CC BY
181
МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОЛОЖЕНИЯ «СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА БИОПРЕПАРАТА НЕМАТОФАГИН МФ ДЛЯ БОРЬБЫ С ГАЛЛОВОЙ НЕМАТОДОЙ В ЗАЩИЩЕННОМ
ГРУНТЕ»
В.Д. МИГУНОВА кандидат биологических наук
Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии им. К.И. Скрябина, e-mail: barbarusha@rambler.ru
(Одобрены комиссией по нематодным болезням сельскохозяйственных растений отделения защиты растений РАСХН 26 января 2011 г., протокол № 1)
Галлообразующие нематоды рода Meloidogyne широко распространены во всем мире. Они поражают многие культурные и дикорастущие растения. На территории России в защищенном грунте широко распространены 4 вида галловых нематод: северная галловая, южная, яванская, аразисовая (песчаная). В тепличном грунте при наличии галловых нематод урожай томатов и огурцов резко снижается и нередко составляет 3-6 кг/м2. Значительные экономические потери урожая основных тепличных культур (огурцов и томатов) от мелоидогиноза достигают 30-50 % и более. Для борьбы с мелойдогинозом используют различные нематодоциды.
Препараты на основе хищных грибов хорошо известны как у нас в стране, так и за рубежом. Существует несколько препаратов на основе хищных грибов: нематофагин (Россия), Royal (Франция). Эффективность существующих препаратов на основе хищных грибов значительно колеблется. Это может быть связано как с грибным компонентом препарата, так и со способом производства препарата.
Нематофагин - биологический препарат, получаемый на основе хищного нематофагового гриба Arthrobotrys oligospora. Основной способ производства этого препарата - получение спорово-мицелиального комплекса грибов на сыпучих и твердых субстратах, содержащих органические компоненты. Крупномасштабное производство препарата до сих пор не организовано.
Нематофагин МФ - препарат, полученный путем культивирования хищного гриба A. oligospora на жидкой среде Чапека с 1%-ным дрожжевым экстрактом.
Использование препарата нематофагин МФ более целесообразно по сравнению с нематофагином, так как срок наращивания препарата сокращается в 5 раз, препарат не содержит спор и более эффективен при применении в защищенном грунте.
В настоящих методических положениях предлагается схема получения и применения нематофагина МФ для борьбы с мелойдогинозом растений в защищенном грунте.
Для применения нематофагина МФ в борьбе с галловой нематодой рекомендуется следующая последовательность:
1. Предварительная подготовка тепличного субстрата (пропаривание) для элиминации грибных и бактериальных инфекций, личинок галловых нематод;
2. Внесение препарата нематофагин МФ в лунки за 2 недели до высадки растений;
3. Высаживание растений в пропаренный и обработанный препаратом субстрат.
Характеристика препарата нематофагин МФ. Нематофагин МФ представляет собой мицелиальную суспензию хищного нематофагового гриба A. oligospora на питательной среде Чапека с 1%-ным дрожжевым экстрактом. Для наращивания препарата используют штамм A. oligospora IG18, содержащийся в коллекции лаборатории фитогельминтологии ВИГИС.
Получение препарата нематофагин МФ в лабораторных условиях.
Необходимые материалы и оборудование:
- культура хищного гриба A. oligospora IG18, хранящегося в коллекции лаборатории фитогельминтологии;
- среда для пересева культур хищных грибов - агаризированная среда Чапека (сахароза - 30 г; NaNO3 - 2 г; K2HPO4 - 1 г; MgSO47H2O - 5 г; KCl - 0,5 г; FeSO4'7H2O - 0,1 г; агар - 20 г, вода - 1 л);
- среда для получения препарата нематофагин МФ - жидкая среда Чапека (сахароза - 30 г; NaNO3 - 2 г; K2HPO4 - 1 г; MgSO47H2O - 5 г; KCl - 0,5 г; FeSO4 7H2O - 0,1 г; вода - 1 л);
- дрожжевой экстракт (лаборатория «Difco»);
- молочная кислота;
- термостатируемая качалка;
- стеклянные колбы.
Чистую культуру хищного гриба A. oligospora IG 18 поддерживают на сусло-агаре или на среде Чапека с добавлением дрожжевого экстракта в пробирках с 5 мл среды. Хищные грибы хранят в холодильнике при 4 оС. Время пересева - 1-3 мес.
Перед пересевом чистые чашки Петри стерилизуют в сухо-жаровом шкафу в течение 2 ч при температуре 180 °С; среды и пробирки для пересевающейся культуры автоклавируют при давлении 1 атм в течение 20 мин. В стерильные чашки Петри разливают тонким слоем среду Чапека с 1%-ным дрожжевым агаром. На поверхность застывшего агара пересевают культуру хищного гриба из пробирки методом сухой иглы (для переноса конидий на свежую среду).
Для дальнейшего выращивания грибов готовят жидкую среду Чапека с 1%-ным дрожжевым экстрактом. Среду автоклавируют в течение 20 мин при 1 атм. После того, как среда приготовлена, проавтоклавирована, ее доводят до температуры 25 °С и добавляют молочную кислоту (4 мл на 1 литр среды).
Приготовление инокулята. Для получения конидиальной суспензии грибную биомассу счищают с чашек Петри стерильным стальным скальпелем. Полученную биомассу фильтруют через тройной слой марли (диаметр пор 1 мм) для отделения мицелия от конидий. Полученную суспензию конидий гриба подсчитывают в камере Горяева при увеличении 12х. Из полученных данных высчитывают среднее содержание конидий в 1 мл суспензии.
Инокуляция. Колбы (вместимостью 0,3 л), содержащие среду Чапека с 1%-ным дрожжевым экстрактом и молочной кислотой, инокулируют полученной конидиальной суспензией (0,2 мл суспензии на 200 мл среды). Инокулированные колбы ставят на качалку (180 об./мин.) и культивируют в течение 5 сут. Оптимальная температура для выращивания нематофагина МФ - 23 °С.
После культивирования наращенный препарат переливают в пластиковые или стеклянные бутыли (0,5 л), герметично закрывают (оставляя 2 см воздушного пространства под крышкой бутыли), наклеивают этикетку
По показателям качества препарат должен соответствовать следующим требованиям и нормам:
Показатель Норма
1. Внешний вид Водная концентрированная суспензия
2. Цвет Серо-желтоватый
3. Запах Почти без запаха
4. рН 6,8-7,4
5. Плотность 500 мг/л
6. Срок годности 3 недели
7. Испытание на хищную ак- Проверяют на нематодах - тест-объектах
тивность
8. Микробиологическая чистота Микробиологический посев
Внешний вид и цвет препарата оценивают визуально.
Перед отбором пробы бутыль с препаратом взбалтывают, затем отбирают 1 мл аликвоты для анализа мицелия под микроскопом. 5 мл отбирают для определения биомассы препарата на целлюлозных фильтрах. Препарат наносят на фильтры, которые взвешивают на электронных весах с сырым препаратом и после просушивания при 105 °С в течение 15 мин в сухо-жаровом шкафу.
Применяемые реактивы, посуда, приборы:
- чашки Петри стеклянные (диаметр 9 см);
- шкаф сушильный любой марки, дающий температуру 105 °С;
- весы лабораторные электронные марки «Сарториус».
Определение хищной активности. Способность образовывать ловчие приспособления определяют нанесением 0,2 мл суспензии на предметные стекла, покрытые тонким слоем агара и содержащих 200 нематод Caeаnorhabditis ele-gans. Ловчие органы подсчитывают под микроскопом при увеличении 100.
рН определяют рН-метром или специальными индикаторными полосками.
Микробиологическую чистоту препарата определяют высевом на питательную среду Чапека. Приготовленную агаризированную среду разливают в чашки Петри. Полученную суспензию препарата втирают стеклянным шпателем в среду. Засеянные чашки хранят 24 ч при 25 °С. После окончания инкубации чашек поверхность среды анализируют на наличие бактериальных колоний.
Метод применения. Подготовку субстрата (пропаривание) осуществляют за месяц до высадки растений. За две недели до высадки растений в лунки вносят нематофагин МФ, полученный по вышеописанному регламенту из расчета 200 мл на лунку (с концентрацией 250 мг мицелия/л).
При развитии мелойдогиноза обработку тепличного субстрата можно повторить через 30-35 сут, обрабатывая почву вокруг растения с целью ликвидации в субстрате личинок галловых нематод. Полив рекомендуется осуществлять с использованием распылителя водной суспензии препарата, а не прямой струей. Это необходимо для равномерного распределения нематофа-гина МФ в почве.
После внесения препарата на поверхности тепличного субстрата появляется белый налет, что свидетельствует о нормальном развитии хищного гриба.
Не рекомендуется вносить химические препараты в теплицу после обработки нематофагином МФ в течение двух недель.
Для более высокой эффективности препарата нематофагин МФ желательно обрабатывать полностью теплицу, а не только отдельные ее участки.
Препарат можно хранить в течение трех недель, но лучше использовать свежеприготовленную форму нематофагина МФ.
