстия к ушным проходам (см. рис. 23, б, в);
• пинцетом отломать части теменной и височной кости черепа (см. рис. 23, г);
• начиная от зоны фронтальной части, подцепить и извлечь головной мозг (см. рис. 23, д, е).
LABORATORY ANIMALS FOR SCIENCE
Рис. 24. Извлечение оловного мозга, способ 2 (применяется при необходимости извлечения обонятельных луковиц): а - поперечный разрез на уровне носовой перегородки; б, в - продольные разрезы затылочной и теменной кости; г - вскрытие черепной коробки в области теменной и височной кости черепа; д - извлеченный головной мозг с обонятельными луковицами (указаны стрелкой)
Способ 2 применяется при необходимости извлечения обонятельных луковиц:
• после отделения головы и снятия кожи с черепа ножницами сделать поперечный разрез на уровне носовой перегородки (рис. 24, а);
• далее (ножницы не должны слишком глубоко проникать в носовую полость) продолжить разрезать затылочную и теменную кости (см. рис. 24, б, в);
• затем удалить череп, обнажив мозг и мозговые оболочки (см. рис. 24, г);
• извлечь головной мозг вместе с обонятельными луковицами (рис. 24, д).
30. Извлечение височной кости:
• произвести декапитацию на уровне 1-2 шейного позвонка с помощью ножниц с толстыми браншами (рис. 25, а);
• сделать продольный разрез по средней линии черепа в направлении от затылка к носу (см. рис. 25, б);
• освободить череп от кожи с волосяным покровом (см. рис. 25, в);
• аккуратно вскрыть полость черепа вдоль сагиттального шва ножницами с тонкими браншами (см. рис. 25, е);
• отпрепарировать височные кости тупым способом (см. рис. 25, е, е).
31. Извлечение из турецкого седла гипофиза (рис. 26).
LABORATORY ANIMALS FOR SCIENCE
е
Рис. 27. Извлечение глаза со слезной железой и зрительным нервом: а - разрез угла глаза; б, в - отделение кожи в области глаза; г, д - извлечение глаза вместе со слезной железой и зрительным нервом единым органокомплексом; е - органокомплекс после извлечения
32. Извлечение глаза вместе со слезной железой и зрительным нервом (рис. 27).
ЛАБОРАТОРНЫЕ ЖИВОТНЫЕ ДЛЯ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
шт
г
ту.
в t"
д
Рис. 28. Отбор носовых ходов и синусов: а - отделение нижней челюсти; б, в - отделение кожи и мышц от верхней челюсти; г - разрез на уровне глаз; д - препарат верхней челюсти
в
Рис. 29. Извлечение скелетной мышцы и периферического нерва: а, б - отделение мышцы; в - мышца и периферический нерв (указан стрелкой) после извлечения
33. Отбор носовых ходов и синусов:
• после декапитации следует отделить от черепа кожу и мышцы (рис. 28, а);
• осторожно, избегая повреждения рук верхними резцами, произвести отделение нижней челюсти (см. рис. 28, б), а затем разрез - на уровне глаз (см. рис. 28, в), отделяя тем самым препарат верхней челюсти.
34. Извлечение скелетной мышцы и периферического нерва. Для этого необходимо сделать глубокий разрез кожи и подлежащих мышц, отпрепарировать мышцы и фасции, затем извлечь скелетную мышцу и нерв (рис. 29).
ЛАБОРАТОРНЫЕ ЖИВОТНЫЕ ДЛЯ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
а
Рис. 30. Извлечение спинного мозга: а - позвоночный столб и окружающие ткани после отделения головы и конечностей; б - отделение мышц спины от позвоночного столба; в - отделение ребер от позвоночного столба; г - позвоночный столб после удаления окружающих тканей
35. Для извлечения спинного мозга необходимо рассечь вдоль позвоночника мышцы спины (рис. 30, а, б), остроконечными ножницами пересечь с обеих сторон остистые отростки позвонков и ребра (см. рис. 30, в). Далее максимально очистить позвоночный столб от мягких тканей (см. рис. 30, г). Фиксация отделов спинного мозга проводится вместе с позвоночным столбом без извлечения мозга из спинномозгового канала.
Заключение
Предложенная нами методика позволяет:
• обеспечить полное последовательное вскрытие с возможностью досконального исследования всех полостей, систем органов и различных частей тела крысы;
• провести извлечение всех необходимых органов и тканей в соответствии с планом исследования;
• минимизировать повреждения структур и избежать загрязнения органов и тканей, исключая возникновение некоторых артефактов при последующем гистологическом исследовании.
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Conflict of interest
The authors declare no conflict of interest.
LABORATORY ANIMALS FOR SCIENCE
Литература
1. Мужикян А.А., Макарова М.Н., Гущин Я.А. Особенности патологоанатомического исследования группы экспериментальных животных. СПб: Международный вестник ветеринарии. 2014; 1: 75-80.
2. Рыбакова А.В., Макарова М.Н. Методы эвтаназии лабораторных животных в соответствии с Европейской директивой 2010/63. Международный вестник ветеринарии. 2015; 2: 96-107.
3. Fiette L1, Slaoui M. Necropsy and Sampling Procedures in Rodents // Drug Safety Evaluation: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. 2011. Vol. 691: 39-56. doi :10.1007/978-1-60761-849-2_3
4. Mclnnes E. (Ed.). Pathology for Toxicologists: Principles and Practices of Laboratory Animal Pathology for Study Personnel. Chichester: John Wiley & Sons. 2017: 25-6.
5. Parkinson C. et al. Diagnostic necropsy and selected tissue and sample collection in rats and mice. Journal of Visualized Experiment. 2011, 54: 2-7. doi: 10.3791/2966
6. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice - Part 1 // Experimental and Toxicologic Pathology. 2003. Vol. 55: 91-106. doi: 10.1078/0940-2993-00311
7. Scudamore C. L. (Ed.). A Practical Guide to the Histology of the Mouse. Chichester: John Wiley & Sons. 2014:17-20.
8. Suckow M.A., Stevens K.A., Wilson R.P. (Eds.). The Laboratory Rabbit, Guinea Pig, Hamster, and Other Rodents. London: Academic Press; Elsevier. 2012: 135-6.
LABORATORY ANIMALS FOR SCIENCE
