CC BY
1
УДК 543.544 DOI: 10.21323/2071-2499-2021-5-46-48 Табл. 2. Ил. 2. Библ. 9.
МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОРГАНИЧЕСКОГО ЙОДА В ВИДЕ ЙОДТИРОЗИНОВ В ПИШЕВЫХ ПРОДУКТАХ*
Гиро Т.М.1, доктор техн. наук, Куликовский А.В.1, канд. техн. наук, Князева А.С.2, Утьянов Д.А.2, канд. техн. наук, Гиро А.В.1
1 Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова
2 ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова
Ключевые слова: йодтирозины, органический йод, тандемная жидкостная хромато-масс-спектрометрия (ВЭЖХ-МС/МС), пишевые продукты
Реферат
Разработана высокоточная и чувствительная методика определения йодтирозинов в пищевых продуктах. Приведены метрологические характеристики метода. Выявлен нижний предел количественного определения LOQ (1 нг/мл), линейность калибровочной кривой (1-2000 нг/мл), коэффициент корреляции (0,9994), точность и прецизионность методики определения. Идентификацию йодтирозинов осуществляли по времени удерживания и отношению площадей пиков ионов-продуктов в сравнении со стандартными образцами. Изучено влияние матрицы на ионизацию йодтирозинов. Степень подавления ионизации матрицей составляет от 0 до 50 %.
METHODOLOGY FOR THE DETERMINATION OF ORGANIC IODINE IN THE FORM OF IODOTYROSINES IN FOODS
Gyro T.M.1, Kulikovskii A.V.1, Knyazeva А.S.2, Utyanov D.A.2, Gyro А.V.1
1 Saratov State Vavilov Agrarian University
2 Gorbatov Research Center for Food Systems
Key words: iodotyrosines, organic iodine, tandem liquid chromatography-mass spectrometry [HPLC-MS/MS), food products
Abstract
A high-precision and sensitive method for the determination of iodotyrosines in food has been developed. Me-trological characteristics of the method are presented. The lower limit of quantitative determination of LLOQ (1 ng/ ml), linearity of the calibration curve (1-2000 ng/ml), correlation coefficient (0.9994), accuracy and precision of the determination method were revealed. The identification of iodotyrosines was carried out by the retention time and the ratio of the peak areas of the ion-products in comparison with the standard samples. The effect of the matrix on the ionization of iodotyrosines has been studied. The degree of suppression of ionization by the matrix is from 0 to 50%.
линности йодированных молочных белков является подтверждение наличия йодированных аминокислот, в частности йодтирозинов, и определение степени их йодирования [4].
Наиболее информативными для этих целей являются методы тандемной жидкостной масс-спектрометрии (LC-MS/ MS), времяпролетной масс-спектроме-трии (ESI-TOF MS) и матрично-активи-рованной лазерной десорбции/ионизации (MALDI-TOF-TOF), позволяющие с высокой точностью определять структурные фрагменты, аминокислотную последовательность, посттрансляционные модификации белков и аминокислот, молекулярную массу белков в широком их диапазоне [7].
Экспериментальная часть
Ключевым этапом определения органического йода является ферментативное расщепление белковой части пробы ферментом (протеаза из Streptomyces griseus, Sigma Aldrich) и последующая очистка ультрацентрифугированием, идентификацию осуществляют методом обращё-но-фазовой хроматографии с классическим УФ-детектором поглощения.
Количественное определение в сложных пищевых матрицах (мясо-молочная продукция, хлебобулочная продукция, консервированные соки и др.) и биологических жидкостях требует применения техники тандемной жидкостной масс-спектрометрии. Так как определить содержание йодтирозинов после предварительного обогащения пищевого продукта йодированным белком не представляется возможным в виду низкой
* Работа выполнена на базе ФГБОУ ВО Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова в рамках гранта Российского Научного Фонда 19-76-10013 «Разработка и внедрение технологии производства и хранения экологически безопасной баранины, обогащенной эссенциальными микроэлементами».
Введение
Многочисленные исследования показали, что потребление продуктов с высоким содержанием неорганического йода может привести к негативным последствиям для человека [1]. Особенно значимые отрицательные явления наблюдаются при потреблении обогащённой йодидами или йодатами поваренной соли. Они обусловлены, прежде всего, слишком высокой, физиологически неадекватной скоростью поступления неорганического йода во внутреннюю среду организма и последующего его захвата клетками щитовидной железы. Это приводит к появлению в щитовидной железе локальных очагов гипертрофии и гиперплазии её клеток -тиреоцитов, что в дальнейшем может приводить к появлению тиреотоксикозов, ти-реоидитов, диффузного токсического зоба и даже к развитию опухолей щитовидной железы [2].
В организме человека и животных йод присутствует в виде неорганических соединений - йодидов и органических кова-лентно связанных форм - тиреоглобулина, йодированных аминокислот - монойод-тирозина и дийодтирозина, йодсодержа-щих (до 65% йода) гормонов - тироксина и трийодтиронина, а также промежуточных продуктов их метаболизма. В циркулирующей крови около 75% йода находится в виде органических соединений, а остальная часть представлена йо-дид-формой. Очевидно, что в обмене йода значительную роль играет органический йод [2].
Явление «органификации йода» происходит в щитовидной железе человека, где ежесекундно протекает фермента-
тивное связывание неорганического йода к аминокислотам белка - тиреоглобулина (йодирование). В результате реакции ароматического электрофильного замещения йодид (I-) встраивается в молекулу ароматической аминокислоты - тирозина, образуя прочную ковалентную связь с углеродом (С - I) [3].
Именно благодаря своей ковалент-но связанной форме, органический йод способен проявлять многообразные биологические свойства, в том числе через йодсодержащие гормоны - тироксин и трийодтиронин, участвующие в регуляции всех обменных процессов в организме человека. Кроме щитовидной железы процессы «органификации йода» в меньшей степени осуществляются в молочной и слюнных железах, а также других тканях и органах [4].
Йод, связанный химической ковалент-ной связью (по аминокислотным остаткам - тирозин, гистидин), легко орга-нифицируется и усваивается органами внутренней секреции (тиреоидной системой) [5]. В основе процесса получения органической формы йода лежит процесс ферментативного йодирования аминокислотных остатков сывороточных белков коровьего молока, с последующей дополнительной очисткой от неорганического йода с помощью ультрафильтрации, а также сублимационной и распылительной сушкой [6].
Контроль качества пищевых продуктов и биологических жидкостей на содержание «органического» йода требует использование методов хроматографии, тандемной масс-спектрометрии. Основными критериями доказательства под-
чувствительности УФ-детектора [8, 9]. В результате была разработана методика определения моно- и дийодтирозинов в пищевой продукции методом ВЭЖХ-МС/МС, в ходе работ над которой были выбраны оптимальные условия ферментативного гидролиза, изучена и установлена степень гидролиза и стабильность аналитического сигнала в сложных матрицах.
Приготовление градуировочных растворов
Стандартными образцами для идентификации и количественного определения выбраны коммерчески доступные стандартный образцы реактивов (3-йод-1_-ти-розин (МИТ) и 3,5-дийод-1_-тирозин (ДИТ), Sigma Aldrich). Для приготовления градуировочных растворов необходимо провести дериватизацию йодтирози-нов (МИТ и ДИТ). Для этого стандартные образцы растворяли до нужной концентрации в метаноле, с применением УЗИ бани (Branson 5510). Отбирали необходимый объём и упаривали на роторном испарителе (Heidolph Laborota 4003). Сухой остаток растворяли в смеси бу-танол - хлористый ацетил (4:1) и проводили термостатирование на водяной бане при температуре 60 °С в течение 15 мин. Смесь упаривали и перерастворяли в 20 % ацетонитриле в воде.
Подготовка проб к анализу
Подготовка проб включает в себя ферментативный гидролиз пищевого продукта, извлечение и очистку целевых веществ методом твёрдофазной экстракции (ТФЭ), с последующей дериватизаци-ей экстракта.
Перед проведением анализа пробу предварительно высушивают в сушильном шкафу при температуре 65-70 °С
Параметры и условия
и обезжиривают на аппарате Сокслета (Behr R106 S). Молоко и молочные продукты не нуждаются в предварительной подготовке. Навеску образца гидролизу-ют в буферном растворе Трис HCl (трис-(гидроксиметил)-аминометана, Scharlau) (pH 8,0), добавляя протеазу массой, составляющей 1/10 от массы белка пробы и термостатируют не менее 16 ч при температуре 37 °C. Гидролизат центрифугируют и фильтруют, после подвергают очистке методом твердофазной экстракции (ТФЭ). Патрон ТФЭ предварительно кондиционируют пропусканием последовательно 2 мл метанола и 2 мл биди-стиллированной воды. Отбирают 0,4 мл гидролизата пробы, приливают 0,1 мл ацетонитрила, смесь наносят на патрон. Экстракцию с патрона осуществляют в две стадии, последовательным элюи-рованием 1 мл метанола и 1,5 мл смеси ацетонитрил:0,1М соляная кислота (4:1,8), собирая смывы. Элюент упаривают досуха при 60 °С. После дериватизируют смесью бутанол: хлористый ацетил (4:1) подобно стандартным образцам и перерастворяют в 20 % ацетонитриле в воде.
Приведённые приёмы подготовки проб позволяют получить очищенную пробу для воспроизводимого анализа в сложных матрицах.
Условия анализа методом ВЭЖХ-МС/МС
Приборную идентификацию выполняли методом ВЭЖХ-МС/МС (Agilent Technologies 6410 Triple Quadrupole) в режиме мониторинга множественных реакций (MRM) после хроматографиче-ского разделения в установленных условиях на системе ВЭЖХ (Agilent Technologies 1200 series). Хроматографическое разделение гидролизата смеси после де-риватизации проводили методом обра-Таблица 1
ВЭЖХ
щёно-фазной хроматографии на колонке с фазой С18 (Agilent Eclipse XDB C18, 4,6 х 50 мм, 1,8 мкм) в условиях градиентного элюирования, представленных в таблице 1.
Для анализа подобраны следующие параметры масс-спектрометрического детектирования:
► Температура источника - 100 °С;
► Температура газа десольвации -
320 °С;
► Скорость потока газа десольвации -
8 л/мин;
► Давление иглы распылителя - 30 psi
(2.06842 Бар).
Условия регистрации аналитических сигналов в режиме мониторинга множественных реакций (MRM) представлены в таблице 2.
Приготовленные стандарты анализируются пятикратно, затем с помощью программного обеспечения Masshunt-er Quantitative Analysis (Version Build 4.0.225.0) по зависимости площадей MRM-переходов хроматографических пиков стандартных образцов исследуемого соединения от концентрации аналита строится калибровочная кривая. Идентификацию аналитов осуществляют по абсолютному времени удерживания хроматографических пиков целевых веществ, регистрируемых в режиме MRM. Нижний предел количественного определния (LOQ) по йодтирозинам (МИТ, ДИТ) составил 1 нг/мл. Линейный коэффициент корреляции был равен 0,9994 в диапазоне измерений йодтирозинов от 1 до 2000 нг/мл. Длительность приборной идентификации за счёт использования колонок с мелкозернистым сорбентом (1,8 мкм) не превышает 5 мин. Полученные хрома-тограммы стандартных образцов йодтирозинов и калибровочные кривые представлены на рисунках 1 и 2.
Время, Соотношение компонентов подвижной фазы Скорость потока, см3/мин t колонки,
мин Ацетонитрил, % 1 % муравьиная кислота, % °С
0,0 20 80 0,6 30
2,0 90 10 0,6 30
5,0
90
10
0,6
30
Таблица 2
Параметры воздействия на ионы в режиме MRM и условия ионизации распылением в электрическом поле (ESI) с регистрацией положительных ионов
Аналит Ион предшественник, m/z Дочерние ионы, /z Напряжение на фрагмен-торе (Frag), В Энергия диссоциации (CE), В
3-йод^-тирозин 364,0 134,9 112 30
(МИТ) 364,0 261,9 112 13
3,5-дийод^-тирозин 489,9 387,8 116 17
(ДИТ) 489,9 260,9 116 30
Рисунок 1.
Хроматограмма градуировочных растворов йодтирозинов (общий ионный ток и 1ШМ переходы МИТ и ДИТ)
2021 I № 5 ВСЁ О МЯСЕ
Рисунок 2. Калибровочные кривые градуировочных растворов йодтирозинов в диапазоне концентраций 1,0-2000,0 нг/мл
Заключение
Проблема создания, внедрения и промышленного выпуска йодсодержащих препаратов тесно связана с разработкой документов, нормирующих состав и структуру лекарственного соединения, качество носителей и вспомогательных веществ, а также условия и сроки хранения готовых лекарственных форм. Возникает необходимость в разработке чувствительных методов анализа органических полигалогенидов на различных этапах получения, в готовых лекарственных формах, БАДах и биообъектах. Необходимость контроля количественного содержания йодтирозинов обусловлена как технологическими факторами при произ-
водстве готовых продуктов, так и использованием в рецептуре все большего количества химических соединений при производстве пищевых продуктов, которые могут взаимодействовать с образованием новых веществ.
Для идентификации и оценки места включения йода в белки были использованы мягкий ферментативный гидролиз йодированного белка и анализ методами сопряжённой хроматографии и масс-спектрометрии. Установлено, что методы тандемной хромато-масс-спек-трометрии в целях контроля качества обогащённой продукции (после внесения функциональных добавок, содержащих йодированные молочные белки) по-
зволяют достоверно идентифицировать форму «органического» йода и контролировать её количество (в виде йодтирозинов) в пищевых продуктах в широком динамическом диапазоне содержания.
© КОНТАКТЫ:
Гиро Татьяна Михайловна а girotm@sgau.ru Куликовский Андрей Владимирович а a.kulikovskii@fncps.ru V +7(495)676-79-61 Князева Александра Сергеевна а a.knyazeva@fncps.ru Утьянов Дмитрий Александрович а d.utyanov@fncps.ru Гиро Анна Валерьевна а giroannasgau@gmail.com
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ: REFERENCES:
1. Герасимов, Г.А. Иододефицитные заболевания (ИДЗ) в Российской Федерации: поли- Gerasimov, G.A. Yododefitsitnyye zabolevaniya (YDZ) v Rossiyskoy Federatsii: politika v oblasti pro-тика в области профилактики и тенденции в эпидемиологической ситуации (1950- filaktiki i tendentsii v epidemiologicheskoy situatsii (1950-2002 g.) [Iodine deficiency diseases (IDD) in 2002 г.) / Г.А. Герамимов. - Москва, 2003. - 50 с. the Russian Federation: prevention policy and trends in the epidemiological situation (1950-2002)] /
G.A. Geramimov. - Moskva, 2003. - 50 р.
2. Мохнач, В.О. Теоретические основы биологического действия галоидных соединений / Mokhnach, V.O. Teoreticheskiye osnovy biologicheskogo deystviya galoidnykh soyedineniy [Theoretical В.О. Мохнач. - Ленинград, 1968. - 279 с. foundations of biological action of halide compounds] / V.O. Mokhnach. - Leningrad, 1968. - 279 p.
3. Внутренние болезни. В 10 книгах. Книга 9: Пер. с англ./Под ред. Е. Браунвальда, Vnutrenniye bolezni. V 10 knigakh [Internal illnesses. In 10 books]. Kniga 9: Per. s angl./Pod red. К. Дж. Иссельбахера, Р.Г. Петерсдорфа и др. - Москва: Медицина, 1997. - 464 с. Ye. Braunval'da, K. Dzh. Issel'bakhera, R.G. Petersdorfa i dr. - Moskva: Meditsina, 1997. - 464 c.
4. Савчик, С.А. Изучение свойств йодированных белков, предназначенных для профилак- Savchik, S.A. Izucheniye svoystv yodirovannykh belkov, prednaznachennykh dlya profilaktiki yododefitsit-тики йододефицитных заболеваний / С.А. Савчик, Г.Ф. Жукова, С.Л. Люблинский // Во- nykh zabolevaniy [Study of the properties of iodinated proteins intended for the prevention of iodine defi-просы питания. - 2005. - № 4. - С. 3-8. ciency diseases] / S.A. Savchik, G.F. Zhukova, S.L. Lyublinskiy // Voprosy pitaniya. - 2005. - № 4. - Р. 3-8.
5. Ребров, В.Г. Витамины, макро- и микроэлементы / В.Г. Ребров О.А. Громова. - М.: Ге- Rebrov, V.G. Vitaminy, makro- i mikroelementy [Vitamins, macro- and microelements] / V.G. Re-отарМед, 2008. - 957 с. brov O.A. Gromova. - M.: GeotarMed, 2008. - 957 р.
6. Томчани, О.В. Разработка технологий йодказеина и молочных продуктов, обогащенных Tomchani, O.V. Razrabotka tekhnologiy yodkazeina i molochnykh produktov, obogashchonnykh yodirovan-йодированным белком. Диссертация на соискание учёной степени канд. техн. наук. - nym belkom [Development of technologies for iodcasein and dairy products enriched with iodized protein]. Обнинск, 2002. - 152 с. Dissertatsiya na soiskaniye uchonoy stepeni kand. tekhn. nauk. - Obninsk, 2002. - 152 р.
7. Чернецова, Е.С. Использование высокоэффективной жидкостной хроматографии в со- Chernetsova, Ye.S. Ispol'zovaniye vysokoeffektivnoy zhidkostnoy khromatografii v sochetanii s четании с масс-спектрометрией для исследования новых лекарственных веществ / mass-spektrometriyey dlya issledovaniya novykh lekarstvennykh veshchestv [The use of high perfor-Е.С. Чернецова, А.Г. Корякова // Масс-спектрометрия. - 2010. - № 7 (2). - С. 101-112. mance liquid chromatography in combination with mass spectrometry for the study of new drugs] /
Ye.S. Chernetsova, A.G. Koryakova // Mass-spektrometriya. - 2010. - № 7 (2). - Р. 101-112.
8. Vieja, A. Identification and quantitation of iodotyrosines and iodothyronines in proteins using HPLC / A. Vieja, M. Calero, P. Santisteban, L. Lamas // J. Chromatogr. - 1997. - V. 688. - P. 143-149.
9. Comprehensive Handbook of Iodine. Determination of Iodine In Vivo and In Vitro by X-Ray Fluorescence Analysis: Methodology and Applications. Elsevier Inc., 2009. - P. 29-37.
